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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):180-186
毕赤酵母（Pichia pastoris）是重要的外源蛋白
真核表达系统［1］，但目前仍有许多外源蛋白难以在
毕赤酵母中高效表达［2-4］。一些提高外源蛋白表达
量的方法，如优化外源基因密码子、增加外源基因
拷贝数、与高表达蛋白融合及优化发酵条件等［5-7］，
虽然对表达量有所改善，但效果仍很不理想。近年
收稿日期 ： 2015-05-08
基金项目 ：国家转基因生物新品种培育重大科技专项（2014ZX08005-004）
作者简介 ：王楠，女，博士，研究方向 ：微生物和植物生物反应器 ；E-mail ：fanduibaquan@sina.com
通讯作者 ：刘德虎，男，博士，研究员，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：liudehu2006@126.com
毕赤酵母 Kar2p 过表达对假黑盘菌素表达量的影响
王楠  李刚强  郭文芳  刘德虎
（中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）
摘 要 ： Kar2p 是一种分子伴侣蛋白，为研究其对外源蛋白在毕赤酵母中表达的影响，从毕赤酵母菌株 GS115 中克隆出编码
该蛋白的基因，利用其对毕赤酵母转化子 P-Ple 进行二次转化，获得了能够同时过表达假黑盘菌素和 Kar2p 的二次转化子 P-PleKar；
采用荧光定量 PCR 方法，对 P-Ple 和 P-PleKar 两个转化子中的 Kar2p 转录水平进行了测定发现，在 P-PleKar 中 Kar2p 的转录水平
比 P-Ple 上调了约 18 倍。对 P-Ple 和 P-PleKar 两个转化子的生长曲线进行比较，发现 Kar2p 过表达对宿主细胞的生长无明显影响，
但对外源蛋白假黑盘菌素的表达确实产生了一定的抑制作用，受 Kar2p 的影响，在诱导培养 48 h 时，假黑盘菌素的最高抑菌活性
明显降低。这种抑制表达不单针对假黑盘菌素，对毕赤酵母的蛋白酶表达和分泌也同样起到了一定的抑制作用，具体表现在分泌
到培养液中的假黑盘菌素在发酵后期仍然能保持较高抑菌活性，没有被发酵液中的累积的蛋白酶快速降解。与 P-Ple 相比，P-PleKar
假黑盘菌素的表达量虽略有降低，但可以维持更长时间的稳定表达。
关键词 ： Kar2p ；假黑盘菌素 ；毕赤酵母 ；二次转化 ；重组表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.001
The Effect of Kar2p Overexpression on Plectasin Expression in Pichia
pastoris
WANG Nan LI Gang-qiang GUO Wen-fan LIU De-hu
（Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract: Kar2p is one of the molecular chaperones. In order to investigate its effect on expression of heterologous proteins in Pichia
pastoris, the gene encoding the protein was cloned from P. pastoris GS115 and transformed into the P. pastoris transformant P-Ple. The twice
transformant P-PleKar that simultaneously over-expressed plectasin and Kar2p was obtained. The transcription levels of Kar2p in P-Ple and
P-PleKar were analyzed by real-time PCR. Kar2p transcription in P-PleKar was up-regulated about 18 folds as in P-Ple. Comparing the growth
curves between P-Ple and P-PleKar, the overexpression of Kar2p had no effect on cell growth of host, but inhibited the expression of heterologous
protein plectasin. Duo to the Kar2p’s effect, the highest antibacterial activity of plectasin significantly decreased at the 48 h of induction. This
did not only inhibit the expression of plectasin, but also the expression and secretion of protease in P. pastoris. It was evidenced that plectasin
secreted into the culture medium maintained high antibacterial activity in the last stage of fermentation, and were not rapidly degraded by
protease accumulated in culture. Compared with P-Ple, the overexpression of Kar2p slightly reduced the expression level of plectasin in P-PleKar,
but kept the expression level stable for a longer time.
Key words: Kar2p ；plectasin ；Pichia pastoris ；transformation ；expression
2016,32(1) 181王楠等：毕赤酵母 Kar2p 过表达对假黑盘菌素表达量的影响
来的研究发现，影响外源蛋白在毕赤酵母中分泌表
达的限速步骤与内质网密切相关［8］。内质网是分泌
型蛋白及某些胞内蛋白完成翻译、翻译后修饰、转
运等过程的第一个重要场所，多种定位于内质网的
分子伴侣参与这一过程。未完成正确折叠的外源
多肽会对内质网造成压力，并激活 UPR（unfolded
protein response）、ERAD（ER-associated degradation）
及 ER 自噬（ER-phagy）等途径［9］，具体表现为很
多分子伴侣的表达水平发生明显的改变。外源多肽
在分子伴侣的帮助下进行重新折叠、或被分子伴侣
引导进入降解途径，因此，定位于内质网的各种分
子伴侣在外源蛋白向胞外分泌过程中起着非常重要
的作用。
Kar2p 是 Hsp70 家族的分子伴侣，由 karyogamy
基因编码［10，11］，定位在所有真核细胞内质网，在内
质网压力监控体系中起重要作用［12］。有证据表明，
Kar2p 能够与新合成的多肽结合［13，14］，防止它们在
内质网聚集和沉淀，也阻止错误折叠的多肽离开内
质网，并引导其进入降解途径［15，16］，另外，Kar2p
还帮助蛋白从内质网向细胞膜的转运［17］。但 Kar2p
如何辨别多肽链折叠错误，目前尚不清楚。
在 酿 酒 酵 母（Saccharomyces cerevisiae） 中，
Kar2p 的过表达可以提高牛凝乳酶［18］、水蛭素［19］
的表达量，但对植物甜蛋白的表达却无明显作用［18］，
在汉逊酵母（Hansenula polymorpha）中，Kar2p 的过
表达反而导致米曲霉葡萄糖氧化酶（Aspergillus niger
glucose oxidase，GOX）的表达量下降 10 倍［20］。在
毕赤酵母中，外源蛋白 Anti-CD3 immunotoxin 能够
促进 Kar2p 的过表达，部分 Kar2p 甚至会被分泌到
胞外［21］。Kar2p 的功能目前尚无确切定论，本研究
尝试以表达假黑盘菌素的重组毕赤酵母为研究对象，
通过过表达 Kar2p 以便分析它对假黑盘菌素分泌表
达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
毕赤酵母菌株 GS115、表达载体 pPIC9k 购自
Life Technologies，大肠杆菌 top10 感受态、克隆载
体 pEASY-T、DNA 凝胶回收试剂盒购自北京全式金
生物技术有限公司，DNA 限制性内切酶、连接酶及
DNA 修饰酶购自 NEB，酵母总 RNA 提取试剂盒购
自原平皓生物技术有限公司，RT-PCR 试剂盒、荧
光定量 PCR 试剂盒购自 TaKaRa 公司，假黑盘菌素
成熟多肽基因的合成由北京英茂盛业生物科技有限
公司完成，DNA 测序由农作物基因资源与基因改
良国家重大科学工程开放实验室完成，溶壁微球菌
（Micrococcus lysodeikticus）购自中国普通微生物菌
种保藏管理中心，所有生化试剂购自北京化学试剂
商店。
1.2 方法
1.2.1 假黑盘菌素表达载体的构建 根据已公布
的毕赤酵母甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶组成型启动子
pGAP DNA 序 列（GenBank U62648.1） 合 成 上 下 游
引 物 G-F ：5-TAGAGCTCTTTTTTGTAGAAATGTC-
TTGGTGT-3 和 G-R ：5-TAGGATCCTGTGTTTTG-
ATAGTTGTTCAATTG-3， 以 毕 赤 酵 母 基 因 组 DNA
为模板，扩增 pGAP，扩增条件 ：94℃预变性 2 min，
94℃变性 30 s，55℃退火 40 s，72℃延伸 1 min，30
个循环，72℃延伸 10 min。扩增产物连接到 T 载体内，
转化大肠杆菌 top10，挑取阳性克隆并测序正确后，
用 Sac Ⅰ和 BamH Ⅰ双酶切将 pGAP 从 T 载体切下，
与 经 同 样 双 酶 切 的 pPIC9K 质 粒 连 接， 得 到 质 粒
9K-G。
假黑盘菌素成熟多肽基因用 Xho Ⅰ和 Not Ⅰ从
中间载体切下，然后与同样酶切的 9K-G 质粒连接，
得到表达载体 mp-9KG。为便于后续的二次转化，将
载体 mp-9KG 经 Xma Ⅰ酶切，然后用 T4 DNA 聚合
酶补平后自连，得到卡那霉素（G418）抗性基因缺
陷型表达载体 mp-9KGH。
1.2.2 Kar2p 基因的克隆与表达载体的构建 酵母
总 RNA 的提取以及 RNA 反转录成 cDNA 完全参照
试剂盒说明书，根据已知 Kar2p 基因序列（GenBank：
U62648.1），合成上下游引物 ：Kar-F ：GGATCCAA
ACGATGCTGTCGTTAAAACCATCTTGGC 及 Kar-R ：
GCGGCCGCCTACAACTCATCATGATCATAGTC。以
cDNA 为 模 板， 经 RT-PCR 扩 增 得 到 Kar2p 基 因，
将其 T 载体后得到中间质粒 Kar-T，转化大肠杆菌
top10，挑取阳性克隆并测序正确后，用 BamH Ⅰ和
Not Ⅰ酶切回收 Kar2p 基因片段，与经同样酶切的
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pPIC9k 载体连接，得到表达载体 Kar-9K。
1.2.3 毕赤酵母的转化和筛选 毕赤酵母的转化参
照产品说明书，将载体 mp-9KGH 经 Sal Ⅰ线性化，
电击转化至菌株 GS115 感受态中，涂布于 RDB（1
mol/L sorbitol，2% dextrose，1.34% YNB，4×10-5%
biotin，0.005% amino acids，2% agar） 平 板，28℃
静置 2-3 d，至菌落长出。随机挑取单菌落，接种
于 5 mL YPDD（1% yeast extract，2% peptone，2%
dextrose）培养基中，28℃ 200 r/min 震荡培养 3 d，
离心收集发酵液上清进行抑菌实验，随机选取一株
具有抑菌活性的转化子，命名为 P-Ple 并用于后续
实验。
载体 Kar-9K 经 Bgl Ⅱ线性化后，按照上述转化
方法，对 P-Ple 进行再次转化，将转化液涂布于含
有 0.1-2 mg/mL G418 的 YPDD 固体平板上，28℃静
置 2-3 d，至菌落长出。随机挑取单菌落，接种于
含有 0.5 mg/mL G418 的 5 mL YPDD 培养基中，28℃
200 r/min 震荡培养 3 d，提取转化子基因组 DNA 为
模板进行 PCR 检测（上下游引物分别为 ：AOX-F ：
GACTGGTTCCAATTGACAAGC ；3 端 引 物 AOX-R ：
GGCAAAT GGCATTCTGACATCCTC）， 验 证 Kar2p
基因是否已整合到 P-Ple 基因组中。随机选取一株
PCR 阳性转化子，命名为 P-PleKar 并用于后续实验。
1.2.4 荧 光 定 量 PCR 测 定 Kar2p 的 转 录 水 平 分
别挑取 P-Ple 和 P-PleKar 两个转化子的单菌落，接
种于 5 mL YPDD 培养基中，28℃ 200 r/min 震荡培
养 24 h，再按照 1% 接种量转接至 5 mL YPDD 培养
基中，28℃震荡培养 24 h，取 2 mL 菌液收集菌体，
按照试剂盒说明书方法，提取总 RNA，反转录成
cDNA ；其余菌液离心收集菌体，重悬至 3 mL YPDM
（1% yeast extract，2% peptone，0.5% methanol）培养
基中，28℃ 200 r/min 震荡培养 24 h，取 2 mL 菌液
收 集 菌 体， 提 取 总 RNA， 反 转 录 成 cDNA。 分 别
以上述甲醇诱导前和诱导后的 cDNA 为模板，以
kar-qF ：CTACTTCAACGACGCTCAA 和 kar-qR ：
CCACCCTCAATAGAAAGCAGA 为上下游引物，荧光
定量 PCR（按照试剂盒说明书）测定 Kar2p 的转录
水平，以持家基因 AOX2 为内参，所用的上下游引
物 分 别 为 ：AOX-qF ：GACTCTGATGAGGGGCACAT
和 AOX-qR ：TTGGAAACTCCCAACTGTCC。
1.2.5 毕赤酵母菌体生长量测定 分别挑取 P-Ple 和
P-PleKar 两个转化子的单菌落，接种于 5 mL YPDD
培养基中，28℃ 200 r/min 震荡培养 24 h，再按照 1%
接种量接种至 50 mL YPDD 培养基中，28℃ 200 r/min
震荡培养 24 h，5 000 r/min 离心 5 min，收集菌体，
分别将两个转化子的菌体重悬于 YPDM 培养基中，
并用 YPDM 培养基调节 OD600 至一致，28℃ 200 r/min
震荡培养，每隔 24 h，测定 OD600，并补加 0.5% 的
甲醇，绘制生长曲线。
1.2.6 假黑盘菌素的表达与抗菌活性测定 将溶壁
微球菌接种至 2 mL 液体 LB 培养基中，37℃ 200 r/min
震荡培养过夜，取 5 μL 于 200 mL 的 45℃融化状态
的固体 LB 培养基中，混匀倒平板，待凝固后用直
径为 5 mm 的打孔器在固体培养基上打孔，将 50 μL
待测发酵液加入孔中，37℃静置过夜，观察并测量
抑菌圈直径。
2 结果
2.1 表达载体的构建
载 体 mp-9KGH 已 携 带 假 黑 盘 菌 素 基 因， 在
pGAP 启动子调控下，可组成型分泌表达假黑盘菌素
重组蛋白。在该载体中，卡那霉素（Kanamycin）抗
性基因被移码突变，转化酵母细胞后转化子不具有
G418 抗性，但能以 HIS4 缺陷型作为选择标记。载
体 Kar-9K 携带 Kar2p 基因，在乙醇氧化酶诱导型启
动子 pAOX1 调控下，可胞内表达 Kar2p 伴侣蛋白，
在该载体中，含有卡那霉素抗性基因，酵母转化子
具有 G418 抗性，可作为转化子筛选标记（图 1）。
载 体 mp-9KGH 经 Sac Ⅰ 和 Not Ⅰ 双 酶 切， 以
同样双酶切的 9K-G 质粒作为阴性对照，载体 mp-
9KGH 因携带有假黑盘菌素成熟蛋白基因，可切下
一个约 900 bp 的 DNA 片段，略大于 9K-G 质粒切
下的 DNA 片段（图 2 中泳道 1 和 2），与预期的结
果相一致。Kar-9K 经 BamH Ⅰ和 Not Ⅰ双酶切，可
切下一个约 2 kb 的 DNA 片段，比以同样双酶切的
pPIC9k 切下的 DNA 片段要大很多（图 2 中的泳道 3
和 4），证实 mp-9KGH 和 Kar-9K 载体构建正确。
2.2 毕赤酵母的转化和筛选
载体 mp-9KGH 经 Sal Ⅰ线性化，电转化至毕赤
酵母菌株 GS115 中，经组氨酸缺陷型培养基筛选和
2016,32(1) 183王楠等：毕赤酵母 Kar2p 过表达对假黑盘菌素表达量的影响
PCR 验证，获得阳性酵母转化子 P-Ple。利用 P-Ple
发酵液上清进行体外抑菌实验，发现该发酵上清能
够在溶壁微球菌固体平板上产生明显的抑菌圈。
P-Ple 对 G418 不再具有抗性，因此以 G418 为
筛选压，利用 Kar-9K 可对 P-Ple 进行二次转化，将
转化菌液等量涂布于含不同浓度 G418 的 YPDD 平
板上，28℃培养 48 h。如图 3 所示，当 G418 浓度为 0.1
mg/mL 时，背景菌布满平板，表明 G418 浓度太低无
筛选作用 ；当 G418 浓度高于 1.0 mg/mL 时，平板上
无菌落长出，表明 G418 浓度过高，转化子无法生长；
当 G418 浓度为 0.5 mg/mL 时，平板上产生了一定数
量的单菌落，从中随机挑取 10 个单菌落进行菌落
PCR 检测，发现它们均携带有 Kar2p 基因。利用这
10 株转化子发酵液上清进行体外抑菌实验，发现其
中 9 株都能产生抑菌圈，只有一株无抑菌活性，可
能是由于二次转化导致假黑盘菌素基因丢失。从 9
株具有抑菌活性的转化子中随机选取一株，命名为
P-PleKar，连续转接 3 代，发酵液上清抑菌活性没有
改变，表明外源基因可稳定遗传。
Bgl II
Kanamycin
HIS4
TTKar-9K10 kb Not IKAR2BamH IpAOX1Bgl IIXma I Sal IHIS4
TT
mp-9KGH
~9.5 kb
Not I
Xho I
plectasin
α-Factor
BamH I
pGAP
Bgl II
图 1 表达载体 mp-9KGH 和 Kar-9K 结构示意图
M ：DNA marker ；1 ：mp-9KGH 经 Sac I 和 Not I 双酶切 ；2 ：9K-G 经 Sac I 和
Not I 双酶切 ；3 ：Kar-9K 经 BamH I 和 Not I 双酶切 ；4 ：pPIC9k 经 BamH I
和 Not I
图 2 mp-9KGH 和 Kar-9K 的酶切鉴定
bp
2000
1500
1000
200
M 1 2 3 4
A B
C D
A ：0.1 mg/mL G418 ；B ：0.5 mg/mL G418 ；C ：1.0 mg/mL G418 ；
D ：2.0 mg/mL G418
图 3 Kar-9K 二次转化的 G418 抗性筛选
2.3 Kar2p转录水平的测定
为研究 P-PleKar 中 KAR2 基因能否在细胞内诱
导 表 达， 利 用 荧 光 定 量 PCR（Applied Biosystems®
7500 Real-Time PCR Systems）检测了 P-Ple 和 P-Ple-
Kar 两种转化子中 KAR2 基因的转录水平，扩增曲
线在合理的范围内（图 4-A）。以 P-Ple 中 KAR2 基
因的转录水平为对照，计算 P-PleKar 中 KAR2 基因
的相对转录水平。研究发现，在甲醇诱导前（诱导
0 h），P-Ple 和 P-PleKar 中 KAR2 的转录水平相当，
在甲醇诱导 24 h 后，P-PleKar 中 KAR2 的转录水平
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1184
达到 P-Ple 的 18 倍，表明 Kar2p 已经在 P-PleKar 中
过表达（图 4-B）。
2.5 Kar2p的过表达对假黑盘菌素表达量的影响
分别对 P-Ple 和 P-PleKar 两个转化子发酵液上
清进行抑菌活性测定，测量抑菌圈直径（图 6），以
直径的长度为纵坐标，以发酵时间为横坐标绘制线
性图（图 7），发现 P-Ple 发酵液在甲醇诱导 48 h 时，
抑菌圈直径达到 2.6 cm，表明此发酵液中的假黑盘
菌素浓度最高（图 6 下孔 3），但随着诱导培养时间
的延长，其抑菌活性逐渐降低，当诱导培养至 120 h
时，抑菌圈完全消失，这表明此时发酵液中的假黑
盘菌素浓度最低。
P-PleKar 发酵液上清抑菌活性随时间的变化与
P-Ple 不同，在诱导培养 48 h 时，抑菌圈直径也达
图 5 Kar2p 的过表达对宿主的细胞生长的影响
图 4 qPCR 扩增图谱（A）及 qPCR 测定 Kar2p 的相对转
录水平（B）
图 7 P-PleKar 和 P-Ple 发酵液抑菌圈直径相对于发酵时间
的变化
0
5
10
15
20
25
0h 24h
P-Ple
P-PleKar
K
ar
2p
สഐⲴ⴨ሩ䖜ᖅ≤ᒣ0.1F 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22Cycle 24 26 28 30 32 34 36 38 40
1
Amplification Plot
A
B
2.4 Kar2p的过表达对毕赤酵母菌体生长的影响
为研究 Kar2p 过表达对宿主细胞生长的影响，
测定了各转化子的生长曲线（图 5）。发现随着诱导
时间延长，P-Ple 和 P-PleKar 两种转化子生长曲线基
本吻合，表明 Kar2p 过表达对宿主细胞生长无明显
影响。
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 24 48 72 96 120䈡ሬᰦ䰤hOD 600 P-PleP-PleKar
3
P-Ple
4 5 621
3
P-PleKar
4 5 621
1-6 ：分别为甲醇诱导 0、24、48、72、96 及 120 h 的发酵液上清抑菌圈
图 6 P-PleKar 和 P-Ple 发酵液在溶壁微球菌平板上产生的
抑菌圈
0
1
2
3
0 24 48 72 96 120䈡ሬᰦ䰤hᣁ㧼സⴤᖴcm P-PleP-PleKar
2016,32(1) 185王楠等：毕赤酵母 Kar2p 过表达对假黑盘菌素表达量的影响
到最大值。但仅有 2.1 cm，远低于 P-Ple 的 2.6 cm
（图 6 上孔 3），随着培养时间延长至 96 h，抑菌圈
直径仍保持不变，表明发酵液中的假黑盘菌素较稳
定，能始终维持最大浓度，而 P-Ple 则变化比较大，
在培养后期，发酵液中的假黑盘菌素浓度快速下降。
该结果表明，Kar2p 过表达对发酵液中的假黑盘菌
素浓度产生了影响，这种变化既涉及假黑盘菌素表
达量的改变也涉及假黑盘菌素的胞外降解过程。
3 讨论
为进一步了解分子伴侣 Kar2p 的功能，本研究
克隆了毕赤酵母 GS115 菌株的 Kar2p 基因，通过二
次转化，探索 Kar2p 如何影响假黑盘菌素在毕赤酵
母中的表达。结果发现，Kar2p 的过表达对宿主细
胞的生长无明显影响，即酵母细胞的生长与死亡速
率在二次转化前后无明显变化，但对外源蛋白假黑
盘菌素的表达确实产生了一定的抑制作用，受 Kar2p
的影响，在诱导培养 48 h 时，假黑盘菌素的最高抑
菌活性降低。这种抑制表达不单单针对假黑盘菌素，
对毕赤酵母自身的蛋白酶表达和分泌也同样起到了
一定的抑制作用，具体表现在分泌到培养液中的假
黑盘菌素在发酵后期仍然能保持较高抑菌活性，而
没有被发酵液中的累积的蛋白酶快速降解。酵母细
胞具有严密的蛋白质合成质量控制系统［22］，内质网
相关的质量控制系统对分泌蛋白的合成起到关键作
用［23］。Kar2p 是内质网质量控制系统的感受器［12］。
因此可以推测，本研究中 Kar2p 的过表达将激活内
质网的 UPR 途径，细胞中物质和能量代谢将优先投
入到多种分子伴侣的上调表达中，外源蛋白假黑盘
菌素和宿主细胞蛋白酶等其它蛋白分子的表达量则
下调，这样既不影响细胞的正常生长，又降低了物
质和能量的消耗。而有关假黑盘菌素和蛋白酶表达
下调的具体分子机制本研究室将做进一步研究。
本研究使用的二次转化方法，利用了同一表达
载体的两个不同筛选标记，通过移码突变，造成宿
主细胞原卡那霉素抗性基因丧失，方便对其进行二
次转化和筛选转化子。该方法无需另外插入其它抗
性基因，排除了两个转化子中假黑盘菌素基因拷贝
数的差异，使两个转化子的目标蛋白表达量具有可
比性。此方法操作简便，节省资源，是一种可以广
泛使用的二次转化方法。
除 Kar2p 外，毕赤酵母的分子伴侣蛋白还有很
多种，它们对外源蛋白的表达和分泌也起着到非常
重要的作用，采用类似的方法，可对它们的功能逐
一鉴定，这对于最终弄清毕赤酵母的外源蛋白分子
表达机制是十分有益的。
4 结论
本研究克隆了毕赤酵母菌株 GS115 的 Kar2p 基
因，并将 Kar2p 基因二次转化至假黑盘菌素的毕赤
酵母表达菌株中，采用 0.5 mg/mL G418 作为筛选压，
获得了二次转化子 P-PleKar，P-PleKar 中 Kar2p 基
因的转录水平是 P-Ple 的 18 倍，Kar2p 的过表达对
宿主细胞的生长无明显影响，但在最高表达量略有
降低的同时，可以维持假黑盘菌素更长时间的稳定
表达。
参 考 文 献
［1］ Schaeffer S, Piontek M, Ahn SJ, et al. Recombinant hepatitis B
vaccines-characterization of the viral disease and vaccine production
in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha［M］//
Dembrowsky K, Stadler P. Novel Therapeutic Proteins. New York ：
VCH-Weinheim, 2001 ：245-273.
［2］ Gellissen G. Heterologous protein production in methylotrophic
yeast［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2000, 54 ：
741-750.
［3］ Sue MP, Mariana LF, Brian M, et al. Heterologous protein production
using the Pichia pastoris expression system［J］. Yeast, 2005, 22 ：
249-270.
［4］ Porro D, Sauer M, Branduardi P, et al. Recombinant protein
production in yeasts［J］. Molecular Biotechnology, 2005, 31 ：
245-259.
［5］ Hohenblum H, Gasser B, Maurer M, et al. Effects of gene dosage,
promoters, and substrates on unfolded protein stress of recombinant
Pichia pastoris［J］. Biotechnology and Bioengineering, 2004, 85
（4）：367-75.
［6］ Resina D, Maurer M, Cos O, et al. Engineering of bottlenecks in
Rhizopus oryzae lipase production in Pichia pastoris using the
nitrogensource-regulated FLD1 promoter［J］. New Biotechnology,
2009, 25（6）：396-403.
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1186
［7］ Marx H, Mecklenbräuker A, Gasser B, et al. Directed gene copy
number amplification in Pichia pastoris by vector integration into the
ribosomal DNA locus［J］. FEMS Yeast Research, 2009, 9（8）：
1260-1270.
［8］ Smith MH, Ploegh HL, Weissman J S. Road to ruin ：targeting
proteins for degradation in the endoplasmic reticulum［J］. Science,
2011, 25, 334（6059）：1086-1090.
［9］ Gasser B, Saloheimo M, Rinas U, et al. Protein folding and conform-
ational stress in microbial cells producing recombinant proteins ：a
host comparative overview［J］. Microbial Cell Factories, 2008, 4
（7）：11-29.
［10］ Rose MD, Misra LM, Vogel JP. KAR2, a karyogamy gene, is the
yeast homolog of the mammalian BiP/GRP78 gene［J］. Cell,
1989, 57（7）：1211-1221.
［11］ Normington K, Kohno K, Kozutsumi Y, et al. S. cerevisiae encodes
an essential protein homologous in sequence and function to
mammalian BiP［J］. Cell, 1989, 57 ：1223-1236.
［12］ Gething MJ, Sambrook J. Protein folding in the cell［J］. Nature,
1992, 355 ：33-45.
［13］ Dorner A, Kaufman R. The levels of endoplasmic reticulum proteins
and ATP affect folding and secretion of selective proteins［J］.
Biologicals, 1994, 22（2）：103-112.
［14］ Xu CL, Wang S, Thibault G, et al. Futile protein folding cycles in
the ER are terminated by the unfolded protein O-mannosylationpat-
hway［J］. 2013, 340（6135）：978-981.
［15］ Nishikawa S, Fewell S, Kato Y, et al. Molecular chaperones
in the yeast endoplasmic reticulum maintain the solubility of
proteins for retrotranslocation and degradation［J］. The Journal
of Cell Biology, 2001, 153（5）：1061-1070.
［16］ Young BP, Craven RA, Reid PJ, et al. Sec63p and Kar2p are
required for the translocation of SRP-dependent precursors into
the yeast endoplasmic reticulum in vivo［J］. The EMBO Journal,
2001, 20 ：262-271.
［17］ Lyman SK, Schekman R. Binding of secretory precursor
polypeptides to a translocon subcomplex is regulated by BiP［J］.
Cell, 1997, 88 ：85-96.
［18］ Harmsen MM, Bruyne MI, Raue H A, et al. Overexpression of
binding protein and disruption of the PMR1 gene synergistically
stimulate secretion of bovine prochymosin but not plant thaumatin
in yeast［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 1996, 46 ：
365-370.
［19］ Kim MD, Han KC, Kang HA, et al. Coexpression of BiP increased
antithrombotic hirudin production in recombinant Saccharomyces
cerevisiae［J］. Journal of Biotechnology, 2003, 101 ：81-87.
［20］ Smith JD, Tang BC, Robinson AS. Protein disulfide isomerase,
but not binding protein, overexpression enhances secretion of a
non-disulfide-bonded protein in yeast［J］. Biotechnology and
Bioengineering, 2004, 85 ：340-345.
［21］ Liu YY, Woo JH, Neville DM Jr. Overexpression of an anti-CD3
immunotoxin increases expression and secretion of molecular
chaperone BiP/Kar2p by Pichia pastoris［J］. Applied and
Environmental Microbiology, 2005, 71（9）：5332-5340.
［22］ Monica CR, Ramanujan SH. Design principles of protein biosynth-
esis-coupled quality control［J］. Developmental Cell, 2012, 23
（5）：896-907.
［23］ Hery U, Estefanie D, Fernanda L, et al. When ER stress reaches a
dead end［J］. Biochimica et Biophysica acta, 2013, 1833 ：3507-
3517.
（责任编辑　李楠）