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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
自从 1975 年杂交瘤技术创建以来，单克隆抗体
对于免疫学、检验医学、抗独特型疫苗、生物导弹
治疗、食品及农产品检验等多领域的发展都起到重
要的推动作用。但目前大多数实验室制备单克隆抗
体沿用腹腔注射、有限稀释等常规方法，耗时、费力，
不适合大规模操作制备单抗。国内外均有报道快速
制备单克隆抗体的方法［1-4］如体外免疫使用细胞因
收稿日期 ：2013-02-19
作者简介 ：任瑞敏，女，硕士，研究方向 ：生物制药 ；E-mail ：biorrm@126.com
通讯作者 ：王云龙，男，教授，研究方向 ：生物制药 ；E-mail ：biowyl@126.com
利用改良后的脾内免疫和半固体培养基法
制备单克隆抗体
任瑞敏1  王云龙1，2  张怡青4  李恒思3  王国强3  李玉林3  王继创3
（1. 郑州大学生物工程系，郑州 450001 ；2. 郑州职业技术学院，郑州 450121 ；3. 河南省生物工程技术研究中心，郑州 450001 ；
4. 河南师范大学生命科学学院，新乡 453003）
摘 要 ： 旨在利用改良后的脾内免疫和半固体培养基法制备单克隆抗体，节约免疫原用量、简化试验操作、一步法筛选和
克隆杂交瘤细胞、缩短单抗制备周期。通过局部麻醉小鼠脾脏区域皮肤，切开后透过腹膜直接向脾脏内注射微量抗原，使小鼠的
脾细胞在短时间内产生免疫反应，尾静脉注射强化免疫后进行细胞融合 ；选取半固体培养基（甲基纤维素、软琼脂）法，以有限
稀释法作对照筛选分泌高效价抗体的杂交瘤细胞。结果显示，与传统的单抗制备方法相比，改进后的脾内免疫操作更简单，联合
尾静脉注射，使用微量免疫原在短时间内产生高效价抗体 ；半固体培养基甲基纤维素浓度在 1.1% 条件下，获得克隆团较多，阳性
率较高。本研究方法适用于大规模制备单克隆抗体。
关键词 ： 脾内免疫 软琼脂培养法 甲基纤维素法
The Improved Intrasplenic Immunization and Semi-solid Medium to
Prepare Monoclonal Antibody
Ren Ruimin1 Wang Yunlong1，2 Zhang Yiqing4 Li Hengsi3 Wang Guoqiang3 Li Yulin3 Wang Jichuang3
（1. Biological Engineering Department，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 ；2. Zhengzhou Technical College，Zhengzhou 450121 ；
3. Henan Biotechnology Research Center，Zhengzhou 450001 ；4. College of Life Science，Henan Normal University，Xinxiang 453003）
Abstract:  It was to utilize the improved intrasplenic immunization and semi-solid culture medium to reduce the immune dosage, clone
the hybridoma simply, and shorten the period of cycle. The skin areas of mice spleen was anesthetized, then the spleen was injected with trace
antigen, which could be immuned in a short period of time, cell fusion was prepared after intravenous injection. The three different methods
（limited dilution, methylcellulose, soft agar）were used to get hybridomas which can secret monoclonal antibody. Results showed that compared
with the traditional method of preparation of monoclonal antibody, the improved intrasplenic immunization was simpler operation, without the
addition of adjuvant, and the high titer of antibody was getted in a short time. Positive rate was the highest when methylcellulose concentration in
the 1.1% condition. It was suggested that these methods could be suitable for large scale preparation of monoclonal antibody.
Key words:  Intrasplenic immunization Soft agar Methylcellulose
子（IL-4、GM-CSF 等），增加了试验成本，步骤繁琐。
本试验通过改进武楠等［5］脾内注射方法，采用局部
麻醉脾脏区域皮肤，切开后透过腹膜直接向脾脏注
射微量抗原，简化手术操作，短时间内产生高效价
抗体；通过有限稀释、半固体培养基（甲基纤维素［6］、
软琼脂）方法对比试验，探索筛选分泌单克隆抗体
杂交瘤细胞的最佳方法和条件。
2013年第8期 167任瑞敏等 ：利用改良后的脾内免疫和半固体培养基法制备单克隆抗体
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试 剂 人 IgM（2.875 mg/mL）、 兔 抗 鼠 IgG-
HRP（由河南省生物工程技术研究中心提供）；盐酸
利多卡因注射液（上海朝晖省业有限公司）；甲基纤
维素（MC，4000 mPa.s，上海颖心实验室设备有限
公司）；琼脂糖 AGAROSEG-10（BIOWEST 公司）；
PEG 1450（Sigma 公司）；HAT、HT（Gibco 公司）。
1.1.2 仪器 倒置显微镜（上海精密仪器仪表有
限公司，XD-101 型）；磁力搅拌器（金坛市华峰仪
器有限公司，78-1 型）；CO2 培养箱（Forma 公司，
3326 型）；酶标仪（Thermo Labsystems 公司，MK3 型）。
1.1.3 动物 8-10 周龄的健康 BALB/c 雌性小鼠（由
河南省生物工程技术研究中心提供）。
1.2 方法
1.2.1 溶液配制 无菌条件下将 2×RPMI-1640-2%
MC、1×RPMI1640 、胎牛血清、50×HAT、100× 青
霉 素 - 链 霉 素、2 mmol/L L-谷 氨 酰 胺 用 磁 力 搅 拌
器混匀，配制成 1.1% MC 和 1.3% MC 两组均含有
1×RPMI1640、25% 胎牛血清的半固体培养基，4℃
保存，用前充分震荡混匀，恢复室温后使用。用生
理盐水配制 5% 琼脂糖溶液，灭菌后保存于 45℃水
浴锅中。
1.2.2 脾内注射及免疫效价检测 参考武楠等［5］
脾内注射的方法进行改进。将试验小鼠分成 4 组
（3 只/组 ）， 人 IgM［7］ 按 照 25 μg/只、40 μg/只、55
μg/只分别注射 3 组小鼠，第 4 组注射生理盐水作为
阴性对照组。手术前小鼠禁食 12 h 以上，采用手握
式保定小鼠进行手术，剪去脾脏手术区域被毛，碘
酒消毒、75% 酒精脱碘后，用利多卡因局部麻醉剂
（约 0.2 mL/只）以十字交叉式进行表皮麻醉，切开
腹部皮肤，透过腹膜可清晰看到暗红色脾脏，用注
射器向脾脏内注射上述不同剂量人 IgM 抗原，缝合
皮肤、包扎。术后 3 d 内，饲喂小鼠 5% 葡萄糖水，
每天观察并用碘伏消毒手术创面。
采用棋盘滴定法［8］检测抗体，初步确定最佳包
被抗原和酶标抗体浓度。脾内免疫第 5、10 天采小
鼠尾血检测抗体效价 ；脾内免疫第 10 天，对小鼠进
行尾静脉注射，免疫剂量为 120 μg/只，强化免疫 4
d 后，采小鼠尾血测抗体效价，选取抗体效价高的
小鼠进行细胞融合。
1.2.3 细胞融合及有限稀释法筛选阳性杂交瘤细
胞 无菌采取小鼠的脾脏细胞与对数期生长的 SP2/0
细胞按 5∶1-10∶1 比例，用常规方法进行细胞融
合［9］，将融合后的细胞平均分成 3 份（A 组用于有
限稀释法，B 组用于软琼脂法，C 组用于 MC 法）。
A 组融合细胞铺于含有饲养层细胞的 96 孔板中，待
融合细胞长至孔底 1/3-1/2 时，用 ELISA 间接法检
测细胞培养上清抗体效价。采用有限稀释法克隆阳
性杂交瘤细胞，细胞计数后以 4、2、1 个 / 孔接种
到铺有饲养层细胞的 96 孔板中。同样方法克隆多次，
直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到 100% 为止，孔内
细胞即为分泌高效价抗体的单克隆杂交瘤细胞株。
1.2.4 软琼脂培养法筛选阳性杂交瘤细胞 采用双
层琼脂法制备单克隆抗体。在无菌条件下，将 5%
琼脂糖溶液、1×RPMI1640、胎牛血清、50×HAT、
2 mmol/L L-谷氨酰胺［10］与 100× 青霉素 - 链霉素混
匀，配制成 0.5% 琼脂糖基层培养液，倾注于 6 孔细
胞板中，在室温中凝固；同等方法配制 0.15% 和 0.30%
琼脂糖两组细胞层培养液，将“1.2.3”中 B 组融合
细胞平均分成两份，分别与两组细胞层培养液混匀，
铺入含琼脂糖培养基的 6 孔板中（3 孔 / 组），平行
铺 3 板。置于 37℃、5% CO2 培养箱中培养 8-11 d 后，
肉眼可见针尖大小白色斑点，显微镜下观察即为细
胞克隆团，挑取后直接移种至含饲养细胞的 96 孔板
中进行培养。用 ELISA 间接法检测上清抗体效价，
获取分泌高效价抗体的杂交瘤细胞株。
1.2.5 甲 基 纤 维 素 法 筛 选 阳 性 杂 交 瘤 细 胞 将
“1.2.3”中 C 组融合细胞平均分成两份，分别与 1.1%
和 1.3% MC 两 组 培 养 液 混 匀， 铺 入 6 孔 板 中（3
孔 / 组），平行铺 3 板。置于 37℃、5% CO2 培养箱中，
培养期间避免观察或动板，以免融合细胞移动位置。
8-11 d 后肉眼可见针尖大小白色斑点，显微镜下观
察即为细胞克隆团，采用“1.2.4”中试验操作获取
分泌高效价抗体的杂交瘤细胞株。
1.2.6 阳性杂交瘤细胞冻存、传代稳定性试验 将
以上所有筛选方法获得的阳性单克隆杂交瘤细胞持
续 3 个月传代培养，每周进行 ELISA 间接法检测细
胞培养上清抗体效价稳定性 ；液氮冻存细胞，在冻
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期168
存 20、60、100 和 130 d 后复苏，ELISA 间接法检测
细胞培养上清抗体效价稳定性。
2 结果
2.1 改良后的脾内免疫及抗体效价检测结果
2.1.1 改良后的脾内免疫 试验采用改良后的脾内
免疫，操作简捷方便，整个操作过程约 12 min/ 只，
无小鼠失血过多或死亡现象（图 1）。
2.3 软琼脂法、甲基纤维素法获得克隆团数结果
在 6 孔细胞板中，用半固体培养基培养融合细
胞，0.15% 和 0.30% 琼脂糖培养基每孔获得克隆数
统计分析（图 4）显示，差异有统计学意义（P<0.05）；
1.1% MC 组和 1.3% MC 组每孔获得克隆数统计分析
（图 5）显示，差异有统计学意义（P<0.01）。
局部（表皮）麻醉 透过腹膜可见暗红色脾脏 透过腹膜向脾脏内注射抗原
图 1 改良后脾内注射试验操作图
2.1.2 抗体效价检测结果 以生理盐水免疫小鼠的
血清作为阴性对照，用已确定的 ELISA 最佳检测条
件（包被抗原浓度为 100 ng/ 孔、酶标抗体浓度为
1∶6 000）检测小鼠尾血血清，使用酶标仪（测量
波长 450 nm、参考波长 630 nm）读取 OD 值。试验
组小鼠（25 μg/只、40 μg/只、55 μg/只）脾内免疫 5
d 后，采小鼠尾血血清稀释 1∶250 时，其 OD 值均
接近对照组阴性值 ；脾内免疫 10 d 后，ELISA 检测
结果见图 2。强化免疫 4 d 后 ELISA 检测，试验组
小鼠抗体效价整体水平较第 10 天 ELISA 检测时明
显上升（图 3）。图 2、图 3 结果表明，相同时间免
疫条件下，第 3 组小鼠产生的抗体效价最高，用于
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1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:16000 1:32000
O
D
൷٬
25 μg
40 μg
55 μg⭏⨶ⴀ≤
纵坐标为每组 3 只小鼠血清检测的 OD 平均值 ；每条数据线代表每组 3 只
小鼠血清 OD 平均值在不同稀释倍数下的变化情况，下同
图 2 第 10 天检测小鼠血清不同稀释倍数 OD 均值变化
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0.2
0.4
0.6
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1.0
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1.4
1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:16000 1:32000 1:64000 1:128000
O
D
൷٬
25 μg
40 μg
55 μg
⭏⨶ⴀ≤
图 3 强化免疫第 4 天小鼠血清不同稀释倍数 OD 均值变化
表 1 不同筛选方法所需时间对照表
筛选方法 融合及形成克隆团 一次克隆 二次克隆 三次克隆 扩增杂交瘤 总计
有限稀释法 10 d 10 d 10 d 10 d 3 d 43 d
甲基纤维素法 11 d 7 d 不需要 不需要 3 d 21 d
软琼脂法 11 d 7 d 不需要 不需要 3 d 21 d
细胞融合制备单克隆抗体。
2.2 三种方法获取阳性单克隆杂交瘤细胞时间对比
使用同一批次融合细胞，软琼脂、甲基纤维素
法与有限稀释法相比，在所用时间上有明显优势（表
1），其中融合及形成克隆团、每次克隆时间均包含
ELISA 间接法检测抗体效价时间。
2.4 阳性克隆及其稳定性
相同数量融合细胞，使用有限稀释、MC、软琼
脂法筛选阳性杂交瘤细胞，分别获得 2、12 和 5 株，
经过反复冻存及传代培养后，ELISA 方法检测细胞
培养上清，最终获得 2 株稳定分泌高效价抗体的阳
性杂交瘤细胞，命名为 1H6、1G2（表 2）。
2013年第8期 169任瑞敏等 ：利用改良后的脾内免疫和半固体培养基法制备单克隆抗体
表 2 1H6、1G2 细胞株反复冻融及传代后 ELISA 检测结果
检测时间
复苏 OD 值 OD 值
冻存 20 d 冻存 60 d 冻存 100 d 冻存 130 d 传代一次 传代二次
1H6 2.139 2.028 2.010 2.014 2.019 2.004
1G2 1.977 1.964 1.953 1.948 1.962 1.956
3 讨论
试验中，脾内注射［5］使微量免疫原滞留在脾脏
内，延长了免疫原与抗原提呈细胞（APC）接触作
用时间，与腹腔注射相比，无需添加佐剂，节约抗
原用量，缩短免疫时间。改进后的脾内注射使用局
部麻醉，较全身麻醉（如乙醚等）维持时间相对较
长，利于控制小鼠，应用方便，无需剪开小鼠腹膜、
提出脾脏，对小鼠伤害最小，但局部麻醉要控制好
利多卡因注射剂量，剂量过大也会致使小鼠死亡。
半固体培养基制备单抗与有限稀释法的盲克隆
相比，操作简便，起始集落即为单克隆细胞，避免
了有价值的慢速生长克隆团被无价值的快速大量生
长克隆团所掩盖，减少污染机会，可节约 11-26 d，
而且培养期间不需要经常观察、换液，减少了试剂
损耗。半固体培养基越黏稠，越不利于细胞生长。
从试验结果得出，MC 和琼脂糖半固体培养基筛选杂
交瘤细胞浓度分别为 1.1% 和 0.15% 时，获得克隆团
多，在显微镜下观察，细胞活力也相对较好。浓度
再低时，克隆团会扩散，失去了半固体培养基使克
隆团彼此之间分离的作用。并发现 MC 法在大规模
单抗制备中实用价值最大，琼脂糖熔点较高（44℃），
必须现配现用，与融合后的杂交瘤细胞混匀时，会
对细胞造成一定的伤害，因此试验中 MC 比软琼脂
法形成的克隆团多，而 MC 在适合培养细胞所需温
度下即可溶解，可提前配制好，置于 4℃冰箱内保存。
4 结论
改良后的脾内免疫和半固体培养基法使单抗制
备流程更简便快捷，节约成本，并取得了较好效果。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）
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⭢ส㓔㔤㍐1.1% ⭢ส㓔㔤㍐1.3%
图 4 软琼脂法获得的克隆团数（每孔克隆均数 ± 标准差）
图 5 MC 法获得的克隆团数（每孔克隆均数 ± 标准差）