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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(11):186-194
收稿日期 ：2015-01-28
基金项目 ：湖北省科技厅基金项目（2009CDA006），湖北省自然科学基金项目（2014CFB802）
作者简介 ：李凌凌，女，博士，副教授，研究方向 ：微生物浸矿技术 ；E-mail ：moonletsmile@163.com
通讯作者 ：吕早生，博士，教授，研究方向 ：生物冶金 ；E-mail ：lzs1961@aliyun.com
嗜酸喜温硫杆菌硫加氧还原酶基因的克隆、表达及
酶活性研究
李凌凌  吕早生  左振宇  李尧益
（武汉科技大学化学工程与技术学院，武汉 430081）
摘 要 ： 旨为研究嗜酸喜温硫杆菌硫加氧还原酶的生化特性，以嗜酸喜温硫杆菌 TST3 的基因组 DNA 为模板，PCR 扩增出
硫加氧还原酶基因（sor），构建了表达载体 pET-sor，转化到 Escherichia coli BL21（DE3）后，获得了重组菌株 E.coli BL21（pET-sor2）。
SDS-PAGE 实验证明，经 IPTG 诱导，该重组菌可以表达目的蛋白 SOR。对诱导条件进行优化，并在最优的条件下诱导 SOR 酶表
达，再经超声波破碎重组菌，上清液通过 Ni+-NTA 亲和层析柱纯化获得重组酶，其催化氧化反应的比酶活、Km 值和 Vmax 分别为 0.70
U/mg，15.672×10-2 g/mL 和 12.755×10-5 mol/ （L·min），而催化的还原反应的比酶活、Km 值和 Vmax 分别为 2.21 U/mg，0.507×10
-2
g/mL 和 4.876×10-5 mol/ （L·min）。
关键词 ： 生物浸矿 ；嗜酸喜温硫杆菌 ；硫加氧还原酶 ；酶活
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.024
Cloning and Expression of Sulfur Oxygenase Reductase Gene from
Acidithiobacillus caldus and the Study of the Recombinant
Enzyme Activity
Li Lingling Lü Zaosheng Zuo Zhenyu Li Yaoyi
（College of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081）
Abstract: In order to investigate biochemical properties of sulfur oxygenase reductase from Acidithiobacillus caldus（AcSOR）, the sor
gene was amplified by PCR with the extracted A. caldus TST3 genomic DNA as template, which was inserted into vector pET-28a to construct
recombinant plasmid pET-sor. And the plasmid was then transformed into Escherichia coli BL21（DE3）to obtain recombinant strain E.coli
BL21（pET-sor2）. SDS-PAGE showed that the target enzyme SOR could be expressed in this recombinant strain after induction by IPTG.
Induction conditions were optimized. The recombinant AcSOR was purified with Ni+-NTA column from the supernatant of the sonicated E.coli
BL21（pET-sor2）induced under the optimal conditions. For the oxidation reaction, specific activity, Km and Vmax of the purified AcSOR were 0.70
units of oxidase/mg of protein, 15.672×10-2 g/mL and 12.755×10-5 mol/ （L·min）, respectively. Furthermore, specific activity, Km and Vmax of
AcSOR for the reduction reaction were 2.21 units of reductase/mg of protein, 0.507×10-2 g/mL and 4.876×10-5 mol/ （L·min）, respectively.
Key words: bioleaching ；Acidithiobacillus caldus ；sulfur oxygenase reductase ；enzyme activity
微生物氧化还原态无机硫化物和元素硫生成硫
酸是自然界硫循环过程中的一个重要的反应。此反
应能为微生物的生长提供能量［1］。已知在微生物中，
主要存在两种硫氧化系统 ：第一种硫氧化系统——
Sox 系统，以化能自养型细菌 Paracoccus pantotrophus
为主要代表菌，该系统位于周质，由 4 种蛋白质
2015,31(11) 187李凌凌等 ：嗜酸喜温硫杆菌硫加氧还原酶基因的克隆、表达及酶活性研究
SoxYZ、SoxAX、SoxB 和 Sox（CD）2 组 成， 负 责 催
化硫化物、元素硫、硫代硫酸盐及亚硫酸盐的氧化
生成硫酸，此过程中伴随着电子转移到细胞色素
c［2］。第二种硫氧化系统依赖于硫加氧还原酶（Sulfur
oxygenase reductase，SOR），可催化元素硫的氧化和
歧化反应，产生亚硫酸盐、硫代硫酸盐及硫化物［1-4］，
反应过程中无需提供额外的辅酶和电子载体，反应
如下 ：
加氧酶 ：S0+O2+H2O → HSO3
-+H+
歧化反应 ：3S0+3H2O → 2H2S+ HSO3
-+H+
总反应式 ：4S0+ O2+4H2O → 2H2S+2HSO3
-+2H+
此反应体系中，亚硫酸盐和过量的元素硫会经
非酶促反应迅速形成硫代硫酸盐 ：
S0+ HSO3
- → S2O3
2-+H+
目 前 的 研 究 表 明，SOR 或 sor 基 因 在 自 然 界
中并非广泛存在，主要存在于一些嗜热嗜酸古菌
和嗜超高温细菌中。另外，一些嗜中温细菌中也
存 在 sor 基 因， 如 嗜 酸 硫 杆 菌。 嗜 酸 喜 温 硫 杆 菌
（Acidithiobacillus caldus，A. caldus） 是 一 种 专 性 化
能自养型嗜中温嗜酸性革兰氏阴性菌。它与嗜酸氧
化亚铁硫杆菌、嗜酸氧化硫硫杆菌共同存在于浸矿
的生态龛位，并广泛应用于生物冶金。嗜酸喜温
硫杆菌能够氧化元素硫和各种还原态无机硫化物
（Reduced inorganic sulfur compounds，RISCs）生成硫
酸而释放出 H+，从而使矿物溶解浸出。考虑到嗜酸
喜温硫杆菌中 RISCs 的代谢与最终矿物的浸出有着
直接的相关性，因此，研究此菌氧化 RISCs 的机理
具有重大理论意义和实践价值。已知，嗜酸喜温硫
杆菌的硫氧化系统分为 3 个亚类——缩短型 Sox 硫
氧化亚系统、非 Sox 硫氧化亚系统和 SOR 亚系统［2］。
其中，SOR 亚系统在细胞质的硫氧化过程中起着重
要的作用，其关键酶——硫加氧还原酶能够氧化细
胞质中无论是胞外转运进入的还是由其他途径代谢
生成的单质硫，由此与另两种硫氧化亚系统关联到
一起，共同完成 RISCs 的氧化。研究该菌中的硫加
氧还原酶的生化特性对于理解该菌如何代谢 RISCs
至关重要，但是目前关于这方面的报道很少。本研
究克隆嗜酸喜温硫杆菌的硫加氧还原酶基因 sor，在
大肠杆菌中大量表达，并以 Ni-NTA 亲和层析柱纯
化出重组蛋白 SOR，研究其酶活性，旨在为研究嗜
酸喜温硫杆菌 SOR 亚系统中的硫加氧还原酶的生化
特性提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒 嗜酸喜温硫杆菌 TST3 为本实
验室从湖北大冶铜山口矿区酸性排污口附近的土壤
中分离纯化、鉴定且保藏 ；大肠杆菌表达载体 pET-
28a 由安徽大学张部昌教授惠赠。
1.1.2 培养基 Waksman 培养基用于培养嗜酸喜温
硫杆菌［5］；LB 培养基用于培养大肠杆菌，筛选抗性
菌株时，加入终浓度为 100 μg/mL 的卡那霉素［6］。
1.1.3 酶和化学试剂 DNA Marker、loading buffer、
dNTP mixture、pfu DNA 聚合酶、溶菌酶溶液、蛋白
酶 K 溶液、RNaseA 溶液、大肠杆菌 DH5α 和 BL21
（DE3）感受态细胞及质粒小提中量试剂盒为天根
生化科技（北京）有限公司产品 ；限制性核酸内切
酶 Nde I、高保真内切酶 EcoR I-HF 及 Protein Marker
为 New England Biolabs（NEB） 公 司 产 品 ；Micro
BCATM Protein Assay Kit 由 Thermo Pierce 公司提供 ；
QIAquick Gel Extraction Kit 为 Qiagen 公 司 产 品 ；T4
DNA 连接酶、IPTG 为 TaKaRa 公司产品 ；引物合成
和测序工作由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计及硫加氧还原酶基因的克隆 根
据 GenBank 中 登 录 号 为 NZ_ACVD010000-78 的
A.caldus ATCC 51756 鸟枪法测序全基因组序列片段
02162006.asm.C78 中 37 049-37 984 bp 的 sor 基 因，
设计合成引物。为便于克隆，在正向引物和反向引
物前分别加上 Nde Ⅰ和 EcoR Ⅰ酶切位点，设计的
上下游扩增引物分别为 ：引物 sor-1 ：5-GCCATAT-
GGACAAAAATCCTATCGTC-3（正向引物，下划线
为 Nde Ⅰ酶切位点，前面 GC 为保护性碱基）；引物
sor-2 ：5-GGAATTCTCAGAGCACAAGTTTGCGCC-3
（反向引物，下划线为 EcoR Ⅰ酶切位点，前面 G 为
保护性碱基）。从嗜酸喜温硫杆菌 TST3 中提取基因
组 DNA［7］，并以其为模板，利用上述的引物进行
PCR 扩增。采用的 PCR 扩增体系如下 ：嗜酸喜温硫
杆菌 TST3 的基因组 DNA 2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）
5 μL，10×pfu DNA 聚合酶缓冲液 5 μL，引物 sor-1
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11188
（2.5 μmmol/L）10 μL， 引 物 sor-2（2.5 μmmol/L）10
μL，pfu DNA 聚 合 酶 0.5 μL， 最 后 补 无 菌 水 至 50
μL。PCR 扩增条件为 ：95℃预变性 5 min ；95℃变性
45 s，63℃退火 1 min，72℃延伸 90 s，共 30 个循环；
72℃延伸 10 min。
1.2.2 重组表达质粒的构建及目标序列分析 PCR
扩增产物及载体 pET-28a 分别采用 Nde Ⅰ和 EcoR Ⅰ
双酶切，回收目的片段并连接，构建重组质粒 pET-
sor，并采用氯化钙转化法将质粒转化到 E.coli DH5α。
提取质粒进行双酶切来验证阳性克隆并测序，通过
NCBI 数据库提供的 BlastN 和 BlastP 功能分别对测
序结果进行核苷酸序列及氨基酸序列对比分析。针
对嗜酸喜温硫杆菌 SOR 氨基酸序列和 NCBI 数据库
中查询得到的各种微生物的 SOR 同源类似物序列，
利 用 Clustal Omega（http ：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/
clustalo/，由 EMBL 数据库提供）和 Mega 5.05 软件进
行各序列间的同源性和进化距离的分析与比较，并
构建系统发育树［8］。
1.2.3 SOR 酶 在 大 肠 杆 菌 BL21（DE3） 中 的 诱 导
表达 将测序正确的 pET-sor 重组质粒转化到大肠
杆菌 BL21（DE3）中。挑取若干单菌落，接种至
含 100 μg/mL 卡那霉素的 10 mL LB 培养基中，37℃
培养过夜后，按 1% 的接种量接入到 100 mL 含 100
μg/mL 卡那霉素的 LB 培养基（250 mL 锥形瓶）中，
37℃培养大约 3 h（OD600 约为 0.8）后，加入终浓
度为 1 mmol/L 的 IPTG 诱导酶的表达，继续培养 4
h［9］，离心（8 000 r/min，4℃，10 min）收集菌体，
超声波破碎后，离心取上清进行 SDS-PAGE 电泳，
分析蛋白质的分子量和存在性质，采用的分离胶浓
度为 10%，使用考马斯亮蓝 R-250 进行染色。利用
BandScan 5.0 软件分析目标蛋白的 SDS-PAGE 扫描图
片，以了解重组菌株中目标蛋白质的表达量占全菌
可溶性蛋白质的百分比。
1.2.4 SOR 蛋白质的纯化方法 离心（8 000 r/min，
4℃，10 min）收集经 IPTG 诱导的 E. coli BL21（pET-
sor2）菌体，用 1×PBS 缓冲液（pH 7.4）洗涤 3 次
后，再重悬，在冰水浴中进行超声波破碎（400 W 下
工作 2 s，间歇 3 s，共破碎 30 min），离心（13 000
r/min，4℃，10 min），收集上清，即得 SOR 粗酶液。
取粗酶液上样于经 1×PBS 缓冲液预平衡的 Ni+-NTA
柱，先用 1×PBS 缓冲液清洗，再用含 20 mmol/L 咪
唑的 1×PBS 缓冲液洗脱，最后用含 80 mmol/L 咪唑
的 1×PBS 缓冲液洗脱，并收集各步骤液体。
1.2.5 SOR 酶活力的测定 硫粉（2%）加入到含有
0.005% 吐 温 20 的 70 mmol/L Tris-HCl 缓 冲 液（pH
7.2）中，用最大功率的超声波处理 10 min，粉碎硫
粉。取 1 mL 处理后的硫粉液，加入 100 μL 的 SOR
粗酶液或纯化后的酶液（阴性对照加入的是 1 mL 的
pET-28a 裂解液上清）。在 80℃条件下反应 10 min
后［1］，分别测定反应液上清中的亚硫酸盐、硫代硫
酸盐［10］及 S2- 浓度［11］。酶活单位定义为每分钟形
成亚硫酸盐和硫代硫酸盐（SOR 催化的氧化反应）
或硫化氢（SOR 催化的还原反应）的微摩尔数［4］。
而比酶活为每毫克蛋白形成的亚硫酸盐和硫代硫酸
盐的量或每毫克蛋白质形成的硫化氢量［10］。蛋白质
含量的测定采用 BCA 法，以牛血清白蛋白为标准品。
SOR 酶的 Km 和 Vmax 值的测定方法 ：取 2-5 μg
纯化的酶，分别温育于 1 mL 的含有 0.4%、0.8%、1.2%、
1.6% 及 2% 硫 处 理 液（ 含 有 0.1% 吐 温 20） 的 70
mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）中。在 65℃条件下反应 0、
2、4、6、8 及 10 min 后，测亚硫酸盐，硫代硫酸盐
和硫化物的量（假设亚硫酸盐和硫化物是反应的唯
一产物，而硫代硫酸盐来自硫和亚硫酸盐的非酶促
反应）。反应速率 V 从产物浓度的线性增长中获得，
再根据 Linewaver-Burk 作图法，以 1/V 对 1/［S］作图，
得到一条直线，直线在横轴上的截距为 -1/Km，纵截
距为 1/Vmax，从而求出 Km 与 Vmax。
2 结果
2.1 pET-sor重组质粒的构建及鉴定
以嗜酸喜温硫杆菌 TST3 的基因组 DNA 为模板，
PCR 扩增出嗜酸喜温硫杆菌硫加氧还原酶的基因片
段 sor，PCR 产物进行 1.0% 的琼脂糖凝胶电泳，结
果（图 1）显示，PCR 产物位于 750 bp 和 1 000 bp
之间，与目标基因的序列长度 936 bp 吻合。将该
片段克隆到 pET-28a 载体上，构建了重组质粒 pET-
sor。对该质粒进行双酶切鉴定（图 2），证实了质粒
pET-sor 已克隆了目标片段的重组质粒。
将 重 组 质 粒 pET-sor 送 交 测 序， 获 得 了 一 段
长 1 135 bp 的核苷酸序列，利用 NCBI 数据库中的
2015,31(11) 189李凌凌等 ：嗜酸喜温硫杆菌硫加氧还原酶基因的克隆、表达及酶活性研究
S → T、T → S、I → M、V → I、K → R 及 Q → E。
已知，硫加氧还原酶的活性中心由 3 个保守半胱氨
酸（V-G-P-K-V- C 和C -X-X- C ，其中 X 代表各种不
同的氨基酸，图 3 中 * 号标出）和一个 Fe 结合位点
（H -X3- H -X23- E ，其中 X 代表各种不同的氨基酸，
图 3 中 Δ 号标出）组成［1］。而 AcSOR 中的氨基酸
突变均未发生在活性中心中。另外，对比各种微生
物中的 SOR 氨基酸序列发现，这些突变位点并不保
守，通常变化较大，且其他微生物的氨基酸序列中
也出现过这些突变的氨基酸［3］，推测这些氨基酸突
变对酶的催化活性不会产生较大的影响。
根据 AcSOR 的氨基酸序列比对（BlastP）结果，
在 GenBank 数据库中找出与 AcSOR 序列一致性高
于 40% 的蛋白质序列，进行多重序列比对，再利用
Mega 5.05 软件构建进化树（图 4），嗜酸喜温硫杆菌
TST3 与 A.caldus ATCC 51756 处于系统发育树中的同
一分支，一致性可达 97%。
2.2 SDS-PAGE检测目标蛋白的表达
表达载体 pET-sor 转化到 E.coli BL21（DE3）后，
获 得 了 8 个 E.coli BL21（pET-sor） 重 组 菌 株。 以
E. coli BL21（pET-28a）菌株为阴性对照，经 IPTG
诱导后，进行 SDS-PAGE 分析。结果（图 5）显示，
与阴性对照相比，8 个 E.coli BL21（pET-sor）重组
菌，均在相对分子量 40 kD 和 35 kD 之间，有明显
的 SOR 蛋白表达条带，与目标蛋白 SOR 的相对分
子量约为 36 kD 一致（包括了 pET-28a 载体表达的
His-tag 片段）。而且，利用 BandScan 5.0 软件分析目
标蛋白的 SDS-PAGE 扫描图片，可知，在 8 个 E.coli
BL21（pET-sor） 重 组 菌 中，E.coli BL21（pET-sor2）
的表达量最大（图 5 中的孔道 2），其目标蛋白质的
表达量占全菌可溶性蛋白质的 69.8%。另外，SDS-
PAGE 分析经 IPTG 诱导后的 E.coli BL21（pET-sor2）
重组菌株中的上清液、周质蛋白以及超声波破碎获
得的胞内蛋白，结果显示目标蛋白分布于胞内，而
且主要以包涵体形式存在。
2.3 硫加氧还原酶的诱导条件的优化
对比不同的诱导温度、诱导时间及 IPTG 浓度的
条件下的硫加氧还原酶的比酶活，获得 E.coli BL21
（pET-sor2）重组菌的最佳诱导条件。
bp
5000
3000
2000
1000
750
500
250
100
M 1 2
M ：DL5 000 DNA ladder ；1 ：阴性对照 ；2 ：sor 基因的 PCR 产物
图 1 硫加氧还原酶基因 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图
Vecscreen 功能将其中 pET-28a 载体中的序列片段
去除后，得到了长度为 936 bp 的嗜酸喜温硫杆菌
TST3 的 sor 基因序列，将此序列提交到 GenBank，
登录号为 KJ958902。利用 NCBI 上提供的核苷酸比
对功能（BlastN），对重组质粒的测序结果进行序
列分析，得出重组质粒克隆的基因片段与登录号
为 NZ_ACVD01000078 的 A. caldus ATCC 51756 鸟
枪法测序全基因组的序列片段 02162006.asm.C78 中
的 37 049 bp 至 37 984 bp 的 sor 基因序列之间的相似
度为 97%，两者的碱基序列有 28 处不同，而相应
的嗜酸喜温硫杆菌 TST3 的 SOR（简称 AcSOR）氨
基酸序列与 NCBI 数据库中登录号 AIA55075.1 的嗜
酸喜温硫杆菌 ATCC 51756 硫加氧还原酶蛋白质序
列的相似度达到 97%，两者之间有 9 处不同（图 3
中下标线标出），其中除了 S → P 的突变外，其余
的突变都是理化性质基本相同的氨基酸残基，如
M 1bp
15000
10000
7500
5000
2500
1000
250
M ：DL15000 DNA ladder ；1 ：pET-sor 质粒的双酶切产物
图 2 pET-sor 质粒的双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11190
2.3.1 诱导温度的优化 在接种后 3 h 的菌液中加
入 1 mmol/L 的 IPTG 后，分别置于 16、20、25、30
和 37℃下进行诱导，诱导时长为 4 h。结果（图 6）
显示，比起较低的诱导温度，在较高温度下（如 30
和 37℃）诱导表达的 SOR 催化氧化反应的比酶活相
对较高，而催化还原反应的比酶活则相对较低。另外，
由于低温下诱导酶的表达有助于酶的正确折叠［12］，
于是观察到 16-25℃下诱导表达生成包涵体的量相
对于 30-37℃较低。根据两种反应的最适诱导温度
和包涵体的生成量，选择 25℃作为最适的诱导温度。
2.3.2 诱导时间的优化 接种 3 h 后，加入 1 mmol/L
的 IPTG，置于 25℃分别诱导 2、3、4、5、6、7 及
8 h（图 7），诱导 6 h 表达的 SOR 催化氧化反应的比
酶活最优，而诱导 4 h 表达的酶催化还原反应的比
Sbjct 301
Query 301
Sbjct 271
Query 241
Sbjct 181
Query 181
Sbjct 121
Query 121
Sbjct 61
Query 61
Sbjct 1
Query 1
311
311
300
300
240
240
180
180
120
120
60
60
*
* *
Query ：嗜酸喜温硫杆菌 TST3 的 SOR ；Sbjct ：嗜酸喜温硫杆菌 ATCC 51756 的 SOR
图 3 pET-sor 重组质粒测序结果的氨基酸序列比对分析结果
CAA39952.1| Acidianus ambivalens
AEE93024.1| Acidianus hospitalis W1
EWG07991.1| Sulfolobales archaeon AZ1
AAK58572.1| Acidianus tengchongensis
EZQ10575.1| Candidatus Acidianus copahuensis
ABN04222.1| Sulfolobus metallicus
NP_377053.1| Sulfolobus tokodaii str.7
YP_023579.1| Picrophilus torridus DSM 9790
KJE49366.1| Acidiplasma sp. MBA-1
YP_008142436.1| Ferroplasma acidarmanus fer1
WP_028963476.1| Sulfobacillus thermosulfidooxidans
AEJ38607.1| Sulfobacillus acidophilus TPY
AAC06723.1| Aquifex aeolicus VF5
ACU89275.1| Desulfomicrobium baculatum DSM 4028
KFZ44895.1| Smithella sp. D17
AEM48683.1| Acidithiobacillus ferrivorans SS3
WP_024894453.1| Acidithiobacillus thiooxidans
ACX96058.1| Halothiobacillus neapolitanus c2
WP_038091271.1| Thiobacillus prosperus
AIA55075.1| Acidithiobacillus caldus ATCC 51756
AGA32849.1| Thioalkalivibrio nitratireducens DSM 14787
WP_041483431.1| Thioalkalivibrio thiocyanoxidans
Acidithiobacillus caldus TST3
0.1
53
100
100
44
99
34
100
74
79
100
10092
99 50
63
100
100
70
100
94
图 4 根据 SOR 氨基酸序列同源性构建的系统发育树
2015,31(11) 191李凌凌等 ：嗜酸喜温硫杆菌硫加氧还原酶基因的克隆、表达及酶活性研究
1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 M kD
170
130
100
70
55
40
35
25
15
M ： 标准蛋白 Marker ；1-8 ： IPTG 诱导的 E.coli BL21 （pET-sor）蛋白 , 从左
到右的重组菌分别为：E.coli BL21 （pET-sor1）、E.coli BL21 （pET-sor2）、E.coli
BL21 （pET-sor3）、E.coli BL21 （pET-sor4）、E.coli BL21 （pET-sor5）、E.coliBL21
（pET-sor6）、E.coli BL21 （pET-sor7）、E.coli BL21 （pET-sor8）; 9 ： IPTG 诱导
的 E.coli BL21 （pET-28a）蛋白（阴性对照）
图 5 E.coli BL21（pET-sor）重组菌株的 SDS-PAGE 图（全
菌可溶性蛋白）
800
700
600
500
400
300
200比
酶
活
/mU·mg-1 
100
16 20 25䈡ሬ⑙ᓖć ≗ॆ৽ᓄⲴ∄䞦⍫䘈৏৽ᓄⲴ∄䞦⍫30 370
图 6 诱导温度的优化
酶活最优。结合两者，确定较好的诱导时间为 4 h。
2.3.3 IPTG 浓度的优化 接种 3 h 后，分别加入 0.1、
0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 及 1.2 mmol/L 的 IPTG， 置
于 25℃诱导 4 h。图 8 显示，在加入 0.6 mmol/L 的
IPTG 的条件下，SOR 催化氧化反应的比酶活相对最
好，而加入 0.4 mmol/L 的 IPTG 时，SOR 催化还原
反应的比酶活相对最好。由此确定最适的 IPTG 浓度
为 0.4 mmol/L。
综上所述，由以上的单因子实验可以得出，重
组 Sor 酶 优 化 的 诱 导 条 件 为 ：加 入 0.4 mmol/L 的
IPTG 后，在 25℃的温度下诱导 4 h。
2.4 硫加氧还原酶的分离纯化及酶活研究
在优化的条件下诱导 E.coli BL21（pET-sor2）中
800
700
600
500
400
300
200比
酶
活
/mU·mg-1 
100
2 3 4 5䈡ሬᰦ䰤h 6 7 80 ≗ॆ৽ᓄⲴ∄䞦⍫䘈৏৽ᓄⲴ∄䞦⍫
图 7 诱导时间的优化
700
600
500
400
300
200比
酶
活
/mU·mg-1 
100
0.1 0.2 0.4
IPTG⎃ᓖmmol·L-10.6 0.8 1.0 1.20 ≗ॆ৽ᓄⲴ∄䞦⍫䘈৏৽ᓄⲴ∄䞦⍫
硫加氧还原酶的表达。取经超声波破碎此重组菌获
得的粗酶液，与 1×PBS 缓冲液预平衡的镍柱结合，
目的蛋白吸附到镍柱上。之后分别用 0、20 和 80
mmol/L 咪唑的 1×PBS 缓冲液进行洗脱，层析过程
如图 9 所示，经 1×PBS 缓冲液洗下来的峰为杂蛋白，
而目标蛋白 SOR 是经 20 mmol/L 的 1×PBS 缓冲液
洗脱下来。洗脱下来的纯化酶液和纯化前的粗酶液
分别进行 SDS-PAGE 检测，结果（图 10）表明，纯
化前的条带很多，而纯化后几乎所有的杂蛋白都消
失了，说明纯化的效果较好。
根据纯化前后的 SOR 与硫粉反应后的溶液中
S2- 离子、SO3
2- 离子和 S2O3
2- 离子的浓度以及蛋白
浓度，算出纯化前粗酶液及纯化后的 SOR 蛋白进行
氧化反应、还原反应的酶活及比酶活，结果见表 1，
纯化前的 SOR 粗酶液（100 μL）催化氧化反应的酶
活为 8.00 mU，催化还原反应的酶活为 23.14 mU，
而作为阴性对照的 E.coli BL21（pET28a），经超声波
破碎后获得的粗酶液（1 mL），催化氧化反应和还
原反应的酶活仅为 0.93 mU 和 0.98 mU。含 3.10 mg
图 8 IPTG 诱导浓度的优化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11192
反应曲线，以硫化物的量随着反应时间的变化绘制
还原反应曲线。再根据氧化反应曲线和还原反应
曲线中线性部分的斜率，分别计算在不同的底物
浓度下氧化反应和还原反应的初始反应速率 V，以
1/V 对 1/［S］作图，得到两条直线。其中，氧化反
应的 1/V 与初始底物浓度的倒数 1/［S］的关系为
y=1.228 7x+0.078 4（R2=0.976 5），而还原反应的 1/V
与 1/［S］的关系为 y=1.039 7x+2.050 9（R2=0.971 6）。
根据这些直线的横截距和纵截距，可以计算得到
氧 化 反 应 的 Km 和 Vmax 分 别 为 15.672×10
-2 g/mL
和 12.755×10-5 mol/（L·min）， 而 还 原 反 应 的 Km
和 Vmax 分 别 为 0.507×10
-2 g/mL 和 4.876×10-5 mol/
（L·min）。
3 讨论
硫加氧还原酶依赖于氧气、催化元素硫的氧
化和歧化反应，生成亚硫酸盐、硫代硫酸盐和硫化
氢。普遍认为，SOR 或 sor 基因主要存在于嗜热嗜
酸古菌和嗜超高温（或高温）型细菌。天然 SOR 酶
最早从化能自养型嗜热嗜酸型古菌 Acidianus brierleyi
（其 SOR 酶简称 AbSOR）、Acidianus ambivalens（其
SOR 酶简称 AaSOR）和 Acidianus tengchongensis（其
SOR 酶简称 AtSOR）中被分离纯化出来［10，13-16］。例
如，2000 年，He 等［14］报道 Acidianus tengchongensis
S5 细 胞 裂 解 液 中 的 AtSOR 催 化 氧 化 反 应 和 还 原
反应的比酶活分别为 28.6 U/mg 和 3.1 U/mg。2004
年，Urich 等［15］发现直接从 Acidianus ambivalens 纯
化获得的 AaSOR 酶催化氧化反应和还原反应的比
酶活分别为 2.96 U/mg 和 0.6 U/mg。后来，陆续有
关于异源表达 AaSOR 和 AtSOR 的报道［3，14，15，17］。
2004 年，Urich 等［15］ 发 现 异 源 表 达 AaSOR 的 大
肠杆菌粗酶液催化氧化反应和还原反应的比酶活
分别为 464 mU/mg 和 145 mU/mg，而经纯化后的重
组 AaSOR 酶 的 比 酶 活 可 以 分 别 达 到 2.82 U/mg 和
0.66 U/mg。2011 年，Veith 等［3］ 发 现 从 异 源 表 达
AaSOR 的大肠杆菌中分离纯化获得的重组 AaSOR
催化氧化反应和还原反应的比酶活分别为 3.03 U/mg
和 1.69 U/mg。此外，在其他的一些古菌，如泉古
菌门的 Sulfolobus tokodaii 和广古菌门的 Ferroplasma
acidarmanus、Picrophilus torridus，以及嗜超高温细
0
500
400 440 480 520 560
1 1 1 1777 95 55330 82 246 6
600 640 680 720 760 800 840 mL
1500
2500
3500
mAU UV1_280nm UV2_254nm Flow
3000
2000
1000
图 9 SOR 酶的 Ni-NTA 纯化层析图谱
M 2 3
kD
170
130
100
70
55
40
35
25
15
1
M：标准蛋白 Marker；1： 纯化后的 SOR 蛋白；2： IPTG 诱导的 E.coli
BL21 （pET-28a）的蛋白（阴性对照）；3 ： 纯化前的 E.coli BL21
（pET-sor2）粗酶液
图 10 SOR 纯化前后的 SDS-PAGE 图谱
蛋白质总量的经超声破碎后的重组菌上清液，经镍
柱纯化后，获得含 667.35 μg 蛋白质总量的 SOR 酶。
纯化后的 SOR 酶，催化氧化反应的酶活为 3.12 mU，
而催化还原反应的酶活为 9.83 mU。另外，纯化前
后的 SOR 酶催化氧化反应的比酶活分别为 257.72
mU/mg 和 0.70 U/mg，而催化还原反应的比酶活分别
为 745.47 mU/mg 和 2.21 U/mg。
表 1 SOR 酶液的活性
酶活 /mU 比酶活 /（mU·mg-1）
氧化反应 还原反应 氧化反应 还原反应
E.coli BL21（pET28a） 0.93 0.98 8.09 8.52
纯化前的 SOR 粗酶液 8.00 23.14 257.72 745.47
纯化后的 SOR 酶 3.12 9.83 0.70×103 2.21×103
另 外， 研 究 SOR 酶 的 反 应 动 力 学 常 数 Km 和
Vmax 时，考虑到硫代硫酸盐是非酶促反应的产物，
所以以亚硫酸盐的量随着反应时间的变化绘制氧化
2015,31(11) 193李凌凌等 ：嗜酸喜温硫杆菌硫加氧还原酶基因的克隆、表达及酶活性研究
菌 Aquifex aeolicus 中也都检测到 sor 基因的存在［18］，
并且相继有些报道完成了这些古菌中 sor 基因的异
源表达。如 2008 年，Pelletier 等［19］发现从嗜超高
温菌 Aquifex aeolicus 中分离纯化得到的 SOR 催化还
原反应的比酶活为 5 U/mg，而该 SOR 酶在大肠杆
菌中异源表达的重组酶催化氧化反应和歧化反应的
比酶活分别为 78.8 U/mg 和 3.05 U/mg。另外，发现
sor 基因存在于许多嗜中温细菌和中等嗜热菌中，如
Halothiobacillus neapolitanus、Sulfobacillus acidophilus
及 Acidithiobacillus species 等， 显 示 SOR 并 非 局 限
存在于极端嗜超高温细菌中［4，20］。例如，在重组
大 肠 杆 菌 中 异 源 表 达 的 嗜 中 温 菌 Halothiobacillus
neapolitanus 的 SOR（简称 HnSOR）催化氧化反应和
还原反应的比酶活分别为 42.4 U/mg 和 4.1 U/mg［4］。
虽然，国内外不断出现关于硫加氧还原酶的
活性研究及异源表达的报道，但是有关嗜酸硫杆
菌 属 中 的 SOR 酶 活 及 异 源 表 达 的 研 究 却 鲜 有 报
道。2007 年，Chen 等［18］ 发 现 从 异 源 表 达 嗜 中 温
细 菌 Acidithiobacillus sp. SM-1（ 现 更 名 为 A.caldus
SM-1）的 SOR 的大肠杆菌中获得的粗酶液催化氧
化反应的比酶活为 3.76 U/mg，但此研究并未报道
该酶液催化还原反应的活性，也未尝试研究纯化后
的酶反应动力学。2012 年，You 等［21］构建了克隆
Acidithiobacillus sp. SM-1 中的 sor 基因（sorSB）的重
组质粒 pBV220/sorSB，实现了 SOR 酶（SORSB）在
大肠杆菌 HB101 中的异源表达。另外，此研究还比
较 了 来 自 Acidianus ambivalens 和 Sulfolobus tokodaii
及 Acidithiobacillus sp. SM-1 的 SOR 酶的温度稳定性，
得出经 Superdex 200 凝胶过滤系统纯化后的重组
SORSB 酶在 70℃的条件下催化氧化反应的比酶活大
约可以达到 0.3 U/mg，但该研究并未分析该酶催化
还原反应的活性。本研究中首次采用具有 His-tag 标
签的 pET-28a 表达载体来构建重组质粒 pET-sor，并
选择金属螯合亲和层析从重组菌中纯化 SOR 酶，这
样简化了蛋白质纯化过程，且纯化后的 SOR 具有较
高的催化活性，催化氧化反应和还原反应的比酶活
可以分别达到 0.70 U/mg 和 2.21 U/mg，纯化的回收
率约为 40%，纯化倍数可约达 3 倍。本研究还分析
了该重组酶的反应动力学特性，获得了此酶催化氧
化反应和还原反应的 Km 和 Vmax 值。
另外，本研究中所使用的菌种 Acidihthiobacillus
caldus TST3 为本实验室从湖北大冶铜山口矿区酸性
排污口附近的土壤中筛选鉴定获得的一株浸磷菌，
从中克隆出的 sor 基因所编码的蛋白质序列（AcSOR）
与 GenBank 中 所 报 道 的 模 式 菌 株 A.caldus ATCC
51756 的 SOR 氨基酸序列的相似性为 97%，其中有
9 处突变位点。对比 AcSOR 与各种微生物中的 SOR
氨基酸序列，可知这些突变位点并不保守，在不同
微生物中变化较大，且不存在于酶活性中心。另外，
酶活测定结果显示这种突变的 AcSOR 仍可以催化单
质硫的氧化和歧化反应，产生亚硫酸盐、硫代硫酸
盐及硫化物，具有一定的酶活。以上结果均说明这
些突变不会或只会微弱地影响酶的活性。为了进一
步确定上述突变位点对 SOR 酶的活性产生的影响及
相应的机理，目前本实验室致力于构建回复突变型
重组 SOR 酶。通过对比突变前后的两种酶催化反应
的差异，以了解 AcSOR 的酶促反应机制，为下一步
进行分子改造奠定基础。
4 结论
以嗜酸喜温硫杆菌 TST3 的硫加氧还原酶基因
为模板，PCR 扩增获得目的片段，选用 pET-28a 质
粒为表达载体，构建了异源表达嗜酸喜温硫杆菌硫
加氧还原酶的大肠杆菌。优化了重组菌株的诱导条
件，并经 Ni+-NTA 层析柱分离纯化获得重组 AcSOR，
其催化氧化反应和还原反应的比酶活分别达到 0.70
U/mg 和 2.21 U/mg。 且 该 重 组 AcSOR 催 化 氧 化 反
应 的 Km 和 Vmax 分 别 为 15.672×10
-2 g/mL 和 12.755
×10-5 mol/（L·min），催化还原反应的 Km 和 Vmax 分
别为 0.507×10-2 g/mL 和 4.876×10-5 mol/（L·min）。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）