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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
螯合球菌属（Chelatococcus sp.）最早由 Auling
等［1］于 1993 年首次提出并描述，并经 16S rRNA 基
因系统发育学分析将其归属于 α-变形菌纲。螯合球
菌属现包含不噬糖螯合球菌（Chelatococcus asaccha-
rovorans）、大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis）
及 Chelatococcus sambhunathii 三个菌种。C. asaccha-
收稿日期 ：2012-12-31
基金项目 ： 中国石油天然气股份有限公司华北油田分公司重大科技项目（2012-HB-z231），中国食品发酵工业研究院科技发展基金（博士基
金）项目（2012KJFZ-BS-01）
作者简介 ：吴刚，男，高级工程师，研究方向 ：微生物采油 ；E-mail ：cyy_wug@petrochina.com.cn
通讯作者 ：李青，女，工程师，研究方向 ：微生物采油 ；E-mail ：cyy_liqing@petrochina.com.cn
一株螯合球菌 HB-4 的分离及多相分类鉴定
吴刚1  刘洋2  李青1  杜慧竟2  游靖1  李红2  柯丛玉1   
张欣2  余吉良1  赵婷2
（1. 华北油田采油工程研究院，任丘 062552 ；2. 中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物
菌种保藏管理中心，北京 100027）
摘 要 : 自华北油田地层水中分离得到的细菌 HB-4，对其进行形态学、生理生化特征鉴定、化学成分分析以及遗传特征测
定，并结合 16S rRNA 基因序列分子生物学鉴定及系统发育学分析。结果表明，该菌株归属于螯合球菌属（Chelatococcus sp.），并
且可鉴定为大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis）。其最适生长温度为 37℃，主要极性脂为 DPG、PE、PG 及 PC，醌为 Q-10，
主要脂肪酸组成分别为 C18：1 ω7c（47.01%）和 C19：0 cyclo ω8c（21.83%），HB-4 具有氧化酶、接触酶、酯酶（C4）、类脂酯酶（C8）、
白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶及萘酚-AS-BI-磷酸水解酶等酶活性。
关键词 : 华北油田 地层水 大邱螯合球菌 HB-4 多相分类鉴定
Identification of Polyphasic Taxonomy for a
Chelatococcus sp. HB-4
Wu Gang1 Liu Yang 2 Li Qing1 Du Huijing2 You Jing1 Li Hong2 Ke Congyu1
Zhang Xin2 Yu Jiliang1 Zhao Ting2
（1. Petroleum Production Engineering Research Institute of Huabei Oilfield Company，Renqiu 062552 ；2. China Center of Industrial Culture
Collection，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100027）
Abstract:  A bacterial strain HB-4 was isolated from stratum water in Huabei Oilfield, and identificated by polyphasic taxonomy basing
on morphologic and physiologic methods, chemical composition analysis, genetic characteristics test and 16S rRNA gene phylogenetic analysis.
The result showed that the strain was a member of the genus Chelatococcus, and was belong to the known species of Chelatococcus daeguensis.
37℃ was its optimum growth temperature. The major polar lipids presented in strain HB-4 were DPG, PE, PG and PC. Major fatty acids were
C18 ：1 ω7c （47.01%）and C19 ：0 cyclo ω8c（21.83%）, and ubiquinone Q-10 was the predominant quinone. HB-4 had enzyme activity of
oxidase, catalase, esterase （C4）, Esterase lipase （C8）, leucine arylamidase, valine arylamidase, cystine arylamidase, trypsin, chymotrypsin,
acid phosphatase and naphthol-AS-BI-phosphate hydrolase.
Key words:  Huabei Oilfield Stratum water Chelatococcus daeguensis HB-4 Polyphasic taxonomy
rovorans 由 Auling 等［1］于 1993 年自蔗糖中分离获得；
C. daeguensis 由 Yoon 等［2］于 2008 年自印染厂废水
中分离得到 ；C. sambhunathii 由 Panday 等［3］于 2010
自温泉沉积物中分离所得。
本研究所分离与鉴定的螯合球菌 HB-4，是本课
题组继大邱螯合球菌 HB-1 之后，又一自华北油田
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期166
地层水样品中分离得到的螯合球菌，该菌对原油有
良好的乳化降解功能、能产生生物表面活性剂、有
机酸等代谢产物、能够降低原油黏度，并经物模试
验证明能够提高原油采收率（文章待发表）。
华北油田开发进入中后期，增产挖潜的难度不
断加大，仅靠注水开发已很难提高油藏采收率，采
用微生物驱油技术可提高原油采收率，主要利用微
生物的代谢产物对原油的作用机理和微生物有效地
作用于地层中的残余油，使剩余在岩石表面、小孔
道中的“死原油”变得容易流动，从而提高原油采
收率。本研究对 HB-4 的分类地位进行系统准确的
鉴定，旨在为进一步了解该菌的驱油机理，充分发
挥其生物学功能，提高原油开采效率奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 HB-4 分离自河北任丘华北油田地层水。
1.1.2 主要试剂 Taq DNA 聚合酶、dNTP、DL2000
Marker 购自天为时代生物有限公司 ；GoldView 购自
北京塞百盛基因技术有限公司 ；溶菌酶购自 Sigma
公司、蛋白酶 K 购自 Merk 公司 ；API 试剂条购自法
国梅里埃公司 ；其它化学药品均为进口分析纯产品。
1.1.3 培养基 LB、NA 及 TSA 培养基（成品）均
购自北京陆桥技术有限责任公司。
1.2 方法
1.2.1 菌株分离 取已灭菌的 50 mL LB 液体培养基
加入 50 mL 油田地层水样品中，富集菌体培养 48 h。
采用梯度稀释法制备 10-2-10-6 的系列稀释液，取
150 μL 分别涂布到 NA 培养基中，37℃下培养 48 h。
挑单菌落转接到新鲜的 NA 斜面上于 4℃保藏。
1.2.2 形态学观察 将菌株 HB-4 在 NA 平板上划线
培养，获得单菌落，观察其菌落形态 ；并利用 JEM-
1400 型透射电镜（TEM）观察其菌体形态特征。
1.2.3 生理生化鉴定 酶活性、碳源利用、糖发酵
产酸和部分生化试验分别使用 API ZYM、API 50CH
（接种液为 API AUX 培养基）、API 20E 及 API 20NE
鉴定试剂条按照使用说明进行操作。生长温度、生
长 pH 值、耐盐性和抗生素敏感性试验参考 Yoon 等［2］
的方法进行。
1.2.4 化学成分分析
1.2.4.1 脂肪酸的测定 脂肪酸的测定方法参照刘
洋等［4］的方法进行。
1.2.4.2 极性脂的测定 极性脂的测定方法参照 Liu
等［5］的方法进行。
1.2.4.3 醌的测定 醌的提取及纯化参照刘洋等［4］
的方法进行。取冻干菌体约 150 mg，加入氯仿∶甲
醇 =2∶1（V/V）的溶液 40 mL，在黑暗处磁力搅拌
10 h 左右。用滤纸过滤惧滤液。用减压旋转蒸发仪
40℃-45℃减压蒸馏至干燥，弃馏液。用丙酮溶液
1-2 mL 重新溶解干燥物，长条状点样于 GF254 硅胶
板（规格 50×200 mm，青岛海洋化工厂分厂）上。
以甲苯作展层剂展层约 20 min，取出风干。在波长
254 nm 紫外灯下观察，在绿色荧光背景下呈暗褐色
的带即为泛醌的位置（Rf=0.4）。刮下 Rf=0.4 的带，
置于 5 mL 小烧杯中，用 1 mL 氯仿溶解，然后用细
菌滤器抽滤除去硅胶，收集滤液及洗液，即得泛醌
的氯仿溶液。置于 4℃黑暗处保存。流动相为甲醇 ：
异丙醇溶液，比例为 4∶1，流速为 1 mL/min，柱温
为 40℃，270 nm 紫外检测。根据标准菌株泛醌组分
与洗脱时间的关系（参考标准菌株），分析未知菌株。
1.2.5 分子生物学鉴定
1.2.5.1 16S rRNA 基因系统发育分析 利用细菌基
因组 DNA 提取试剂盒（Tiangen 公司）提取试验菌
株基因组 DNA，具体步骤参见试剂盒说明书。提
取的基因组 DNA 用 0.8% 的琼脂糖进行检测。以
基因组 DNA 为模板，利用通用引物对 16S rRNA 基
因进行扩增。引物序列为 ：正向引物 27f（5-AG-
AGTTTGATCCTGGCTCAG-3），反向引物 1492r（5-
GGTTACCTTGTTACGACTT-3）［5］。50 μL PCR 反 应
体系 ：50 ng DNA 模板，1×Taq reaction buffer，引物
各 20 pmol，20 μmol dNTP，1.5 U Taq 酶（Ferments）。
反应程序为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 1 min，
52℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，30 个循环 ；72℃
延伸 10 min。PCR 扩增产物用 1% 的琼脂糖进行检
测。纯化后的 PCR 产物用 ABI3700 基因测序仪测序。
测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。测
序结果用 Chromas 软件参照正反序列图谱人工校对。
将测序得到的结果在 EzTaxon server 2.1 进行比对［6］，
2013年第5期 167吴刚等 ：一株螯合球菌 HB-4 的分离及多相分类鉴定
确定与已知序列的同源关系。采用 CLUSTAL W 进
行多序列比对［7］，并利用 N-J 法通过 MEGA 4 软件
进行系统发育及分子进化分析［8］。
1.2.5.2 遗传特征测定 热变性法测定 DNA 的 G+C
含量与复性速率法测定 DNA/DNA 同源性参照东秀珠
等［9］方法进行。参考菌株为大邱螯合球菌（Chela-
tococcus daeguensis） K106T 及 Chelatococcus sambhuna-
thii HT4T。
2 结果
2.1 形态学特征观察
HB-4 细胞近球状，1.11 μm×1.28 μm，端生鞭
毛 1-2 根，表面光滑，单个或成对排列；革兰氏阴性，
不生孢（图 1）。在 TSA 培养基上菌落乳白色，圆形，
表面凸起，光滑，反光，半透明，边缘整齐，直径
约为 1.0 mm。
和图 2。HB-4 的极性脂主要为 DPG（diphosphatidyl-
glycerol）、PE（phosphatidylethanolamine）、PG （pho-
sphatidylglycerol）及 PC（phosphatidylcholine），见图
3。HB-4 的主要呼吸醌组份为 Q-10（泛醌 -10），约
图 1 HB-4 的透射电镜细胞形态观察
2.2 生理生化特征鉴定
HB-4 具有氧化酶、接触酶、酯酶（C4）、类脂
酯酶（C8）、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸
芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶及
萘酚-AS-BI-磷酸水解酶等酶活性 ；最适生长温度为
37℃ ；能够利用 24 种碳源。对链霉素、氯霉素、氨
苄西林、庆大霉素、四环素、卡那霉素及新霉素等
抗生素敏感。HB-4 生理生化特征具体结果详见表 1。
2.3 化学成分分析
根据 MIDI 微生物鉴定系统分析结果，HB-4 主
要脂肪酸组成（≥10%）分别为 C18 ：1 ω7c （47.01%）
和 C19 ：0 cyclo ω8c（21.83%），其他组分结果见表 2
表 2 HB-4 脂肪酸组分分析
脂肪酸组分 丰度（%）
16 ：0 2.20
15 ：0 3OH 0.86
17 ：1 ω8c 0.74
17 ：1 ω6c 0.67
17 ：0 3.53
16 ：0 3OH 0.13
18 ：1 ω7c 47.01
18 ：0 4.10
17 ：0 3OH 0.22
19 ：0 cyclo ω8c 21.83
19 ：0 0.14
18 ：1 2OH 9.22
19 ：0 10-methyl 0.11
18 ：0 3OH 3.32
20 ：1 ω7c 0.95
图 3 HB-4 极性脂 TLC 薄层层析显色图
图 2 HB-4 脂肪酸测定气相色谱图
ᰦ䰤min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20
pA
20
30
40
50
60
FID1 A, (E12A17.474\A0161092.D)
1
.7
4
1
.9
48
3
.9
96
7
.1
35
8
.3
38
9
.0
87
9
.9
88
1
0.
54
1
1
0.
84
4
1
1.
73
0
1
2.
23
1
1
2.
35
4 1
2.
59
0
1
3.
51
2
1
4.
05
1
4.
23
8 1
4.
35
8
1
4.
56
9
1
5.
30
3
1
5.
76
4
1
5.
95
6
1
6.
11
8
1
6.
28
5
1
6.
76
5
1
7.
07
9
1
7.
56
8
1
7.
65
8
1
8.
17
9
NP
DPG
PE
PG
PC
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期168
检测项目 结果 检测项目 结果 检测项目 结果 检测项目 结果
厌氧生长（TSA） - 厌氧生长（含硝酸盐的 TSA） + 氧化酶 + 接触酶 +
运动 - 酪素水解 - 淀粉水解 - 吐温 80 水解 -
酪氨酸水解 - 精氨酸双水解酶 - 赖氨酸脱羧酶 - 鸟氨酸脱羧酶 -
H2S 产生 - 脲酶 - 色氨酸脱氨酶 - 吲哚 -
V-P + 明胶水解 - 硝酸盐还原 - 七叶灵水解 -
酶活性
碱性磷酸酶 - 酯酶（C4） + 类脂酯酶（C8） + 类脂酶（C14） -
白氨酸芳胺酶 + 缬氨酸芳胺酶 + 胱氨酸芳胺酶 + 胰蛋白酶 +
胰凝乳蛋白酶 + 酸性磷酸酶 + 萘酚 -AS-BI-磷酸水解酶 + α-半乳糖苷酶 -
β-半乳糖苷酶 - β-糖醛酸苷酶 - α-葡萄糖苷酶 - β-葡萄糖苷酶 -
N-乙酰 -葡萄糖胺酶 - α-甘露糖苷酶 - β-岩藻糖苷酶 -
生长温度
15℃ - 20℃ +w 30℃ + 37℃ +
45℃ + 51℃ +
生长 pH 值
pH5.0 - pH5.5 + pH6.0 + pH6.5 +
pH7.0 + pH7.5 + pH8.0 + pH8.5 +
pH9.0 + pH10.0 +w pH10.5 -
耐盐性（NaCl 生长）
0%NaCl + 0.5%NaCl + 1%NaCl + 2%NaCl +
3%NaCl + 4%NaCl + 5%NaCl +w
碳源利用
甘油 - 赤癣醇 - D-阿拉伯糖 + L-阿拉伯糖 +
核糖 + D-木糖 + L-木糖 + 阿东醇 +w
β-甲基 -D-木糖苷 - 半乳糖 + 葡萄糖 + 果糖 +
甘露糖 + 山梨糖 - 鼠李糖 +w 卫矛醇 -
肌醇 + 甘露醇 - 山梨醇 - α-甲基 -D-甘露糖苷 -
α-甲基 -D-葡萄糖苷 - N-乙酰 -葡糖胺 - 苦杏仁苷 - 熊果苷 -
七叶灵 + 柳醇 - 纤维二糖 - 麦芽糖 -
乳糖 - 蜜二糖 - 蔗糖 - 海藻糖 -
菊糖 - 松三糖 - 棉子糖 - 淀粉 -
肝糖 - 木糖醇 - 龙胆二糖 - D-松二糖 -
D-来苏糖 + D-塔格糖 - D-岩藻糖 + L-岩藻糖 +
D-阿拉伯糖醇 - L-阿拉伯糖醇 - 葡萄糖酸盐 + 2-酮基 -葡萄糖酸盐 +
5-酮基 -葡萄糖酸盐 + 癸酸 - 己二酸 + 苹果酸 +
柠檬酸钠 - 苯乙酸 - 半胱氨酸 + 甲硫氨酸 -
苏氨酸 + 酪氨酸 - 赖氨酸 - 甘氨酸 -
核糖醇 +w
产酸自
葡萄糖 - 甘露醇 - 肌醇 + 山梨醇 -
鼠李糖 + 蔗糖 - 蜜二糖 - 苦杏仁苷 -
阿拉伯糖 +
抗生素敏感性
多粘菌素 B - 链霉素 + 青霉素 G - 氯霉素 +
氨苄西林 + 头孢噻吩 - 庆大霉素 + 新生霉素 -
四环素 + 卡那霉素 + 新霉素 + 萘啶酸 -
表 1 HB-4 生理生化特征
+ ：反应为阳性 ；- ：反应为阴性 ；+w ：反应为弱阳性
2013年第5期 169吴刚等 ：一株螯合球菌 HB-4 的分离及多相分类鉴定
占 97%，见图 4。
sambhunathii HT4T 聚 类 在 一 个 系 统 发 育 分 支， 序
列同源性为 98% 以上，可确定 HB-4 为 Chelatococ-
cus sp.。
2.5 遗传特征测定
图 6 和 图 7 分 别 为 对 照 菌 株（E.coli K12） 和
HB-4 Tm 值的测定图。根据公式计算，基因组 DNA
的 G+C 含量为 65.8 mol%，符合 Chelatococcus 属的
G+C 含量的数值范围。图 8 和图 9 为待测菌株与近
缘两模式菌株同源性的测定图，经计算，HB-4 同模
式菌株 Chelatococcus daeguensis K106T 及 Chelatococcus
sambhunathii HT4T 的 DNA 同 源 性 分 别 为 84.9% 和
图 4 HB-4 泛醌 270 nm 紫外检测结果
图 5 菌株 HB-4 16S rRNA 基因系统发育分析
图 6 E.coli K12 Tm 值测定图
100
99
99
84
93
0.005
Salinarimonas ramus SL014B-41A4TGU125653
Methylobacterium oxalidis 35aTAB607860
Bosea minatitlanensis AMX51TAF273081
Microvirga aerilata 5420S-16TGQ421849
Microvirga guangxiensis 25BTEU727176
Microvirga subterranea DSM 14364TFR733708
Camelimonas lactis M 2040TFN430422
Chelatococcus asaccharovorans TE2TAJ294349
HB-4
Chelatococcus sambhunathii HT4TDQ322070
Chelatococcus daeguensis K106TEF584507
60
0.26
0.27
0.28
0.29
0.30A
bs 0.31
0.32
0.33
0.34
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 9284 86 88 90⑙ᓖć
2.4 16S rRNA基因系统发育分析
利 用 引 物 27f 和 1492r 扩 增 得 到 HB-4 的 16S
rRNA 基因序列，序列长度为 1 448 bp，GenBank 序
列登录号为 JX658137。在 GenBank 数据库中通过
Blast 方 法 比 对， 采 用 MEGA 4 软 件 用 N-J 法 构 建
HB-4 与相关模式菌株的系统发育树（图 5）。HB-4
与 Chelatococcus daeguensis K106T 及 Chelatococcus
图 7 HB-4 Tm 值测定图
图 8 HB-4 与 K106T 同源性测定图
47.2%。通过 DNA/DNA（杂交）同源性测定可以初
步判断 HB-4 应为大邱螯合球菌（Chelatococcus dae-
guensis）。
0 5 10
12
.9
47
16
.6
64
23
.3
62
15 20 25
Q-10
Q-9Q-8
min
0
50
100
150
200
250
mAU
每个分支点处的数字为 Bootstrap（1 000 次抽样）的支持百分率。标尺代表 0.5% 的序列差异度。
60
0.26
0.27
0.28
0.29
0.30A
bs
0.31
0.32
0.33
0.34
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 9284 86 88 90⑙ᓖć
0
0.89
0.90
0.91
0.92
0.93
0.94
0.95A
bs 0.96
0.97
0.98
0.99
1.00
1.01
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 30002200 2400 2600 2800ᰦ䰤s
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期170
图 9 HB-4 与 HT4T 同源性测定图
3 讨论
本研究利用细菌通用引物对 HB-4 的 16S rRNA
基因序列扩增和序列测定，并通过 GenBank 数据库
进行分析比较和利用 MEGA 4 进行系统进化分析，
HB-4 被鉴定为螯合球菌属（Chelatococcus sp.）。以
基因系统发育分析为基础，结合形态及培养特征、
生理生化试验、化学成分分析及遗传特征测定结果，
并综合参考螯合球菌属中现存 3 个菌种的相关报
道［1-3］，最终确定 HB-4 为大邱螯合球菌（Chelatococ-
cus daeguensis）。
本研究所分离得到的大邱螯合球菌 HB-4，是本
课题组继大邱螯合球菌 HB-1（文章待发表）之后，
又一自华北油田地层水样品中分离得到的螯合球菌
菌株，其在相关酶活性及抗生素敏感性等生理生化
特征方面与 HB-1 存在细微的差异。目前关于螯合
球菌的生物学功能的研究仅在反硝化作用方面有所
报道［10］，而对其在石油原油开采领域的生物学功能
及其机制机理的研究尚鲜有报道，这方面的研究有
待进一步深入的开展。
微生物的形态特征是由遗传物质和生存环境等
因素共同决定的，利用基于形态学、生理生化及分
子生物学等技术的多相分类鉴定方法现已广泛应用
于微生物分类学研究领域［4］。利用微生物多相分类
鉴定技术对油田地层水 HB-4 鉴定至“种”水平，确
定其准确的分类地位，为进一步了解和发挥这类螯
合球菌的生物学功能及实现其生产利用价值奠定重
要的基础。
4 结论
本研究针对自华北油田地层水中分离得到的细
菌 HB-4 进行多相分类学鉴定，并最终将 HB-4 鉴定
为大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis）。该菌株
具有一些特殊的生理生化特征及酶学活性，具有重
要的理论研究与实践应用价值。
参 考 文 献
［1］ Auling G, Busse HJ, Egli T, et al. Description of the Gram-negative,
obligately aerobic, nitrilotriacetate （NTA） -utilizing bacteria
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asaccharovorans, gen. nov., sp. nov ［J］. Syst Appl Microbiol, 1993,
16（1）：104-112.
［2］ Yoon JH, Kang SJ, Im WT, et al. Chelatococcus daeguensis sp.
nov., isolated from waste water of a textile dye works, and emended
description of the genus Chelatococcus ［J］. IJSEM, 2008, 58（9）：
2224-2228.
［3］ Panday D, Das SK. Chelatococcus sambhunathii sp. nov., a
moderately thermophilic alphaproteobacterium isolated from hot
spring sediment ［J］. IJSEM, 2010, 60（4）：861-865.
［4］ 刘洋 , 赵婷 , 姚粟 , 等 . 一株芝麻香型白酒高温大曲嗜热放线菌
的分离与鉴定［J］. 生物技术通报 , 2012（10）：210-216.
［5］ Liu Y, Liu L, Qiu F, et al. Paenibacillus hunanensis sp. nov., isolated
from rice seeds ［J］. IJSEM, 2010, 60（6）：1266-1270.
［6］ Chun J, Lee JH, Jung Y, et al. EzTaxon ：a web-based tool for the
identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene
sequences ［J］. IJSEM, 2007, 57（10）：2259-2261.
［7］ Thompson JD, Higgins DG, GibsonT J. CLUSTAL W ：improving the
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequ-
ence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix
choice ［J］. Nucleic Acids Res, 1994, 22（22）：4673-4680.
［8］ Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4 ：Molecular Evolutionary
Genetics Analysis （MEGA） software version 4.0 ［J］. Molecular
Biology and Evolution, 2007, 24 ：1596-1599.
［9］ 东秀珠 , 蔡妙英 . 常见细菌系统鉴定手册［M］. 北京 ：科学出
版社 , 2001 ：399-402.
［10］ 张苗 , 黄少斌 . 高温好氧反硝化菌的分离鉴定及其反硝化性能
研究［J］. 环境科学 , 2011, 32 （1） ：259-265.
（责任编辑 马鑫）
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