全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
收稿日期 ：2013-01-11
基金项目 ：江西省教育厅科技项目（GJJ12624），九江学院博士科研启动项目（8870909）
作者简介 ：汪涛，男，博士，研究方向 ：病原生物分子生物学 ；E-mail ：comwangtaocom@163.com
通讯作者 ：赵志军，男，博士，研究方向 ：微生物分子生物学 ；E-mail ：z15815z@163.com
猪链球菌 2 型 MRP 和 EF 双基因共表达重组
腺病毒载体的构建
汪涛 1，2  余辉1  梅钧1  李兴暖2  周小鸥2  赵志军3
（1. 九江学院基础医学院病原生物学教研室，九江 332000 ；2. 江西省系统生物学临床应用重点实验室，九江 332000 ；
3. 宁夏医科大学总医院医学实验中心，银川 750004）
摘 要 ： 旨在构建猪链球菌 2 型溶菌酶释放蛋白（MRP）和胞外因子（EF）双基因共表达重组腺病毒载体。根据猪链球
菌 2 型 MRP 和 EF 的基因序列设计合成 2 对引物，以猪链球菌 2 型基因组为模板，扩增 MRP 基因（第 1 801-2 513 位）和 EF 基
因（第 1 783-2 563 位）序列，并克隆到 pMD18-T 载体。然后将 MRP 基因、IRES 元件和 EF 基因依次定向克隆至腺病毒穿梭载
体 pShuttle-CMV 中构建重组穿梭质粒 pShuttle-CMV-MRP-IRES-EF，再经 Pme Ⅰ酶切，然后转化至含腺病毒骨架质粒 pAdEasy-1 的
BJ5183-AD-1 感受态细胞中，经同源重组获得重组腺病毒载体质粒 rAdeno-CMV-MRP-IRES-EF。Pac Ⅰ酶切线性化该重组腺病毒载
体质粒，再转染 AD-293 细胞进行病毒包装，最后对细胞包装的病毒液进行 PCR 鉴定。结果表明，克隆的 MRP 和 EF 基因测序正确，
酶切重组穿梭质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物 ；线性化的重组腺病毒载体质粒 rAdeno-CMV-MRP-IRES-EF 转染 AD-293 细
胞 6 d 后也出现明显的细胞病变（CPE），在培养细胞的上清病毒液中也检测到了 MRP 和 EF 基因片段。
关键词 ： 猪链球菌 2 型 溶菌酶释放蛋白 胞外因子 双基因共表达 重组腺病毒载体
Construction of Recombinant Adenovirus Vector of Co-expressing
MRP and EF Gene from Streptococcus suis Type 2
Wang Tao1，2 Yu Hui1 Mei Jun1 Li Xingnuan2 Zhou Xiaoou2 Zhao Zhijun3
（1. Department of Pathogenic Biology，Medical College，Jiujiang University，Jiujiang 332000 ；2. Key Laboratory of Jiangxi Province for the
Systems Biology Clinical Application，Jiujiang 332000 ；3. Medical Experimentation Center，General Hospital of Ningxia Medical University，
Yinchuan 750004）
Abstract:  The purpose of this study was to construct recombinant adenovirus vector of co-expression MRP and EF genes from
Streptococcus suis type 2（SS2）. The specific primers were designed by the sequence of MRP and EF genes. The MRP（1 801-2 513）and EF
（1 783-2 563）gene fragment were amplified from genomic DNA of SS2 by PCR technique. PCR products were cloned in pMD18-T vector. Then
MRP gene, IRES element and EF gene linked into the adenovirus shuttle plasmid（pShuttle-CMV）to construct recombinant shuttle plasmid
（pShuttle-CMV-MRP-IRES-EF）. The recombinant shuttle plasmid was lineared with Pme Ⅰ and transformed into BJ5183-AD-1 competent
cells to construct homogeneous recombinant adenovirus plasmid（rAdeno-CMV-MRP-IRES-EF）. Then the recombinant adenovirus plasmid
was linearized with Pac Ⅰ and transfected into AD-293 cells. Finally, virus liquids of cell pack were identified by PCR. The results showed that
MRP and EF genes were verified by gene sequencing. Both the recombinant shuttle plasmid and recombinant adenovirus vector plasmid were
verified by enzyme digestion. Cytopathic effect（CPE）was observed after transfection linear rAdeno-CMV-MRP-EF 6 days. MRP and EF gene
were also detected in the virus liquid by PCR.
Key words:  Streptococcus suis type 2 Muramidase-released protein Extracellular factor Gene co-expression Recombinant adeno-
virus vector
2013年第8期 131汪涛等 ：猪链球菌 2 型 MRP 和 EF 双基因共表达重组腺病毒载体的构建
猪 链 球 菌 2 型（Streptococcus suis type 2，SS2）
是一种重要的人畜共患病的病原体，可引起猪的败
血症、脑膜炎、支气管肺炎、关节炎和新生仔猪的
大量死亡［1］；同时也可引起人的感染，导致筋膜
炎、脑膜炎和中毒性休克综合征等严重病症［2］。近
年来，猪链球菌病在国内外时有流行或暴发，严重
危害着养猪业的发展和人类的健康。溶菌酶释放蛋
白（muramidase-released protein，MRP）和胞外因子
（extracellular factor，EF）是猪链球菌 2 型的两种重
要的毒力因子，从病猪体内分离的均为 MRP+EF+，
而从健康猪体内分离的为 MRP-EF-，可见 MRP 与
EF 在致病过程中起着重要作用［3，4］。目前对该病的
致病机理仍缺乏足够的了解，国内外迄今也没有高
效的基因工程疫苗来防治该病的发生。本试验根据
DNAStar 软件分析猪链球菌 2 型基因序列，选取可
能含有抗原决定簇肽段的 MRP 和 EF 基因序列，并
用内部核糖体进入位点（internal ribosomal entry site，
IRES）元件连接 MRP 和 EF 基因来构建 MRP 和 EF
双基因共表达的重组腺病毒载体，旨在为研制高效
的基因工程疫苗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
SS2 菌株和大肠杆菌 DH5α 由本实验室保存 ；
pIRES 质粒、pShuttle-CMV Vector、AD-293 细胞和菌
株 BJ5183-AD-1 均为 Strategene 公司产品 ；pMD18-T
Vector、 限 制 性 内 切 酶 ：Bgl Ⅱ、Sal Ⅰ、Xba Ⅰ、
EcoR Ⅴ和 Xho Ⅰ ；蛋白酶 K 以及 T4 DNA 连接酶等
均为 TaKaRa 公司产品 ；Pme Ⅰ和 Pac Ⅰ酶为 New
England Biolab（NEB）公司产品 ；DNA 提取试剂盒，
DNA 胶回收纯化试剂盒，质粒抽提试剂盒为 Omega
公司产品 ；DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15-
000、λ-Hind Ⅲ digest 为 TaKaRa 公 司 产 品 ；Lipofe-
ctamineTM 2000 转 染 试 剂 盒 为 Invitrogen 公 司 产 品。
Todd-Hewitt 肉汤购自上海丽臣生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 猪链球菌 2 型基因组的提取 挑取血平板上
的单菌落接种于 Todd-Hewitt 肉汤培养基中，37℃振
荡培养过夜。取 1.5 mL 菌液离心，按 DNA 提取试
剂盒说明书进行细菌 DNA 提取，置 -20℃备用。
1.2.2 MRP 和 EF 基因片段的克隆 按照 GenBank
中的 MRP 基因序列，在欧瑜等［5］、徐淑菲等［6］研
究基础上，结合 DNAStar 软件分析，选取 MRP（第
1 801-2 513 位）和 EF（第 1 783-2 563 位）抗原性
较强的一段氨基酸，分别设计两对引物 MP1、MP2
和 EP1、EP2， 在 MRP 和 EPF 引 物 两 端 分 别 加
Bgl Ⅱ、Sal Ⅰ和 Xba Ⅰ、EcoR Ⅴ限制性酶切位点
（下划线部分）和保护性碱基（斜体部分）。
MRP 基因引物 ：上游引物 MP1 ：5-GAAGATCT-
GAACAAACGAGTGGG-3 ；下游引物 MP2 ：5-ACGC-
GTCGACACCTGTCACTGCTCTA-3。
EF 基因引物 ：上游引物 EP1 ：5-GCTCTAGAC-
TTACTTATGGCTTCACT-3 ；下游引物 EP2 ：5-CCG-
GATATCTTGCTTCATTCCGTGT-3，引物由上海生工
生物工程有限公司合成。
以 SS2 基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR
扩增条件为 ：95℃预变性 5 min ；94℃变性 1 min，
55℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，扩增 35 个循环 ；
最后 72℃延伸 10 min。PCR 产物经回收纯化后连接
到 pMD18-T Vector 中， 并 命 名 为 pMD18-T-MRP 和
pMD18-T-EF，将连接产物转化至 DH5α 感受态细胞
中进行克隆。提取质粒，酶切鉴定，并将鉴定为阳
性的重组质粒的菌液送上海生工生物工程有限公司
测序。
1.2.3 重组腺病毒穿梭质粒构建 用 Bgl Ⅱ、Sal Ⅰ
双酶切穿梭质粒 pShuttle-CMV 和 pMD18-T-MRP 质
粒，琼脂糖凝胶电泳分离、回收穿梭载体质粒和基
因片段，用 T4 DNA 连接酶进行连接并转化感受态，
小量提取重组质粒，获得重组 pShuttle-MRP 的质
粒。用类似方法将 EF 片段亚克隆至 pShuttle-CMV-
MRP 质粒的 Xba Ⅰ、EcoR Ⅴ酶切位点上，获得重组
pShuttle-CMV-MRP-EF 质粒。最后将 pIRES 质粒用
Xho Ⅰ和 Xba Ⅰ双酶切，获得 IRES 片段，并亚克
隆至 pShuttle-CMV-MRP-EF 质粒对应的酶切位点上，
获得由 IRES 元件串联两个基因的穿梭质粒 pShuttle-
CMV-MRP-IRES-EF，并进行酶切鉴定。
1.2.4 重组腺病毒载体质粒的构建 用限制性内切
酶 Pme Ⅰ将鉴定为阳性的重组穿梭质粒 pShuttle-
CMV-MRP-IRES-EF 线性化，胶回收纯化后，转化
至 BJ5183-AD-1 感受态细胞中同源重组，用含卡那
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期132
霉素（100 μg/mL）的 LB 培养基筛选，经菌液 PCR
初步鉴定后进行质粒的抽提。取抽提质粒 5 μL 用
Pac Ⅰ酶切鉴定，将鉴定正确的阳性同源重组腺病
毒质粒命名为 rAdeno-CMV-MRP-IRES-EF。
1.2.5 同 源 重 组 腺 病 毒 质 粒 转 染 AD-293 细 胞
Pac Ⅰ酶切重组腺病毒质粒 rAdeno-CMV-MRP-IRES-
EF 使其线性化，用 LipofectamineTM 2000 将线性化
的质粒转染 AD-293 细胞，6 d 后有 90% 以上细胞出
现 CPE，收集细胞用 pH7.4 的 PBS 洗涤后，再加少
量 PBS，反复冻融数次裂解细胞，离心收集含有病
毒的上清作为病毒储液。病毒储液继续感染 AD-293
细胞，大量扩增腺病毒。
1.2.6 重组腺病毒 rAdeno-MRP-IRES-EF 载体的鉴
定 病毒储液继续感染 AD-293 细胞，当细胞培养皿
中出现细胞病变（CPE）时，取病毒液反复冻融数
次，离心后取上清加蛋白酶 K 和 SDS 处理，再用苯
酚∶氯仿（1∶1）抽提，最后用无水乙醇沉淀获得
DNA，以 MP1/MP2 和 EP1/EP2 引物分别扩增 MRP
和 EF 基因。
2 结果
2.1 MRP和EF基因的扩增
PCR 扩增产物经电泳后，获得约 713 bp 和 781
bp 的条带，与预期大小一致（图 1）。
以及用 Xba Ⅰ和 EcoR Ⅴ酶切得到约 2 700 bp 和 781
bp 的片段，与预期大小相符，表明 MRP 和 EF 基因
片段已成功插入 pMD18-T Vector 中（图 2）。序列测
定也证实插入片段与 GenBank 中 MRP 和 EF 的对应
序列完全一致。
2000
bp
M 1 2 3
1000
750
500
250
100
M ：DNA 分子量标记（DL2000）；1 ：MRP 基因的 PCR 扩增产物 ；2 ：EF 基
因的 PCR 扩增产物 ；3 ：阴性对照
图 1 猪链球菌 2 型 MRP 和 EF 基因的扩增
2.2 重组质粒 pMD18-T-MRP和pMD18-T-EF 的克
隆与测序
PCR 扩增的 MRP 和 EF 基因片段通过 T-A 克隆，
构建 pMD18-T-MRP 和 pMD18-T-EF 质粒，用 Bgl Ⅱ
和 Sal Ⅰ双酶切可得到约 2 700 bp 和 713 bp 的片段，
2000
bp
M1 1 2 M2
1000
750
500
250
100
7500
15000
bp
5000
2500
1000
250
M1 ：DNA 分子量标记（DL2000）；1 ：重组质粒 pMD18- T- MRP 用 BglⅡ/
Sal Ⅰ的酶切产物；2：重组质粒 pMD18-T-EF 用 XbaⅠ/ EcoR Ⅴ的酶切产物；
M2 ：DNA 分子量标记（DL15000）
图 2 重组质粒 pMD18-T-MRP 和 pMD18-T-EF 的酶切
鉴定
2.3 重组穿梭质粒 pShuttle-CMV-MRP-IRES-EF的
构建
将构建的重组穿梭质粒用重组质粒经 XbaⅠ/
EcoRⅤ、BglⅡ/SalⅠ、XhoⅠ/XbaⅠ和 BglⅡ/ EcoRⅤ
4 种组合的双酶切鉴定分析，分别得到约 781、713、
641 和 2 100 bp 酶切产物与预期结果相符，表明已
成功构建了 pShuttle-MRP-IRES-EF 质粒（图 3）。
15000
bp M 1 2 3 4
7500
2500
1000
250
M ：DNA 分子量标记（DL15000）；1 ：Xba Ⅰ /EcoR Ⅴ双酶切产物 ；2 ：Bgl Ⅱ /
Sal Ⅰ双酶切产物 ；3 ：Xho Ⅰ /Xba Ⅰ双酶切约产物 ；4 ：Bgl Ⅱ /EcoR Ⅴ双
酶切产物
图 3 重组穿梭质粒 pShuttle-CMV-MRP-IRES-EF 的酶切
鉴定
2.4 同源重组腺病毒质粒rAdeno-CMV-MRP-IRES-
EF的构建
同 源 重 组 质 粒 rAdeno-CMV-MRP-IRES-EF 经
2013年第8期 133汪涛等 ：猪链球菌 2 型 MRP 和 EF 双基因共表达重组腺病毒载体的构建
Pac Ⅰ酶切产生约 23 kb 和 3.0 kb 的两条带（图 4），
表明线性化的重组穿梭质粒转化 BJ5183-AD-1 后成
功获得了同源重组腺病毒质粒。
通就出现过大规模暴发和流行，造成数万头生猪的
死亡，同时造成 25 人感染发病，14 人死亡［7］。在
2005 年四川省的成都、绵阳和自贡等 8 个地市再次
暴发了猪链球菌病，647 头猪死亡 ；而人感染猪链
球菌病例也高达 204 例，38 人死亡［8］。
MRP 和 EF 是 SS2 致病株的重要毒力因子和保
护性抗原，是疫苗研制的关键靶标，也是公认的首
选免疫原蛋白［9，10］。Wisselink 等［11］研究表明，从
SS2 菌 体 中 提 取 MRP 和 EF 的 蛋 白 然 后 混 合 免 疫
猪，可获得较高的保护率 ；然而国内外迄今没有高
效的基因工程疫苗来防治该病的发生，本试验根据
DNAStar 软件分析，选取可能含有抗原决定簇肽段
的 MRP 和 EF 基 因 序 列， 构 建 MRP 和 EF 双 基 因
共表达的重组腺病毒载体，以发挥它们的协同保护
作用。
在这个试验中，我们首次利用了腺病毒载体系
统（AdEasyTM XL Adenoviral Vector System），与其他
载体系统相比，腺病毒载体系统是一种呈递和表达
外源抗原的有效系统，外源基因的表达时相长 ；腺
病毒感染后也不会有病毒蛋白的表达，极大地降低
了机体的免疫反应和细胞毒性，安全性得到了提高；
此外，腺病毒还能感染多种组织和细胞，也不易发
生基因整合，还可折叠和修饰目的蛋白，表达的目
的蛋白具有良好的活性［12，13］。该腺病毒系统中大
肠杆菌 BJ5183-AD-1 感受态细胞本身携带有腺病毒
骨架质粒，穿梭质粒线性化后即可转化感受态细胞，
简化了试验流程 ；而对同源重组腺病毒载体质粒
rAdeno-CMV-MRP-IRES-EF 转染 AD-293 细胞所产生
的上清病毒液进行鉴定，也证实了重组腺病毒载体
构建成功。
23130
bp
M 1
4361
2322
M ：DNA 分 子 量 标 记（λ-Hind Ⅲ digest）；1 ：rAd-CMV-MRP-IRES-EF 的
Pac Ⅰ酶切产物
图 4 同源重组腺病毒载体 rAdeno-CMV-MRP-IRES-EF
的 Pac Ⅰ酶切鉴定
2.5 同源重组腺病毒质粒
rAdeno-CMV-MRP-IRES-EF 转 染 AD-293 细 胞
当细胞长至 80%-90% 满度，且细胞状态良好时使
用脂质体法转染线性化后的 rAdeno-CMV-MRP-IRES-
EF，转染 6 d 后细胞出现变圆、固缩和脱落等明显的
CPE（图 5）。
A B
A ：转染后出现的 CPE 细胞 ；B ：正常的 AD-293 细胞
图 5 细胞转染后 CPE 及正常 AD-293 细胞
2.6 重组腺病毒的PCR鉴定
当细胞培养皿中 AD-293 细胞出现完全 CPE 时，
取病毒液，提取 DNA，用 MRP 和 EF 基因的引物进
行PCR 检测得到约713 bp和 781 bp特异性目的条带，
与预期结果相符（图 6），表明重组腺病毒中正确插
入了目的基因。
3 讨论
猪链球菌病是由猪链球菌引起的一种常见人畜
共患病，呈全球流行，危害严重，在我国 10 多个
省份都有过暴发和流行。其中在 1998 年江苏省的南
2000
bp
M 1 2 3
1000
750
500
250
100
M ：DNA 分子量标记（DL2000）；1 ：重组腺病毒的 PCR 产物（MRP）；
2 ：重组腺病毒的 PCR 产物（MRP）；3 ：阴性对照
图 6 重组腺病毒的 PCR 鉴定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期134
此外，利用 IRES 构建多基因共表达载体是重
要的基因共表达方法，较其他方法优势明显［14］，因
此该试验中还引入了 IRES 序列来实现 MRP 和 EF
的共表达。在上游启动子的控制下，由 IRES 串联的
MRP 和 EF 基因可同时转录，并以不依赖帽的方式
启动远端 mRNA 的翻译，进而在同一转录本上翻译
出不同的蛋白，并且翻译过程是独立的，从而保证
了目的基因的独立结构及功能。目前，我们也获得
了大量的重组腺病毒储液，为后续工作奠定了良好
的基础，也为进一步开展猪链球菌 2 型基因工程疫
苗的研制和控制该病的发生提供了较为重要的参考
资料。
4 结论
根据 DNAStar 软件分析设计合成 2 对引物，以
猪链球菌 2 型基因组为模板，选取含有抗原决定簇
肽段的溶菌酶释放蛋白（MRP）和保外因子（EF）
基 因 序 列， 并 用 内 部 核 糖 体 进 入 位 点（internal
ribosomal entry site，IRES）元件连接 MRP 和 EF 基因，
成功构建了 MRP 和 EF 双基因共表达的重组腺病毒
载体。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）