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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
LOH12CR1 由 Montpetit 等［1］于 2002 年在 12 号
染色体短臂上杂合子缺失区域中（D12S89-D12S258）
寻找肿瘤抑制基因时发现并命名的。由于该区域在
多种血液科肿瘤和实体瘤患者存在杂合子缺失的现
象，这高度提示位于此区域中的 LOH12CR1 可能为
抑瘤基因。LOH12CR 基因包含 4 个外显子，可编码
大小分别为 2、1.4、1.7、4.5 和 6.0 kb 的 5 个转录本。
其中以 1.4 kb 转录本的表达丰度为最高，该转录本
CDS 区长度为 585 bp，编码大小为 195 个氨基酸残
基的蛋白质。Northern blot 结果表明 LOH12CR1 在
脑、骨髓、血液、睾丸、前列腺和胎肝等多种组织
中均有表达，同时蛋白同源性分析显示 LOH12CR1
收稿日期 ：2012-10-19
作者简介 ：王永俊，女，博士，主治医师，研究方向 ：消化道肿瘤的发病机制
通讯作者 ：沈宏伟，E-mail ：timonzy@126.com
LOH12CR1 互作蛋白 GPS2 的筛选及鉴定
王永俊1  王迎伟2  施小六1  林若蘅1  张文婷1  沈宏伟1
（1. 中南大学湘雅二医院，长沙 410011 ；2. 柳州市人民医院，柳州 050000）
摘 要 ： 12 号染色体短臂杂合子缺失的现象存在于多种血液科肿瘤和实体瘤患者中，提示此区域中可能存在抑瘤基因，
LOH12CR1 是此区域中已鉴定的基因之一。为探讨 LOH12CR1 的生物学功能，首先采取酵母双杂交系统筛查其互作蛋白，鉴定到
转录调控因子 GPS2 是其互作蛋白。进一步在 HEK293 细胞中运用免疫共沉淀方法证实 GPS2 与 LOH12CR1 在体内存在相互作用 ；
免疫荧光共定位结果显示 GPS2 与 LOH12CR1 在细胞核内存在共定位信号。
关键词 ： LOH12CR1 GPS2 酵母双杂交 蛋白质相互作用 免疫共沉淀
Screening and Identifying of GPS2 ：a Novel Interactive
Protein of LOH12CR1
Wang Yongjun1 Wang Yingwei2 Shi Xiaoliu1 Lin Ruoheng1 Zhang Wenting1 Shen Hongwei1
（1. The Second Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410011 ；
2. The People’s Hospital of Liuzhou City，Liuzhou 050000）
Abstract:  Loss of heterozygosity of the short arm of chromosome 12 is a frequently observed in a wide variety of haematological
malignancies and solid tumours, suggesting the presence of tumour suppressor genes in this region. LOH12CR1 is one of the genes identified
in 12p12. To explore the normal function of LOH1CR12, yeast two-hybrid system was used to screen proteins interacting with LOH1CR12,
and the transcriptional regulator GPS2 was identified as a LOH1CR12- interacting protein. Furthermore, GPS2 was confirmed to interact with
LOH1CR12 in vivo in HEK-293 cell by co-immunoprecipitation, and the co-localization of GPS2 and LOH1CR12 in nucleus was observed by
immunofluorescent co-localization.
Key words:  LOH12CR1 GPS2 Yeast two-hybrid system Interactive protein Co-immunoprecipitation
在进化上高度保守（人、小鼠、果蝇以及秀丽杆线
虫的 LOH12CR1 蛋白具有高度同源）［2］，只与鸟
嘌呤核苷酸交换因子 TRIO 的 spectrin repeats 区域
和 Mekk4 蛋白某区域有一定的同源性，是不属于
任一蛋白家族的“孤儿蛋白”。2006 年，Beausoleil
等［3］在 LKB1 表达缺失的 HeLa 细胞中鉴定到磷酸
化的 LOH12CR1 肽段，而我们在 2008 年利用 GST-
pull down 技术结合免疫沉淀法证明了在哺乳动物细
胞（L-02）中 LOH12CR1 与抑癌蛋白丝氨酸 / 苏氨
酸蛋白激酶 STK11/LKB1 存在互作［4-6］。综上所述可
知 LOH12CR1 可能在细胞生长、增殖，以及癌变过
程中发挥着一定的作用，但由于 LOH12CR1 具体的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期202
生物学功能迄今未知。为了进一步明确其生物学功
能，本研究通过酵母双杂系统筛选到 LOH12CR1 的
互作蛋白 GPS2（G protein pathway suppressor 2），并
在 HEK293 细胞中验证二者直接的相互作用关系，
为研究 LOH12CR1 的功能提供一个新的切入点。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌 DH5α 菌株，HEK293 细胞，pEGFP-
LOH12CR1，pcDNATM3.1/myc-His 空质粒由本实验室
保 存，pCMV-tag2b-GPS2 质 粒 购 于 吉 凯 基 因 公 司。
DNA 抽提及胶回收试剂盒购于上海生工，限制性内
切酶，T4 连接酶购自 TaKaRa 公司，酵母双杂交系
统及 Mate ＆ plateTM Library-human liver 文库均购自
Clontech 公 司。DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle
Medium），FBS（Fetal Bovine Serum） 购 自 GIBCO，
裂解缓冲液（150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，50
mmol/L Tris-HCl（pH7.6），5 mmol/L EDTA，0.1%
SDS，0.5% 脱氧胆酸钠，20 mmol/L N-ethylmaleimide，
加入 40 μL 的 protease inhibitor cocktail），洗涤缓冲
液（300 mmol/L NaCl，0.1%Triton X-100，50 mmol/L
Tris-HCl（pH7.6），5 mmol/L EDTA，加入 40 μL 的 pr-
otease inhibitor cocktail），封闭液（5%BSA/0.1%Triton
X-100/PBS） 为 本 实 验 室 配 制 及 保 存，protease
inhibitor cocktail 购自 BD 公司，抗 myc 鼠单克隆抗
体，抗 flag 兔单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的
二抗，cy3 偶联的山羊抗鼠 IgG，均购自 Sigma 公司，
protein A agarose 购 自 KPL 公 司，ECL 试 剂 盒 购 自
Amerishin biosicences 公司。
1.2 方法
1.2.1 质粒构建 将本实验室保存的 pEGFP-LOH12-
CR1 重组质粒及 pGBKT7、pcDNATM3.1/myc-His 空质
粒分别经 EcoR I 和 Sal I 双酶切后，通过琼脂糖电泳
回收酶切产物，再用 T4 连接酶将酶切产物连接过夜，
以 构 建 pGBKT7-LOH12CR1 和 pcDNATM3.1/myc-His-
LOH12CR1 重组质粒，新的重组质粒经酶切和测序
鉴定。
1.2.2 诱饵蛋白自激活及毒性检测 将 pGBKT7、
pGBKT7-LOH12CR1 质粒分别转化至 Y2H Gold 酵母
感受态细胞中，并取 100 μL 菌液涂于 SD/-Trp、SD/-
Trp/X-α-gal/AbA 培养基平板上，30℃培养 3 d。
1.2.3 酵母双杂交文库筛选与回交试验验证 LOH-
12CR1 相 互 作 用 蛋 白 按 照 Clonetech 公 司 提 供
的操作手册，将人类肝脏 cDNA 文库转化到已含
有 pGBKT7-LOH12CR1 的 Y2H Gold 酵 母 中， 取 菌
液 400 μL 涂于的 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/AbA
培养基平板上，进行 3 轮 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-
α-gal/AbA 平板筛选。将生长良好的蓝色酵母克隆
（直径＞ 2 mm）挑至 3 mL SD/-Leu 液体培养基内，
30℃，250 r/min，摇床过夜。抽提酵母质粒并转化
至大肠杆菌 DH5α 中，利用质粒抗性筛选出阳性克
隆，抽提阳性克隆，并经 Hinfl 酶切，聚丙烯酰胺
凝胶电泳排除相同片段后送上海博尚公司测序，在
GenBank 中进行同源性比对分析获得 LOH12CR1 的
可能互作蛋白 GPS2（G protein pathway suppressor 2）
的候选基因序列。将抽提的 GPS2 质粒与 pGBKT7-
LOH12CR1 质粒共同转化到 Y2H Gold 酵母菌株中
（其中 pGBKT7-lam+ pGADT7-GPS2 质粒为阴性对照，
pGBKT7-P53+pGADT7-SV40T 为阳性对照），取 100
μL 菌 液， 涂 于 SD/-Trp/-Leu 培 养 基 平 板 上，30 ℃
培养 3 d 后从 SD/-Trp/-Leu 平板上挑取生长良好的
蓝色单克隆克隆划线于 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-
gal/AbA 培养基平板上，续培养 3 d。
1.2.4 LOH12CR1 与 GPS2 蛋白免疫共沉淀及 western
blot 检测 质粒转染按照 Lipofectamine2000 操作说
明书进行。HEK293 细胞转染 24 h 后，每个 10 cm
培养皿加 1 mL 的裂解缓冲液冰上裂解 30 min。4℃
离心 30 min 后收上清，取 20 μL 上清用于 Western
印迹用，其余上清全部用于下一步免疫沉淀。
每 1 mL 上清经预吸附后加入 4 μg 相应的单克
隆抗体（沉淀 LOH12CR1 用 myc 单抗，阴性对照组
加入 4 μg 正常小鼠 IgG，沉淀 GPS2 用 flag 单抗，阴
性对照组加入 4 μg 正常兔 IgG）4℃转轱 2 h，再加
入 50 μL Protein G Agarose，4℃ 转 轱 30 min 后， 用
洗涤缓冲液洗 Protein G Agarose 3 次，再离心收集
沉淀，进行 12 %SDS-PAGE 蛋白电泳并把蛋白转至
PVDF 膜，将 PVDF 膜与相应的一抗（抗 flag 单抗
检测 LOH12CR1，flag 单抗检测 GPS2）在室温下孵
育 1 h 后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育 45
min，ECL 试剂盒显影。
2013年第4期 203王永俊等 ：LOH12CR1 互作蛋白 GPS2 的筛选及鉴定
1.2.5 LOH12CR1 与 GPS2 的亚细胞水平定位 HEK-
293 细胞转染 24 h 后，先用丙酮固定细胞，再将固
定好的细胞先后与 flag 单抗和 cy3 偶联的二抗于室
温下孵育 40 min；DAPI 染核，水溶性封片剂封片后，
用激光共聚焦显微镜检测。
2 结果
2.1 诱饵蛋白自激活及毒性检测
为 检 测 pGBKT7-LOH12CR1 诱 饵 蛋 白 的 自 激
活 性 和 毒 性， 将 pGBKT7、pGBKT7-LOH12CR1 质
粒分别转化至 Y2H Gold 酵母细胞，并将菌液涂于
营养缺陷培养基平板上，结果（图 1）显示，含
有 pGBKT7 和 pGBKT7-LOH12CR1 质粒的转化子在
SD/-Trp 培养基平板上均可见白色克隆生长，而 SD/-
Trp/X-α-gal/AbA 培养基平板上则无克隆生长，表明
pGBKT7 和 pGBKT7-LOH12CR1 均 无 自 激 活 性， 且
含 pGBKT7-LOH12CR1 转 化 子 在 平 板 上 所 形 成 的
克隆大小与 pGBKT7 质粒相比无明显差别，说明
pGBKT7-LOH12CR1 质粒所编码的 LOH12CR1 蛋白
a b
a ：含 pGBKT7 质粒的转化子在 SD/-Trp/X-α-gal/AbA（左）和 SD/-Trp（右）培养基平板上生长图 ；b ：含 pGBKT7-LOH12CR1 质粒的转化子
在 SD/-Trp/X-α-gal/AbA（左）和 SD/-Trp（右）培养基平板上生长图
图 1 诱饵蛋白自激活及毒性检测
对酵母菌株无毒性作用，可用于下一步的试验。
2.2 酵母双杂交系统筛选并验证LOH12CR1与
GPS2蛋白的相互作用
将人类肝脏 cDNA 文库转化到已含有 pGBKT7-
LOH12CR1 的 Y2H Gold 酵母中，经蓝斑和高强度
营养缺陷筛选后，再通过酶切和测序相结合的方
法，并加以生物信息学分析，从而获得 5 个可能
与 LOH12CR1 互作的蛋白基因序列，其中之一即为
GPS2。在 LOH12CR1 与 GPS 的回交验证试验中，只
有 pGBKT7-LOH12CR1 和 pGADT7-GPS2 质粒共转的
转 化 子，pGBKT7-P53 和 pGADT7-SV40T 质 粒 共 转
的转化子在高强度营养缺陷筛选培养基平板上出现
生长良好的蓝色克隆（直径＞ 2 mm），而 pGBKT7-
lam 和 pGADT7-GPS2 质粒共转的转化子则无克隆生
长（图 2），说明由 pGBKT7-LOH12CR 质粒编码的
LOH12CR1 蛋白与 pGADT7-GPS2 质粒编码的 GPS2
蛋白在酵母细胞中存在着直接的相互作用。
2.3 LOH12CR1与GPS2免疫共沉淀结果
pcDNATM3.1/myc-His、pCMV-tag2B-GPS2 共
转对照组的细胞裂解液用抗 myc 单抗免疫沉淀再
用 flag 单 抗 免 疫 印 迹（ 图 3-A），pcDNATM3.1/myc-
His-LOH12CR1、pCMV-tag2B 共转对照组的细胞裂
解液用抗 flag 单抗免疫沉淀再用抗 myc 单抗免疫印
迹（图 3-B），均未检测到任何特异的蛋白带。而
pcDNATM3.1/myc-His-LOH12CR1、pCMV-tag2B-GPS2
共转试验组的全细胞裂解液经抗 myc 单抗免疫沉淀
后，用抗 flag 单抗免疫印迹可检测到一条大小约 36
kD 的 flag-GPS2 融合蛋白带，经抗 flag 单抗免疫沉
淀后，用抗 myc 单抗免疫印迹可检测到一条大小约
19 kD 的 myc-LOH12CR1 融合蛋白带，这说明试验
组 Co-IP 的阳性结果不是由抗 GFP 单抗或抗 flag 单
抗在 IP 过程中的非特异性反应所致 ；pcDNATM3.1/
myc-His-LOH12CR1、pCMV-tag2B-GPS2 共转试验组
的细胞裂解液用正常小鼠 / 兔 IgG 免疫沉淀后用 flag
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期204
单抗（图 3-A）/myc 单抗（图 3-B）免疫印迹均未检
测到任何特异的蛋白带，说明试验组 Co-IP 的阳性
结果不是由小鼠 / 兔 IgG 的非特异性反应所致。因此，
上述结果说明 LOH12CR1 与 GPS2 蛋白之间存在哺
乳动物细胞内存在相互作用。
pGBKT7-P53+
pADR7-SV40
pGBKT7-
lam+37
pGBKT7-
lam+89
pGBKT7-
lam+85
pGBKT7-
LOH+85
pGBKT7-
LOH+89
pGBK
T7-LOH
+37
a b c
a ：酵母双杂交系统文库筛选图 ；b ：酵母双杂交系统回交试验图 ；c ：回交试验中所用的共转质粒注明图
图 2 酵母双杂系统验证 LOH12CR1 与 GPS2 相互作用的结果图
+ + + + + +
western blotting: anti-myc
western blotting: anti-flagA
B
pCMV-tag2B-GPS2
pcDNA3.1/myc-His-LOG12CR1
pcDNATM33.1/myc-His
pCMV-tag2B-GPS2
pcDNA3.1/myc-His-LOG12CR1
pcMV-tag2B
lysate IP:anti-myc IP:IgG
lysate IP:anti-myc IP:IgG
36 kD
19 kD
+  + + + +  +   + 
+ + + + + +
+  + +  +  +   + 
图 3 LOH12CR1 与 GPS2 蛋白免疫沉淀及
Western blotting 的结果
2.4 免疫荧光共定位结果
用激光共聚焦显微镜可观察到用 cy3 标记发红
色荧光的 flag-GPS2 融合蛋白主要集中于细胞核中，
且胞浆中亦有少量分布（图 4-A），而绿色荧光蛋白
GFP-LOH12CR1 在胞核和胞浆中均有分布（图 4-B），
且在经 DPAI 染色后发蓝色荧光的胞核区域（图 4-C）
与 flag-GPS2 的红色荧光叠加而呈现黄色荧光（图 4-
D 白 色 箭 头 所 指 处 ）， 此 结 果 说 明 LOH12CR1 与
GPS2 蛋白存在着亚细胞水平共定位。
3 讨论
我们利用酵母双杂系统在人类肝细胞 cDNA 文
0 10μm 0 10μm
0 10μm 0 10μm
A B
C D
图 4 激光共聚焦检测 LOH12CR1 与 GPS2 细胞亚
水平共定位结果
库中筛选了多个与 LOH12CR1 互作蛋白，其中之一
即为 GPS2。GPS2 由 327 个氨基酸残基组成，分子
量大小约为 37 kD，是作为酿酒酵母信息素反馈通路
中 G 蛋白亚单位激活域的一种突变蛋白而被发现［7］。
目前研究发现 GPS2 不但是转录调控蛋白，而且参与
了包括细胞周期，新陈代谢，DNA 修复，细胞骨架
构建等了多个细胞通路的调节。首先 GPS2 不但可抑
制 MAPK 信号通路，而且可通过 NCOR1-HDAC3 抑
制 JNK1 的激活，并且在染色体水平对基因表达进行
抑制［8，9］。其次，正常睾丸组织中的 GPS2 表达明显
高于睾丸癌组织，表明 GPS2 是抑癌蛋白。而 HPV
2013年第4期 205王永俊等 ：LOH12CR1 互作蛋白 GPS2 的筛选及鉴定
E6 蛋白引起的 GPS2 失活是导致细胞癌变的重要途
径［10，11］。且在 U2OS 细胞中过表达 GPS2 能增加抑
癌基因 P53 转录，导致 U2OSG1 期阻滞。使该细胞
对紫外线诱导的凋亡敏感性增加［12］。再者，GPS2
与复合物 HMSH4 和 HMSH5 结合与线粒体 DNA 修
复相关［13］。因此，GPS2 是细胞增殖，凋亡，癌变
过程中的重要调节子，而利用酵母双杂系统证实
LOH12CR1 与 GPS2 的互作关系，为研究 LOH12CR1
是否参与了 GPS2 的调节作用提供了新的线索。
为了进一步证实 LOH12CR1 与 GPS2 之间的相
互作用，我们利用免疫共沉淀结合 Western bloting
在哺乳动物细胞中验证了 LOH12CR 和 GPS2 之间的
互作关系，且由于 LOH12CR1 和 GPS2 蛋白互作关
系是在酵母双杂系统中发现，并在 HEK293 细胞中
得到验证的，因此说明 LOH12CR1 与 GPS2 互作是
特异的，且提示这两种蛋白之间是存在着直接的互
作关系，而不需要中间蛋白的参与。在 LOH12CR1
和 GPS2 亚细胞水平共定位试验中，我们观察到过
表达的 LOH12CR1 在 HEK293 细胞的胞浆和胞核中
均有分布，但主要还是集中在胞浆，而 GPS2 主要
分布在细胞核内，在胞浆亦中有少量分布［14］。激
光共聚焦显示二者的细胞亚水平共定位区域主要集
中在胞核中，而由于 GPS2 本身就是一种核转录调
控蛋白，因此提示 LOH12CR1 与 GPS2 互作后可能
参与了基因转录调控的过程。但究竟 LOH12CR1 和
GPS2 的相互作用模式是什么，以及它们的相互作用
对基因转录，细胞增殖和癌变等方面将产生何种影
响现在仍不清楚，我们期待进行后续研究以回答这
些问题。
4 结论
核转录调节因子 GPS2 为蛋白 LOH12CR1 的互
作蛋白，且二者存在着直接的互作关系，而这种互
作关系可能与基因转录调控有关。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）