全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(12):81-90
随着测序技术的不断发展，我们获得越来越多
的遗传信息。研究人员试图通过对特定靶向基因的
破坏或敲除来研究它们的相关功能。与传统基因打
靶技术相比，新型基因组编辑技术应用范围更广、
作用效率更高、所需成本更低，可用于模式动物构建、
基因功能研究、基因治疗等方面。
收稿日期 ：2015-03-18
基金项目 ：国家自然科学基金面上项目（31371346）
作者简介 ：魏迪，女，硕士研究生，研究方向 ：遗传学研究新技术与新方法 ；E-mail ：18311012326@163.com
通讯作者 ：聂凌云，女，博士，研究方向 ：遗传学研究新技术与新方法 ；E-mail ：nielingyun@126.com
一种检测线粒体核酸酶靶向剪切活性的新方法
魏迪1，2  高敬1，2  池振奋3  张癸荣1，2  聂凌云1，2
（1. 河北北方学院，张家口 075000 ；2. 中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所，北京 100071 ；
3. 中国科学院北京基因组研究所，北京 100101）
摘 要 ： 旨在建立一种简便检测线粒体 DNA（mtDNA）核酸酶靶向剪切活性的方法。利用转基因技术，将一段含有两个靶
向目标序列（T1、T2）的线粒体 DNA 序列随机整合到宿主基因组中，通过实时荧光定量 PCR 筛选单拷贝或低拷贝的单克隆转基
因细胞株。将含有 T1、T2 的 CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9 质粒分别瞬时转染到所选细胞株中，
靶向剪切核基因组，在靶向目标序列处造成 DNA 双链断裂，引发非同源末端连接修复机制，引入插入或缺失突变。观察测序峰图，
证明两个靶向目标序列 T1、T2 均有剪切效率，且 T1 高于 T2。建立了一种高效快速检测线粒体核酸酶靶向剪切活性的新方法。
关键词 ： 线粒体核酸酶 ；转基因细胞株 ；靶向修饰 ；CRISPR/Cas9 ；实时荧光定量 PCR
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.012
A Novel Method for Detecting Activity of Mitochondria-targeted
Nuclease
Wei Di1，2 Gao Jing1，2 Chi Zhenfen3 Zhang Guirong1，2 Nie Lingyun1，2
（1. Hebei North University，Zhangjiakou 075000 ；2. Institute for Drug and Instrument Control，Health Department，the General Logistics
Department of People’s Liberation Army，Beijing 100071 ；3. Beijing Institute of Genomics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101）
Abstract: Mitochondrial DNA（mtDNA）mutation has been associated with human mitochondrial disease. The precise correction of
mutated mtDNA is considered an important strategy of mitochondrial therapy. Due to the lack of the complete repair system of DNA damage,
a convenient method for detecting activity of mitochondria-targeted nuclease needs to be innovated urgently. Using transgenic technology, a
mitochondrial DNA containing two target sequences（T1 and T2）was integrated into host genome randomly. Single or low copy monoclonal
transgenic cell lines were selected by real-time fluorescence quantitative PCR. The two CRISPR（clustered regularly interspaced short
palindromic repeats）/Cas9 plasmids, which contained T1 and T2 target sequences, were transiently transfected into selected copy monoclonal
transgenic cell lines. Target DNA double-strand breaks were caused by CRISPR/Cas9, followed by DNA insertion and deletion mutation via
non-homologous end joining repair pathway. The cutting activities of two target sequences were proved by DNA sequencing peaks diagram, it
was proved that two target sequences of T1 and T2 had the cutting activity, furthermore, T1 was better than T2. A novel method for rapidly and
efficiently detecting activity of mitochondria-targeted nuclease is established.
Key words: mitochondria-targeted nuclease ；transgenic cell line ；targeted modification ；CRISPR/Cas9 ；real-time fluorescence
quantitative PCR
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1282
目前，常用的基因组编辑技术主要包括以下 3
种 ：锌 指 蛋 白（Zinc finger proteins，ZFPs） 技 术、
转录激活因子样效应因子（Transcription activator-like
effectors，TALEs） 技 术、CRISPR（Clustered regula-
rly interspaced short palindromic repeats）技术。它们的
大致原理都是通过造成靶向 DNA 双链断裂（double-
strand breaks，DSBs），引发细胞内固有的非同源末
端连接（Nonhomologous end joining，NHEJ）［1］或同
源重组（Homology-directed repair，HDR）［2］两种修
复机制对 DSBs 处进行修复，从而实现基因的定点
敲除、敲入或缺失。3 种技术在具体操作方式上又
有所不同。
锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）与转
录激活子样效应因子核酸酶（Transcription activator-
like effector nulease，TALEN）这两种人工核酸内切
酶，均由 DNA 识别域与非特异性核酸内切酶 Fok I
融合而成。其中，ZFN 的锌指模块识别三联体碱基，
在序列的识别上灵活性小，设计成本昂贵、技术被
少数公司垄断，这些都限制了它的发展［3］。TALEN
在结构上较之 ZFN 更加优化。其 DNA 结合域中的
各单元可与靶向目标序列一一对应，组装更为简单，
特异性更高。2013 年，一种源自细菌适应性免疫系
统的 CRISPR/Cas9 的出现，为基因靶向修饰领域带
来了巨大变革。主要原理 ：向导 RNA（guide RNA，
gRNA）与 Cas9 核酸酶形成的复合物，在 gRNA 指
导下与靶向目标序列结合，由靶向目标序列下游的
原型间隔序列相邻基序（Protospacer adjacent motifs，
PAM）激活 Cas9 核酸酶［4］，使其对 PAM 上游 3 nt
处剪切造成 DSBs。该系统较之前两种，应用范围更
广、作用效率更高、使用成本更低，经过短短两年
的发展，已被用于世界各地的实验室［5］。
线粒体是存在于大多数真核生物细胞中的细胞
器，有“细胞中的能量工厂”之称。它主要通过氧
化磷酸化以三羧酸循环腺苷（ATP）的形式为细胞
活动提供能量。同时，还参与诸如铁硫簇的生物合
成、钙稳态调节［6］、细胞分化、细胞信息传递和
细胞凋亡［7］等过程，并且拥有调控细胞生长和细
胞周期的能力。线粒体基因组，又称线粒体 DNA
（mtDNA）。长度一般为几万至数十万碱基对，人类
mtDNA 为 16 569 bp，共编码 2 个 rRNA、13 个多肽、
22 个 tRNA。基因排列紧凑，除与 mtDNA 复制及转
录有关的一小段区域外，无内含子序列［8］。mtDNA
表现为母系遗传，突变率高，是细胞核内 DNA 的
10 倍左右。且 mtDNA 突变是导致人类线粒体遗传
病及衰老性疾病的重要原因之一。研究表明，它与
衰老及神经退行性病变如阿尔茨海默症、帕金森氏
病等老年化疾病有关，同时也与肿瘤的形成密切相
关［9］。截至目前，已鉴定出超过 500 多个致病性突
变来自 mtDNA。而针对 mtDNA 致病性突变的精确
改造能力则相对缺乏［10］。
随 着 Minczuk 等［11，12］ 将 ZFN 作 用 于 mtDNA，
Bacman 等［13］首次将 TALEN 用于清除病人线粒体
内的突变型 mtDNA。这两种基于 ZFPs 技术、TALEs
技术的线粒体核酸酶都为更好的进行线粒体功能研
究、线粒体遗传病的治疗等提供了可能。此外，本
实验室也基于人工 CRISPR/Cas9 系统独特地构建了
作用于 mtDNA 的 mtCRISPR/Cas9 系统（结果未发表）。
任何一种基因组编辑技术，它的靶向剪切效
率、切割特异性等问题不可回避。由于核基因组中
的 DNA 损伤修复系统比较完整，当发生 DSBs 时，
可通过 NHEJ 修复在靶向目标序列处引入插入或缺
失突变。因此，改造核基因组的相关基因组编辑技
术可通过错配酶法、靶向目标序列直接 PCR 后 TA
克隆测序或观察靶向目标序列测序峰图等方法鉴定。
而相应的线粒体基因组编辑工具，由于线粒体缺乏
完善的 DNA 损伤修复系统［14-16］，修复能力较弱，
无法通过上述方法检测。
因此，本研究利用转基因技术，将一段含有靶
向目标序列的 mtDNA 序列随机整合到宿主基因组
中，获得转基因细胞株。通过相应的核基因组编辑
技术靶向剪切该细胞株的核基因组，对靶向目标序
列处造成 DSBs 引发 NHEJ 修复。观察靶向目标序列
测序峰图，鉴定 mtDNA 的靶向目标序列剪切活性。
建立了一种检测线粒体核酸酶靶向剪切活性的新
方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验用载体及细胞株 所用载体为哺乳动
物 细 胞 表 达 载 体 pEGFP-N1， 带 EGFP 标 签， 购
2015,31(12) 83魏迪等：一种检测线粒体核酸酶靶向剪切活性的新方法
自 Clontech 公 司。 所 用 细 胞 株 为 人 肾 上 皮 细 胞
HEK293，培养条件 ：DMEM+10%FBS。
1.1.2 主要药品及试剂 DL2 000 DNA Marker、dN-
TP、RNase A、T4 DNA Ligase、LA Taq、SYBR premix
Ex Taq 等均购自 TaKaRa 公司。胶回收试剂盒、质
粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒均购自天根生化
科技（北京）有限公司。引物由生工生物工程（上海）
股份有限公司合成，测序由北京六合华大基因科技
股份有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 pEGFP-mtDNA 转基因单克隆细胞株的获得
1.2.1.1 pEGFP-mtDNA 重 组 克 隆 质 粒 的 构 建 以
pEGFP-N1 为载体，将一段同时含有两个靶向目标序
列（T1、T2）的 mtDNA 序列与 EGFP 的 N 端融合，
除去 EGFP 前的起始密码子 ATG，最终得到重组克
隆质粒 ：pEGFP-mtDNA。
具 体 步 骤 如 下 ：（1） 以 HEK293 细 胞 基 因 组
DNA 为 模 板， 用 CL-F1/CL-R1 引 物 对 进 行 PCR 扩
增（335 bp），胶回收后得产物 J ；（2）以产物 J 为
模 板， 用 CL-F2/CL-R2（CL-F2 带 有 flag 标 签， 如
表 1 横 线 部 分 所 示 ） 引 物 对 进 行 PCR 扩 增（167
bp），胶回收后得产物 K ；（3）以产物 K 为模板，
用 CL-F3/CL-R3（CL-F3 带有 Nhe I 酶切位点和 flag
标签、CL-R3 带有 Age I 酶切位点，如表 1 相应下
划线、下划线斜体部分所示）引物对进行 PCR 扩
增（194 bp），得产物 L ；（4）对纯化后的产物 L 及
pEGFP-N1 质粒做 Nhe I/Age I 双酶切，分别以此为插
入片段及载体进行连接、转化、挑单克隆鉴定、鉴
定正确样品测序 ；（5）以上一步骤中的正确质粒为
模板，用 CL-F4/CL-R4 引物对（CL-F4 带有 Age I 酶
切位点，如表 1 横线斜体部分所示 ；删去 EGFP 起
始密码子 ATG，添加一个碱基 C 调整编码框，该碱
基的选择应避免引入终止密码子）进行 PCR 扩增
（902 bp），得产物 M ；（6）对纯化后的产物 M 及上
一步骤所用质粒做 Age I/Not I 双酶切，分别以此为
插入片段及载体进行连接、转化、挑单克隆鉴定、
鉴定正确样品测序，即得最终质粒 ：pEGFP-mtDNA
（图 1）。
表 1 pEGFP-mtDNA 重组克隆质粒构建相关引物
引物名称 引物序列（5-3）
CL-F1 ATGCCCCTCATTTACATAAATAT
CL-R1
GGGAGTATAGGGCTGTGACTAGTATGTTGAGTCCTGT-
AAGTGCATTGGAGTAGGTTTAG
CL-F2
GACTACAAGGACGACGATGACAAGCTACTAGTCTCA-
ATCTCCAACACATA
CL-R2
TGAGTGAGCCCCATTGTGTTGTGGTAAATATGTAGAG-
GGAGTATAGGGCTGTG
CL-F3
CTAGCTAGCGCCACCATGGACTACAAGGACGACGAT-
GACAAG
CL-R3 ACGACCGGTTGAGTGAGCCCCATTGTGT
CL-F4 ACGACCGGTCGTGAGCAAGGGCGAGGAG
CL-R4 TTTGTGATGCTATTGCTTTATTTG
1.2.1.2 阳性单克隆细胞株初筛 将 pEGFP-mtDNA
瞬时转染到培养于 60 mm 细胞培养皿的 HEK293 细
胞中，24 h 后，将细胞传代至 10 cm 培养皿中继续
培养，加 800 μg/mL 的 G418 筛选，每隔 3-4 d 换液
一次。培养至细胞不再大批量死亡，且形成单克隆
细胞团后，挑单克隆于 24 孔板。对含有绿色荧光的
单克隆细胞，收取细胞提基因组进行 PCR 鉴定。根
据 pEGFP-mtDNA 序列，分别设计 3 对引物 P1（P1-
F/P1-R）、P2（P2-F/P2-R）、P3（P3-F/P3-R）（表 2），
3 对引物均可扩增出目的条带的细胞，则为阳性单
克隆细胞株。
1.2.2 绝对定量 PCR 检测外源基因拷贝数
1.2.2.1 实 时 荧 光 定 量 PCR 反 应 总 体 系 20 μL
表 2 常规 PCR 初筛阳性单克隆细胞株相关引物
引物名称 引物序列（5-3） 扩增范围及大小（bp）
P1-F ATGTTCCCATAGTAACGCCAA
GGGTCTTGTAGTTGCCGTCG
CMV 部分 +mtDNA 靶向目标序列 +EGFP 部分 967
P1-R
P2-F GATTTCCAAGTCTCCACCCC
TCACTTGTACAGCTCGTCCATG
CMV 小部分 +mtDNA 靶向目标序列 +EGFP1 074
P2-R
P3-F ATGGACTACAAGGACGACGATG
TTTGTGATGCTATTGCTTTATTTG
mtDNA 靶向目标序列 +EGFP+poly A 部分 1 069
P3-R
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1284
（ 上 / 下 游 引 物 各 0.5 μL、ddH2O 9 μL、2×SYBR
premix Ex Taq 10 μL）。PCR反应程序 ：95℃ 3 min ；
95℃ 15 S、60℃ 30 S（40 个循环），熔解曲线 60-
95℃，每个样品做 3 次重复。
1.2.2.2 标准曲线的建立 将 pEGFP-mtDNA 质粒与
HEK293 细胞基因组 DNA 混合，设置分别含有 1、2、4、
8 和 16 个外源基因拷贝数的标准品对照。具体方法
如下 ：假设含有外源基因片段的质粒大小为 a bp，
HEK293 细胞基因组 DNA 用量为 b ng，大小为 3×109
bp。外源基因片段完全随机的头尾相连的插入在一
条染色体上，则 b ng 的基因组 DNA 中含有一个外
源基因拷贝数的质量为 ：a×b×0.5/3×109 ng。设计
特异性扩增外源基因序列的引物对 RT-F/RT-R，以
β-actin 为内参的引物对 Actin-F/Actin-R（表 3）。将
外源基因片段扩增的 CtpEGFP-mtDNA 值减去内参扩增的
CtActin 值，得△ Ct，再对样品拷贝数的对数值（以 2
为底）作图得绝对定量标准曲线。
表 3 绝对定量 PCR 检测外源基因拷贝数相关引物
引物名称 引物序列（5-3） 扩增大小（bp）
RT-F CACAGCCCTATACTCCCTCTACAT
127
RT-R TTACGTCGCCGTCCAGC
Actin-F AACGGTGAAGGTGACAGCAGT
130
Actin-R CTTCCTGTAACAACGCATCTCATA
1.2.3 靶向目标序列剪切活性检测 构建含有相应
mtDNA 靶向目标序列的 CRISPR/Cas9 质粒。将该质
粒瞬时转染到所选阳性单克隆细胞株中。48-72 h 后，
收取细胞提基因组 DNA，用 1.2.1.2 所述 P1 引物对
进行 PCR 扩增。扩增产物送样测序，测序引物为
P1-R。如果靶向目标序列在核基因组中发生 DSBs，
则会引发细胞中的 NHEJ 修复机制，得到插入或缺
失突变。而对样品全基因组 DNA 进行 PCR 扩增所
得的扩增产物为混合产物，其中既含有野生型的原
始靶向目标序列，也含有引入插入或缺失的突变型
靶向目标序列。因此，使用 Chromas 软件显示测序
峰图，查看对应靶向剪切位置处是否有套峰出现，
如有套峰，则证明靶向目标序列有剪切活性，反之
则无。此外，还可根据套峰强弱判断该系统对靶向
目标序列的剪切效率。
2 结果
2.1 获得阳性单克隆细胞株
2.1.1 构建 pEGFP-mtDNA 重组克隆质粒 pEGFP-
N1 为真核表达载体，含有 EGFP 基因和 neo 抗性
基因。将一段含有两个靶向目标序列（T1、T2）的
mtDNA 序 列， 通 过 1.2.1.1 所 述 方 法 与 EGFP 基 因
融合得到测序正确的重组克隆质粒 pEGFP-mtDNA
（图 1）。该质粒瞬时转染到 HEK293 细胞中，24 h
后观察 EGFP 表达情况，转染效率达 95% 以上（图
2-A）。
2.1.2 初 筛 阳 性 单 克 隆 细 胞 株 将 鉴 定 正 确 的
pEGFP-mtDNA 重组克隆质粒瞬时转染到 HEK293 细
胞中（图 2-A），24 h 后细胞传代，并用 G418 筛选。
当有大批量未转入质粒的细胞死亡后，及时换液。
药筛至细胞不再大量死亡，且形成单克隆细胞团时，
挑单克隆于 24 孔板中。对含有绿色荧光的 11 个单
克隆细胞，收细胞提基因组。分别用 3 个引物对 P1
（P1-F/P1-R）、P2（P2-F/P2-R）、P3（P3-F/P3-R） 对
单克隆细胞所提基因组进行 PCR 鉴定，3 对引物均
可扩增出目的条带的细胞，则为阳性单克隆细胞株，
结果如图 2-B 所示，单克隆细胞株 2#、3#、5#、8#、
10# 为阳性单克隆细胞株。
2.2 检测外源基因拷贝数
2.2.1 建 立 标 准 曲 线 将 pEGFP-mtDNA 质 粒 与
HEK293 细胞基因组 DNA 混合，设置分别含有 1、2、
4、8 和 16 个外源基因拷贝数的标准品对照，用 RT-
F/RT-R 引物对扩增外源基因片段，Actin-F/Actin-R
引物对扩增内参 β-actin，每个反应重复 3 次，取平
均 Ct 值。其中，特异性引物对 RT-F/RT-R 的扩增
曲线、熔解曲线如图 3-A 所示，内参引物对 Actin-
F/Actin-R 的扩增曲线、熔解曲线如图 3-B 所示，两
个熔解曲线均在 86℃附近有且只有一个单峰，证
明两引物对均为特异性扩增。将 RT-F/RT-R 扩增
的 CtpEGFP-mtDNA 减去 Actin-F/Actin-R 扩增的 CtActin，得
△Ct。△Ct 与样品拷贝数的对数值（log2N）作图得
到标准曲线（图 3-C），Log2N= -1.177 2△Ct+2.779 3，
决定系数 R2=0.997 1。
2.2.2 检 测 阳 性 单 克 隆 细 胞 株 的 外 源 基 因 拷 贝
数 提取阳性单克隆细胞株 2#、3#、5#、8#、10#
2015,31(12) 85魏迪等：一种检测线粒体核酸酶靶向剪切活性的新方法
基因组，并以此为模板做实时荧光定量 PCR。将这
5 个细胞株的△Ct 分别带入计算公式 ：Log2N= -1.177
2△Ct+2.779 3，得其对应的拷贝数（N），标准差在
0.935 1 和 0.138 7 之间，结果可信。具体拷贝数检
测结果如表 4 所示。
2.3 靶向目标序列剪切活性检测
构建分别含有 mtDNA 靶向目标序列 T1、T2 的
两 个 CRISPR/Cas9 质 粒， 命 名 为 CRISPR/Cas9-T1、
CRISPR/Cas9-T2。将 CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-
T2 和相应不含 T1、T2 靶向目标序列的 CRISPR/Cas9
空骨架质粒（Control-T1、Control-T2）分别瞬时转
染到 pEGFP-mtDNA 阳性单克隆细胞株 10# 中。48
h 后，收取细胞提基因组 DNA，用 1.2.1.2 所述 P1
引物对进行 PCR 扩增，扩增产物送样测序。测序
结果表明，阴性对照 Control-T1、Control-T2 在靶向
目标序列处均无套峰出现（图 4-B），而作用质粒
CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-T2 在靶向目标序列
处均有套峰出现，且 CRISPR/Cas9-T1 处的套峰强于
CRISPR/Cas9-T2 处（图 4-A）。
3 讨论
基因组编辑技术，是研究相关基因功能的重要
手段。作为三大基因组编辑技术之一的 CRISPR/Cas9
系统，自 2012 年首次描述其对 DNA 的基本编辑能
力后［17］，经短短几年发展，已取得丰硕研究成果。
它不仅可以编辑 DNA 用于构建癌症模型［18］、清除
人类感染细胞中的 HIV［19］、阻止杜氏营养不良小鼠
T1 T2
mtDNA
CMV
MCS
EGFP
pEGFP-N1Vector pEGFP-mtDNAਜ਼ATG
pEGFP-mtDNAਜ਼ATG, Vector InsertEGFPнਜ਼ATGpEGFP-mtDNA
CMV EGFP
A
B
NheI
AgeI
AgeI
AgeI-
NotI
-NotI
CL-F1/CL-R1
CL-F2/CL-R2
CL-F3/CL-R3
CL-F4/CL-R4
Insert T1T1flagNheI- -AgeIT2
T1 T2
A：pEGFP-mtDNA 重组克隆质粒的构建流程图，其中，红色方块表示 mtDNA 靶向目标序列 T1、T2，蓝色方块表示 flag 标签；B：
pEGFP-mtDNA 重组克隆质粒中外源基因表达模块示意图，其中，红色部分表示 mtDNA 靶向目标序列 T1、T2，蓝色部分表示
flag 标签，黄色部分表示 T1、T2 分别对应的原型间隔序列相邻基序（Protospacer adjacent motifs，PAM），绿色部分表示 EGFP
图 1 pEGFP-mtDNA 重组克隆质粒的构建
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1286
模型中的肌肉退化［20］等，还可以编辑 RNA［21］，为
更好的研究 RNA 功能提供了可能。目前的基因组编
辑技术，大多只能改造核基因组，而很多人类遗传
病是由于线粒体基因组突变所引起。mtDNA 突变通
常是异质性的，只有当 mtDNA 突变型占总 mtDNA
数量 80% 以上时，才会引起疾病症状［22］。在此之
前，Minczuk 和 Bacman 等［11-13］ 已 分 别 将 ZFN 和
TALEN 两种人工核酸酶用于清除人类线粒体内的突
变型 mtDNA，本实验室也基于人工 CRISPR/Cas9 系
统独特地构建了作用于 mtDNA 的 mtCRISPR/Cas9 系
统（结果未发表）。这 3 种经改造后用于线粒体基因
组编辑的线粒体核酸酶，同样面临着如何检测靶向
剪切活性的问题。
对于核基因组编辑技术而言，由于核基因组中
的 DNA 损伤修复系统比较完整，可在 DSBs 处通过
NHEJ 修复引入插入或缺失突变。因此，其检测方法
主要有 ：（1）对靶向目标序列进行 PCR 扩增，扩增
产物经变性、退火后形成错配，通过错配酶剪切不
完全匹配的 DNA 序列，验证靶向目标序列剪切活性；
（2）对靶向目标序列进行 PCR 扩增后，通过 TA 克
隆测序与理论序列比对验证靶向目标序列剪切活性；
（3）对靶向目标序列进行 PCR 扩增后，扩增产物直
接测序，通过观察靶位点处的套峰情况验证靶向目
标序列剪切活性。而线粒体对 DNA 的损伤修复能力
较弱，无法通过上述方法检测。本研究构建了一个
核基因组中含有单拷贝或低拷贝 mtDNA 靶向目标序
列的转基因细胞系，利用相应核基因组编辑技术靶
向剪切该细胞株的核基因组，通过上述第 3 种方法
观察靶向目标序列测序峰图鉴定剪切活性，该法简
洁明了。
首先，在构建重组克隆质粒时，可以如图 1-A
所示，将一段含有一个或若干 mtDNA 靶向目标序列
的串联序列连入克隆载体质粒中，同时检测多个靶
向目标序列的剪切活性。在外源基因与 EGFP 基因
融合时要注意是否需调整编码框、是否引入了起始
密码子或终止密码子等问题。其次，在筛选阳性单
克隆细胞株时，通过设计的 3 对扩增范围涵盖启动
子区、编码区、终止区的特异性引物对的同时鉴定，
既保证了筛选结果的准确性，又确保了外源基因能
够完整表达。经过药物筛选得到的阳性单克隆细胞
株，其外源基因往往随机整合在染色体上。因此，
在获得阳性单克隆细胞株后，通过检测其外源基因
拷贝数，筛选单拷贝或低拷贝的阳性单克隆细胞株，
是有效鉴定靶向目标序列剪切活性的关键步骤。
目 前， 检 测 外 源 基 因 拷 贝 数 的 方 法 主 要 有
Southern blot 法 和 实 时 荧 光 定 量 PCR 法。Southern
blot 法为传统外源基因拷贝数检测法，实时荧光定
量 PCR 法为近年来新兴技术。通过比较，两种方
法在检测外源基因拷贝数的准确性上结果十分接
近［23，24］。 与 Southern blot 法 相 比， 实 时 荧 光 定 量
PCR 法起始模板量小、灵敏性高、简单高效、成本
较低、不需要进行放射性实验［25，26］，该方法足以满
足本研究的筛选需要。在筛选得到的单拷贝或低拷
贝阳性单克隆细胞株中，瞬时转染定量的人工核酸
酶后，可通过测序峰图鉴定靶向目标序列剪切活性
更加清晰，减少背景干扰。
此外，利用实时荧光定量 PCR 法建立了检测转
基因细胞株中外源基因拷贝数的实验体系。由于使
用的 SYBR Green I 染料可广泛嵌合在 DNA 双链中，
M
2000
bp
B
A
1000
2000
1000
2000
1000
1# 2# 3# 4# 5# 6# 7# 8#
P1
P2
P3
9# 10# 11#
A ：pEGFP-mtDNA 瞬时转染到 HEK293 细胞 24 h 后，转染效率 95% 以上 ；
B ：单克隆细胞株 PCR 鉴定结果
图 2 阳性单克隆细胞株的筛选
2015,31(12) 87魏迪等：一种检测线粒体核酸酶靶向剪切活性的新方法
因此，引物的特异性尤为重要。设计引物时，尽量
避免引物二聚体、引物发卡结构等对结果的干扰，
并通过熔解曲线鉴定扩增产物是否特异。如图 3-A、
3-B 所示，本研究设计的内参引物对与外源基因检
测引物对的扩增曲线、熔解曲线均在 86℃附近有
且只有一个单峰，两引物对均为特异性扩增。且两
引物对的目的片段大小相近（分别为 130 bp 和 127
bp），Tm 值基本相等，扩增效率基本相同。由于实
时荧光定量 PCR 所需起始模板量小、检测灵敏，在
实验设计中每个样品均做 3 个重复，每个实验重复
3 次。以上措施更加保证了检测结果的真实可信。
当然，验证 mtDNA 靶向目标序列剪切活性的
方法并不单一。如 Bacman 等［13］在酵母菌中利用
3000
Amplification
2000
R
FU
1000
0
0 10 20
Cycles
30 40
3000
3500
2500
1500
500
Amplification
2000
R
FU
1000
0
0 10 20
Cycles
30 40
300
400 Melt Peak
200
-d
RFU/dT
100
0
65 70 80
Temperature, Celsius
908575 95
300
Melt Peak
200
-d
RFU/dT
100
0
Temperature, Celsius
65 70 80 908575 95
4.0
3.0
2.0
Lo
g 2
N
1.0
0
-1.5 -1 -0.5 0 0.5
△Ct
1 1.5 2 2.5
0.5
1.5
2.5
3.5
A
B
C
A ：特异性引物对 RT-F/RT-R 的扩增曲线与熔解曲线 ；B ：内参引物对 Actin-F/Actin-R 的扩增曲线与熔解曲线 ；
C ：△ Ct 与拷贝数的对数值（log2N）作图得标准曲线，Log2N= -1.177 2 △ Ct+2.779 3（R
2=0.997 1）
图 3 绝对定量 PCR 检测外源基因拷贝数
表 4 阳性单克隆细胞株的外源基因拷贝数检测
克隆编号 拷贝数（N ± S）
2# 2.08±0.935 1
3# 1.39±0.668 0
5# 1.36±0.138 7
8# 5.70±0.514 9
10# 1.03±0.194 8
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.1288
单链复性（Single-strand annealing，SSA）［27］，检测
14459A-mitoTALEN 的靶向剪切特异性。如发生特异
CRISPR/Cas9-T1
A
B
CRISPR/Cas9-T2
Control-T1
Control-T2
性剪切，则促进同源重组恢复 Lac-Z 基因功能，得
到蓝色菌落，反之为白色菌落。与本研究所构建的
A：含 mtDNA 靶向目标序列 T1、T2 的 CRISPR/Cas9 质粒，即 CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-T2，瞬时转染于阳性单克隆细胞株 10#，48 h 后测序峰图；
B：不含 mtDNA 靶向目标序列 T1、T2 的 CRISPR/Cas9 空骨架质粒，即 Control-T1、Control-T2，瞬时转染于阳性单克隆细胞株 10#，48 h 后测序峰图，
其中红色方框表示靶向目标序列，黄色方框表示 PAM，灰色闪电状图标指示 Cas9 核酸酶剪切位置（PAM 上游 3 nt 处）
图 4 T1、T2 靶向目标序列剪切活性检测
2015,31(12) 89魏迪等：一种检测线粒体核酸酶靶向剪切活性的新方法
含有靶向目标序列的转基因细胞系相比，虽检测时
间较短，但研究者可在构建重组克隆质粒时，将多
个靶向目标序列或潜在发生非特异性剪切的序列串
联整合到核基因组中，灵活多变。一个细胞株不仅
可以检测多个靶向目标序列的剪切活性、比较不同
靶向目标序列的剪切效率（图 4-A，T1、T2 均具有
靶向剪切活性，且 T1 剪切效率大于 T2），还可以分
析单碱基或多碱基不匹配下的潜在脱靶效应等问题，
为更好的选择靶向目标序列、设计线粒体核酸酶提
供了重要的参考依据和实验基础，一举多得。
4 结论
本研究利用转基因技术，将一段同时含有两个
靶向目标序列（T1、T2）的 mtDNA 序列整合到宿主
基因组中。通过 3 对扩增不同位置的外源基因特异
性引物对，筛选得到阳性单克隆细胞株后，利用实
时荧光定量 PCR 法检测阳性单克隆细胞株中的外源
基因拷贝数，挑选其中单拷贝或低拷贝的阳性单克
隆细胞株。将含有相应靶向目标序列（T1、T2）的
CRISPR/Cas9 质粒瞬时转染到所选细胞株中，验证
T1、T2 的靶向剪切活性的同时证明了该方法的可行
性。建立了一种高效检测线粒体核酸酶靶向剪切活
性的新方法。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）