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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(9):218-223
卷烟烟气的化学成分多达 3 800 多种［1］，其中
大多数成分是无害的，只有少数有害［2］。弄清楚这
些有害成分的致病作用机制及其抑制途径，对于保
护卷烟消费者的健康具有重要意义。烟草特有亚硝
胺（TSNAs）是由烟草内源性生物碱通过亚硝胺化
作用而产生的，是只存在于烟草、烟草制品和烟草
烟气中的亚硝胺类化合物。到目前为止，尚未在其
他食品中发现［3］。有关 TSNAs 的研究报道很多，不
收稿日期 ：2015-01-09
基金项目 ：郑州市科技局科技攻关项目（121PPTGG362-16），河南省教育厅青年骨干教师项目（2012GG-117）
作者简介 ：王西华，男，硕士研究生，研究方向 ：发酵工程 ；E-mail ：13673615603@163.com
通讯作者 ：韩亚伟，男，博士，副教授，研究方向 ：烟草分子毒理评价 ；E-mail ：opsar@163.com
NNK 对 NCTC 1469 细胞毒性作用的研究
韩亚伟  王西华  陈利平  时桂芹  孙丽萍  周文珊
（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，郑州 450001）
摘 要 ： 研究 4-（甲基亚硝氨基）-1-（3- 吡啶基）-1- 丁酮（NNK）对小鼠肝细胞 NCTC 1469 细胞的毒性作用。利用 MTT
比色法检测 5 个不同 NNK 浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）对细胞的毒性作用 ；倒置相差显微镜观察细胞的形态变化 ；流式
细胞仪检测细胞凋亡率 ；实时荧光定量 PCR 检测凋亡基因 Bcl-2 和 Bax 的表达。MTT 显示，NNK 能降低 NCTC 1469 细胞存活率，
并呈剂量和时间依赖性。镜检结果可见细胞皱缩，密度降低 ；流式细胞仪检测显示，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的 NNK 作用
24 h 后凋亡率分别为（16.79±2.01）%、（26.87±1.67）%、（41.78±3.19）%、（50.89±3.94）% 和（65.86±4.54）%，显著高于
对照组（7.46±1.58）% ；荧光定量 PCR 结果显示，随着 NNK 浓度的增加，Bcl-2 mRNA 的表达减少，Bax mRNA 的表达逐渐上升。
NNK 能够降低 NCTC 1469 细胞存活率并诱导其凋亡，作用呈剂量和时间依赖性。
关键词 ： NNK ；NCTC 1469 细胞 ；细胞凋亡 ；流式细胞仪
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.031
Toxic Effects of NNK on NCTC 1469 Cells
Han Yawei Wang Xihua Chen Liping Shi Guiqin Sun Liping Zhou Wenshan
（College of Food and Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450001）
Abstract: This work is to investigate the cytotoxicity in NCTC 1469 cells induced by 4-（methyInitrosamino）-1-（3-pyridyl）-1-butanone
（NNK）. MTT assay was used to analyze the toxic effects on NCTC 1469 cells under various concentrations（0.1, 0.2, 0.3, 0.4, and 0.5 mg/mL）
of NNK at different times. Morphologic changes of treated NCTC 1469 cells with NNK were observed by the inverted microscopy. Flow cytometry
（FCM）and real-time quantitative PCR were applied to measure the apoptosis rate and the expression of apoptotic gene Bcl-2 and Bax mRNA.
NNK depressed the viability of NCTC 1469 cells with a pattern of the dose-dependent and time-dependent. Typical morphological changes of
cells shrinkage and the decrease of density were observed by the inverted microscopy. FCW revealed that inhibited cell proliferation and induced
death were of dose-dependent, i.e., apoptotic rates were（16.79 ± 2.01）%, （26.87 ± 1.67）%, （41.78 ± 3.19）%, （50.89 ± 3.94）% and
（65.86 ± 4.54）% respectively at 24 h after the cells treated with the concentrations（0.1, 0.2, 0.3, 0.4, and 0.5 mg/mL）of NNK, showing
much higher than the control of（7.46 ± 1.58）%. Real-time quantitative PCR showed that with the raising of NNH concentration, the
expression of gene Bcl-2 decreased and the expression of gene Bax gradually increased. Conclusively, NNK could obviously abate the viability of
NCTC 1469 cells and induce the apoptosis of NCTC 1469 cells in a pattern of dose-dependent and time-dependent.
Key words: NNK ；NCTC 1469 cells ；apoptosis ；flow cytometry
2015,31(9) 219韩亚伟等 ：NNK 对 NCTC 1469 细胞毒性作用的研究
仅是因为它们是烟草制品的主要有害成分之一，它
还对机体健康造成极大危害，有证据表明，TSNAs
与肺部、口腔、食道、胰脏、肝脏等部位发生的病
变有关［4］。而 4-（甲基亚硝氨基）-1-（3- 吡啶基）-1-
丁酮（NNK）是 TSNAs 中含量高、致癌能力强的一
种烷化剂类致癌物［5］，是卷烟主流烟气的代表性有
害成分之一［6，7］，国际癌症组织将其列为一级致癌
物［8］。实验研究证实，NNK 可诱发多种动物的多种
肿瘤发生。我们研究组所构建的小鼠毒理模型显示，
吸烟和灌胃的动物模型中，对小鼠的肺部细胞和肝
部细胞损伤最大［9，10］。鉴于报道的动物体内实验及
我们前期研究的结果，本实验以体外培养小鼠正常
肝细胞（NCTC 1469 细胞）为研究对象，采用四氮
唑盐比色分析法（MTT 法）和流式细胞仪检测细胞
凋亡，观察不同剂量 NNK 对 NCTC 1469 的细胞毒
性及凋亡情况，为进一步研究 NNK 诱导肝细胞损伤
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
小鼠肝细胞 NCTC 1469 购自中国典型培养物保
藏中心 ；NNK 购自 Toronto Research Chemicals Inc ；
DMEM 培养液、噻唑蓝、胰蛋白酶购自 Solarbio 公司；
胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司 ；
Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基
生物科技发展有限公司 ；实时荧光定量 PCR 试剂盒
购自宝生物大连有限公司；CO2 培养箱 HF160W（Heal
Force）；倒置相差显微镜（Observer A1，Zeiss）；流
式细胞仪（Becton-Dickinson，FACS Calibur）；酶标
仪（GENEios Plus，TECAN）；荧光定量 PCR（Stepone
Plus，ABI）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 细胞株于含 10% 胎牛血清的高糖
DMEM 培养液中，37℃，5%CO2 培养箱内培养，隔
天传代。取对数生长期的细胞用于试验研究。
1.2.2 NNK 对细胞毒性作用的检测 采用 MTT 比色
法，用 DMEM（含 10% 新生小牛血清）培养液调整
细胞浓度，以 1×104 个 /mL 接种于 96 孔培养板中，
每孔接种 100 μL 细胞悬液，置 37℃、5%CO2 饱和
湿度条件下培养 12 h 后弃原培养液，再分别加入含
NNK 浓 度 为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的 新 鲜
DMEM 培养液 200 μL，阴性对照组加入不含 NNK 的
等量完全培养基。同时设空白组对照调零，空白对
照组除不加细胞外其余条件与阴性对照组相同，每
组均设 5 个平行孔。置于培养箱中分别培养 12、24
和 36 h 后，每孔加入 5 g/L MTT 溶液 20 μL，孵育 4 h，
弃上清，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL/ 孔振荡
10 min 后，检测 490 nm 波长下吸光度值（A）。按公
式计算各组细胞存活率，细胞存活率 =［（实验孔 A 值 -
空白孔 A 值）/（对照孔 A 值 - 空白孔 A 值）］×100%。
实验重复 3 次。
1.2.3 NNK 胁迫 NCTC 1469 细胞的形态观察 将生
长良好的细胞分为对照组（正常培养的细胞）和实
验组，实验组中分别加入 NNK 0.1、0.2、0.3、0.4、
0.5 mg/mL，对照组不加 NNK，培养 24 h。倒置显微
镜动态观察细胞形态的变化。
1.2.4 细胞凋亡检测 将对数生长期的细胞消化接
种到六孔板中，次日，待细胞贴壁后，分别加入
含 NNK 浓度为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的新
鲜 DMEM 培养液，同时设立阴性对照组 ；置于培养
箱中培养 24 h，用 0.25% 胰酶（不含 EDTA）消化
收集细胞，制成细胞悬液，调整细胞密度至 5×105
mL，常规加入 Annexin V-FITC 及 PI 染色，流式细
胞仪（FCM）检测细胞凋亡情况。实验重复 3 次。
1.2.5 凋亡基因 Bcl-2 和 Bax 的表达 取对数生长期
的细胞分为实验组和对照组，对照组未加药物，实
验组加入 NNK 使其终浓度为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5
mg/mL。37℃、5%CO2 饱和湿度条件下培养 24 h 后，
实验组和对照组 NCTC 1469 细胞分别用 Trizol 试剂
提取 RNA，依照提取试剂盒操作得到白色沉淀，加
入 0.01% 焦碳酸二乙酯（DEPC）40 μL，使 RNA 完
全溶解。紫外分光光度计法测定 RNA 的 A260 和 A280
比值和含量，用 DEPC 水将各组总 RNA 调整至同一
浓度，分别逆转录合成 cDNA，以 GAPDH 为内参基
因进行实时荧光定量 PCR，基因引物序列详见表 1。
根据 Ct 值计算出内参基因和处理组基因的△ Ct，再
用对照组△ Ct- 处理组△ Ct 得到△△ Ct，最终根据
2- △△ Ct 得出处理组样本基因相对于对照组样本基因
的量。
1.2.6 统计学方法 应用 SPSS17.0 软件对实验数据
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9220
进行统计学分析。计量指标用 x
-
±s 表示，组间比较
用单因素方差分析（ANOVA），检验水准 α=0.05。
表 1 基因引物序列
基因 序列（5-3） 长度 /bp
Bcl-2 上游 CTACGAGTGGGATGCTGGAGA 80
下游 CAGGCTGGAAGGAGAAGATGC
Bax 上游 CAGGATGCGTCCACCAAGAA 196
下游 CAAAGTAGAAGAGGGCAACCAC
GAPDH 上游 CGTGCCTGGAGAAACCTG 140
下游 AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG
2 结果
2.1 NCTC 1469细胞形态学的变化
倒置相差显微镜如图 1 观察可见，对照组细胞
贴壁生长，细胞排列均匀，大小基本一致，轮廓清
晰，悬浮细胞少。随 NNK 浓度上升，细胞生长密度
逐渐下降，出现细胞皱缩等形态学改变、细胞数量
及生长密度逐渐减少、细胞颗粒增多。经 0.1 mg/mL
NNK 作用 24 h 后的细胞，正常细胞减少，开始出现
细胞碎片。并且随着 NNK 浓度逐渐增加，上述变化
更加明显。
性回归分析，存在明显的剂量 - 效应关系（12 h∶b=
-0.085，P<0.05 ；24 h∶b=-0.117，P<0.05 ；36 h∶
b=-0.138，P<0.05）。 且 随 着 时 间 逐 渐 延 长， 与 同
浓 度 组 比 较 均 明 显 下 降， 差 异 具 有 统 计 学 意 义
（P<0.05）。可见，NNK 能降低 NCTC 1469 细胞存活率，
并呈浓度和时间依赖性。
表 2 不同浓度 NNK 在不同时间作用下对 NCTC 1469 细
胞存活率的影响（%）
NNK 浓度 /
（mg. mL-1）
12 h 24 h 36 h
0 100.00 100.00 100.00
0.1 80.26±2.01a 71.74±2.75ab 69.94±3.47ab
0.2 61.47±1.92a 64.86±1.36ab 52.17±3.43ab
0.3 53.09±2.19a 51.37±4.22ab 35.75±3.81ab
0.4 44.66±2.81a 36.28±3.27ab 21.87±2.69ab
0.5 34.88±2.47a 16.74±2.83ab 10.4±4.28ab
注 ：a 与对照（0 mg/mL）组比较，P<0.05 ；b 与 12 h 组比较，P<0.05
2.3 NCTC 1469细胞的凋亡情况
流 式 细 胞 仪 Annexn V-FITC/PI 双 染 法 检 测 细
胞凋亡如图 2 所示，由于晚期凋亡细胞和坏死细
胞（右上象限）多为早期凋亡细胞（右下象限）继
发而来，故将两者之和记为总体凋亡率。对照组细
胞凋亡率仅约（7.46±1.58）%，NNK 作用 24 h 后
NCTC 1469 细胞的凋亡率分别为（16.79±2.01）%、
（26.87±1.67）%、（41.78±3.19）%、（50.89±3.94）%
和（65.86±4.54）%。与对照组比较，不同浓度组
间凋亡率差异具有统计学意义（P<0.05）。
2.4 NNK对NCTC 1469细胞Bcl-2和Bax基因表达的
影响
如 图 3 所 示， 随 着 NNK 作 用 浓 度 的 增 加，
NCTC 1469 细胞的 Bcl-2 基因 mRNA 表达明显减少，
而 Bax 基因的 mRNA 表达上升，Bcl-2/Bax 比值趋小。
3 讨论
吸烟能引起并发症已是不争的事实［11］。香烟中
主要的致癌物有两大类：一是多环芳烃类，如苯并芘；
二是亚硝胺，一支香烟燃烧产生的烟气中有 0.1-0.5
μg NNK［12］，NNK 可引起 DNA 链断裂、碱基突变、
DNA 加合物形成等，从而导致细胞病变［13-15］。小鼠
毒理模型显示烟气能够导致肝部损伤，可能与烟草
A B C
D E F
A ：0 mg/mL ；B ：0.1 mg/mL ；C ：0.2 mg/mL ；D ：0.3 mg/mL ；E ：0.4 mg/mL ；F ：
0.5 mg/mL
图 1 不同浓度 NNK 作用 24 h 后 NCTC 1469 细胞形态学
的改变（200x）
2.2 NNK对NCTC 1469细胞毒性作用
细胞存活率是细胞毒理作用的检测指标之一，
MTT 结果（表 2）显示，在不同浓度 NNK 的作用
下，各药物浓度组细胞存活率与同时间点对照组比
较均明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。线
2015,31(9) 221韩亚伟等 ：NNK 对 NCTC 1469 细胞毒性作用的研究
特有亚硝胺有关。
本研究之所以选用肝部细胞作为研究对象，主
要基于前期的研究基础，为进一步揭示 NNK 损伤肝
部细胞的机理而展开的。在我们的前期研究中，无
论吸烟还是灌胃的毒理模型中均显示，肺部和肝部
是损伤最大的组织。本研究通过 NNK 对小鼠正常
肝细胞 NCTC 1469 的胁迫作用，并为后期进一步作
用机制的研究奠定基础。MTT 结果表明，NNK 在体
外能显著降低 NCTC 1469 细胞的存活率，随着 NNK
浓度的加大和作用时间的延长，细胞存活率逐渐下
降，提示 NNK 浓度和时间依赖性地影响细胞存活率。
细胞凋亡是由基因控制细胞主动性自杀过程，
104
103
102
0 mg/mL 0.1 mg/mL
PI
101
100
100 101 102
Annexin V FITC
103 104
104
103
102PI
101
100
100 101 102
Annexin V FITC
103 104
104
103
102PI
101
100
100 101 102
Annexin V FITC
103 104
104
103
102PI
101
100
100 101 102
Annexin V FITC
103 104
104
103
102PI
101
100
100 101 102
Annexin V FITC
103 104
104
103
102PI
101
100
100 101 102
Annexin V FITC
103 104
0.2 mg/mL 0.3 mg/mL
0.4 mg/mL 0.5 mg/mL
图 2 NNK 体外作用对 NCTC 1469 细胞凋亡率的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9222
其细胞增殖调节机制的失控与癌变过程密切相关，
且可促进肿瘤的发生。经 NNK 作用后的 NCTC 1469
细胞，在倒置相差显微镜下观察细胞形态，可见细
胞生长密度逐渐下降，体积缩小。作用 24 h 后，有
大量不规则细胞脱落，细胞碎片较多。上述细胞形
态变化说明，NNK 对 NCTC 1469 的胁迫能通过细胞
凋亡程序来启动细胞抑制作用。该研究采用 Annexin
V-FITC/PI 双染法检测 NNK 体外作用对 NCTC 1469
细胞凋亡的影响。随着 NNK 浓度的增加凋亡率逐
渐上升，说明 NNK 通过诱导 NCTC 1469 细胞程序
性凋亡来抑制生长。抑制机制可能有直接损伤细胞
膜、影响线粒体的通透性［16］、阻滞细胞周期、降低
MMP 等。
细胞凋亡是为维持内环境稳定，由基因控制的
细胞自主的有序的死亡，其原因和途径是复杂多样
的，许多基因共同参与这一过程，包括抗凋亡基因
和促凋亡基因。其中 Bcl-2 家族成员在细胞凋亡的
过程中起着至关重要的作用［17］。Bcl-2 家族按其功
能可分为两大类 ：一类是促凋亡基因，代表基因是
Bax 基因，主要分布于线粒体的外膜上。Bax 过度表
达可以诱导某些细胞自发凋亡，且可以 参与并促进
其他因素诱导的细胞凋亡。另一类是抗细胞凋亡基
因，代表基因是 Bcl-2，与肿瘤的发生和耐药性密切
相关。若 Bcl-2 和 Bax 表达量平衡则细胞正常生存，
Bcl-2 表达水平上升时可以和 Bax 结合形成异源二
聚体抑制细胞凋亡，Bax 表达水平上升可形成同源
二聚体拮抗 Bcl-2 的作用，促进细胞凋亡［18］。本研
究发现，不同浓度 NNK 作用 NCTC 1469 细胞后检
测 Bcl-2 和 Bax 基因的表达水平，随着药物浓度的
上升，Bcl-2 基因的 mRNA 表达量下降，而 Bax 基因
的 mRNA 表达上升，Bcl-2/Bax 比例下降，呈现负相
关性的关系，由此说明，NNK 诱导 NCTC 1469 细胞
凋亡的机制可能是通过下调 Bcl-2 mRNA 和上调 Bax
mRNA 表达量来实现的。
本实验是细胞毒理模型初步建立阶段，我们
选择经典的 Bcl-2 和 Bax 基因作为研究对象，虽然
mRNA 定量 PCR 结果能反映出 NNK 能诱导 Bcl-2 和
Bax 发生相应的表达变化，但两基因翻译成功能蛋
白还需要经过转录后的修饰和蛋白质翻译的调控 ；
如果仅通过 Western blot 来验证 Bcl-2 和 Bax 表达蛋
白的量的变化，既脱离不了常规的研究方法，又不
能对两基因的调控机理作以解释，因此本实验未利
用 Western blot 验证两基因的蛋白水平上的变化，我
们正通过其它分子生物学方法研究两基因的调控机
理，这将在后续研究结果中加以报道。
4 结论
NNK 能降低 NCTC 1469 细胞存活率，并诱导其
凋亡，且通过调节 Bcl-2 和 Bax 的相对表达量诱导
其凋亡，具体机制及与其它凋亡信号通路的关系有
待进一步研究。
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图 3 不同浓度 NNK 处理 NCTC 1469 细胞 24 h 后 Bcl-2
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（责任编辑 李楠）