全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):216-221
血栓病是心脑血管疾病中死亡率和严重致残率
较高的人类重大疾病之一，在国内外有较高的病率。
虽然人组织纤溶酶原激活剂（ht-PA）是目前临床血
栓疾病的治疗主要生物药品之一，但是有着出血副
收稿日期 ：2015-01-19
基金项目 ：国家转基因生物新品种培育重大专项（2014ZX08008-004），江苏省科技支撑项目（BE2013679），江苏省优势学科建设工程资助项目，
大学研究生科研创新项目（CXLX-1435），扬州大学研究生科研创新项目（CXLX-1435）
作者简介 ：陆睿，男，硕士，研究方向 ：动物转基因与生物制药 ；E-mail ：halurui@163.com
通讯作者 ：成勇，男，博士，研究方向 ：动物胚胎工程（克隆）和动物转基因 ；E-mail ：chengyong@yzu.edu.cn
重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的
检测
陆睿  宋绍征  祁正强  葛欣  邵宾  成勇
（江苏省转基因动物制药工程研究中心，扬州 225009）
摘 要 ： 人组织纤溶酶原激活剂（ht-PA）是临床血栓疾病治疗的主要生物药品，应用转基因动物乳腺生物反应器制备已有
报道，但重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）在转基因动物中表达尚未见报道。设计了以人 t-PA 的 F、E、K1 区位点缺失体为编码序
列，以山羊 β- 酪蛋白 /CMV 杂合启动 / 增强子，构建了乳腺特异性表达载体 PCL25/rhPA，通过受精卵原核显微注射法制备转基因兔。
用 PCR 检测及其产物测序筛选转基因兔，ELISA 试剂盒及纤维蛋白平板溶圈法检测转基因兔的表达产物。实验获得原代转基因兔
5 只（2 ♂，3 ♀），其中 2 只乳腺中表达人重组纤溶酶原激活剂，rhPA 浓度最高可达 400 μg/mL，表达产物比活性是现有阿替普酶
的 150-200 倍。实验结果表明，重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）可以在山羊 β-酪蛋白 /CMV 杂合启动 / 增强子调控下获得乳腺特
异性表达，表达重组蛋白具有较高的溶栓活性。
关键词 ： 转基因兔 ；人组织纤溶酶原激活剂（ht-PA）；乳腺特异性表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.033
Preparation of Recombinant Human Plasminogen Activator in Rabbit
Mammary Gland and Detection of Expressed Products
Lu Rui Song Shaozheng Qi Zhengqiang Ge Xin Shao Bin Cheng Yong
（Engineering Research Centre for Transgenic Animal Pharming of Jiangsu Province，Yangzhou 225009）
Abstract:  Human tissue-type plasminogen activator（ht-PA）is a major biomedicine used in the clinical treatment of thrombotic
diseases. There have been some reports on transgenic animal mammary gland as bioreactor producing ht-PA, however, there has been no report
about recombinant human-tissue plasminogen activator（rhPA）expressed in transgenic animals. Here we report the preparation of transgenic
rabbits by microinjection of fertilized eggs with the constructed mammary gland-specifically expressed vector of PCL25/rhPA while using
F, E, and K1 loci deletants of human t-PA as coding sequence driven by the goat beta-casein/CMV chimeric promoter. PCR and sequencing
PCR products were used to identify the transgenic rabbits from candidates, and ELISA and fibrin agarose plate assay（FAPA）to analyze the
expressed products of the transgenic rabbits. Results showed that 5 rabbits（2 ♂ , 3 ♀）were transgenic rabbits and rhPA were expressed in
their milk of 2 rabbits with maximum content of 400 μg/mL, and its biological activity was 150-200 times of alteplase. This study implies that
rhPA can be expressed specifically in the mammary glands under the regulation of goat beta-casein/CMV chimeric promoter, and the expressed
recombinant protein possesses the high activity of thrombolysis.
Key words:  transgene rabbit ；human tissue-type plasminogen activator（ht-PA）；mammary gland-specifically expression
2015,31(10) 217陆睿等：重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的检测
作用较大、半衰期短的缺点［1，2］；重组人纤溶酶原
激活剂（rhPA，F、E、K1 区缺失体）具有出血副作
用小、半衰期长、溶栓活性高等特点，能够更安全
有效地治疗血栓病［3-7］。目前用于血栓疾病治疗的
重组药用蛋白主要靠原核生物生产，具有生物溶栓
活性较低、生产成本高等缺点 ；使用转基因动物乳
腺生物反应器可获得活性高、生产成本低的重组药
用蛋白［4］。
家兔是最早用于胚胎移植等研究的实验动物之
一，具有多胎、妊娠期短、繁殖快、全年多发情，
产仔率高等优点，并且泌乳能力较高，因而可用家
兔乳腺生产重组药用蛋白。受精卵原核显微注射制
备转基因动物早有报道，但依然是一种相当合适的
制备转基因兔的方法。本研究以人 t-PA 的 F、E、
K1 区位点缺失体为编码序列，以山羊 β-酪蛋白 /CMV
杂合启动 / 增强子，构建了乳腺特异性表达载体
PCL25/rhPA，通过受精卵原核显微注射法制备转基
因兔。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 Not I、Sal I、Taq 等酶为大连 TaKaRa
公司产品 ；苯酚、氯仿、无水乙醇等均为国产分析
纯 ；DNA 胶回收纯化试剂盒（287704，QIAGEN）；
FSH（110044629， 宁 波 市 三 生 药 业 有 限 公 司 ）；
HCG（091217B，丽珠集团丽珠制药厂）；胎牛血清
（SH30070.03，HyClone）；M2（11G801，Sigma）；
M16（11A832，Sigma）；引物为生工生物工程（上
海）有限公司合成 ；ELISA 试剂盒为上海西唐生物
科技有限公司产品 ；阿替普酶（Boehringer Ingelheim
Pharma Gmbh & Co. Kg）； 纤 维 蛋 白 原（F8630，
Sigma）；凝血酶（T4648，Sigma）；组织裂解液、冲
卵液自配（参照小鼠胚胎操作实验手册），所用药品
均购自 Sigma 公司。
1.1.2 实验动物 性成熟的中国家兔，饲养于本实
验室。
1.1.3 主要仪器和器具 倒置显微镜和显微操作仪
（Leica，德国），体视显微镜（厦门麦克奥迪公司），
CO2 培养箱（No.3111，Forma Science Inc. 美国），拉
针 仪（PB-7 Micropipette Puller，Narisgige， 日 本 ），
DNA 扩增仪（S1000 Thermal Cycler，Bio-RAD，美国），
酶标仪（RT-6000，Rayto，深圳），常规小动物手术
器械。
1.1.4 乳腺特异性表达载体 质粒 PCL25/rhPA 由
本实验室制备并保存。在乳腺特异性表达载体 pBC1
的 Xho I 限制性酶切位点处插入化学合成的 rhPA
cDNA 片段。构建成的含有目的基因 rhPA cDNA 片
段的乳腺特异性表达载体命名为 PCL25/rhPA，大小
为 23 361 bp。用 Not I 和 Sal I 双酶切，去除原核基
因片段并使之线性化（图 1）。
1000 bp
LCR rhPA
Not I
16700 bp
Sal I
5 β˃-casein 3 β˃-casein
图 1 乳腺特异性表达载体 PCL25/rhPA 结构
1.2 方法
1.2.1 显微注射用基因制备 用 Not I 和 Sal I 双酶
切质粒 PCL25/rhPA，用 DNA 胶回收纯化试剂盒回
收真核部分供显微注射用。用 TE 缓冲液（5 mmol/L
Tris，pH 7.4 0.1 mmol/L EDTA）溶解定量为 5 ng/μL，
分装为 10 μL/ 管，-20℃短暂低温保存。
1.2.2 兔超数排卵 挑选未发情成年母兔作为供体
兔，第 1 天 19：00 肌肉注射 FSH 15 U/ 只；第 2 天 7：
00 肌肉注射 FSH 15 U/ 只，19 ：00 肌肉注射 FSH 10
U/ 只 ；第 3 天 7 ：00 肌 肉 注 射 FSH 10 U/ 只，19 ：
00 肌肉注射 FSH 5 U/ 只 ；第 4 天 7 ：00 肌肉注射
FSH 5 U/ 只，19 ：00 静脉注射 hCG 100 U/ 只后与正
常公兔配种 ；第 5 天 12 ：00 手术取卵［8，9］。
在供体兔配种的同时，挑取自然发情的成年母
兔作受体兔，耳缘静脉注射 HCG 100 U/ 只，以备次
日手术移植。母兔发情的主要标志为阴道黏膜呈潮
红色。
1.2.3 回收胚胎 供体兔注射 hCG 后 17 h，仰卧保
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10218
定，静脉空气针处死兔，无菌剖腹取出卵巢和输卵
管连同子宫，移到实验室胚胎间，剪除粘附的脂肪，
反复冲洗直至不再出血为止，用 2.5 mL 注射器吸取
冲卵液从子宫方向朝输卵管喇叭口方向冲胚，回收
受精卵细胞，在体视显微镜下计数观察。
1.2.4 显微注射与移植 将已回收定量的显微注射
片导入受精卵的雄原核内，培养 30 min 后手术移植
到同步发情的受体母体输卵管内，待孕。
1.2.5 PCR 检测 利用 Primer5.0 设计检测引物，上
游引物 F1 位于 CMV，下游引物 R1 位于 rhPA 编码区。
扩增产物大小为 556 bp，跨越 CMV 与 rhPA 接头区。
引物序列如下 ：F1 ：5-CGTGGATAGCGGTTTGA
-3，R1 ：5-GAGCCCTCCTTTGATGC -3。
PCR 参数为 ：95℃预变性 5 min ；94℃变性 45 s，
57℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，共 30 个循环 ；最
后 72℃延伸 10 min。
1.2.6 转 基 因 兔 乳 腺 特 异 性 rhPA 表 达 检 测 转
基因母兔配种怀孕挤奶， 收 集 乳 汁。 乳 汁 离 心，
10 000×g，30 min，去除上层脂肪及下层浑浊，吸
取乳清。用上海西唐生物科技有限公司 ELISA 试剂
盒检测，具体操作见说明书。
1.2.7 转基因兔表达产物活性检测 使用纤维蛋白
平板法（FAPA）检测 rhPA 的生物活性［10，11］。以
PBS 为溶剂，配制 1.0% 琼脂糖凝胶、10 mg/mL 纤
维蛋白原（制品中含少量的纤溶酶原，Fibrinogen，
F）、1 U/mL 凝血酶（Thrombin，T）；煮沸熔化琼脂
糖凝胶，取 10 mL 置小烧杯内，待其温度降至 55-
60℃，取预热至 37℃的纤维蛋白原 1 mL 注入，摇匀，
再取预热至 42℃的凝血酶注入，摇匀后迅速倒入直
径为 9 cm 的玻璃培养皿内，室温凝固后打孔、封底，
每孔加入 20 μL 样品，放置 37℃恒温箱孵育过夜后
2.2 整合检测结果
通过对 8 只供体兔超数排卵获得 251 枚受精卵，
挑选较好的 113 枚受精卵进行显微注射，培养后再
挑选其中形态较好的 109 枚移植到 5 只同步发情的
母兔输卵管中，其中 3 只怀孕，妊娠到期共出生 19
只仔兔。经 PCR 及产物测序筛选，共获得 5 只兔（2 ♂，
3 ♀）整合有目的基因（图 3），出生仔兔整合率为
29.7%。两只公兔（K29，K30）分别与正常母兔配种，
获得 K29 F1 代整合兔 4 只（3 ♂，1 ♀），K30 F1 代
整合兔 7 只（4 ♂，3 ♀）（图 4）。
2.3 ELISA检测结果
3 只原代母兔乳清经 ELISA 检测，其中 A10 乳
19329
bp
1 2 3 4 M
7743
6223
4254
3472
2690
1882
1489
1 ：质粒 PCL25/rhPA ；2 ：质粒 PCL25/rhPA 经 Not I 和 Sal I 双酶切后产物 ；3 ：
显微注射用 DNA 片段 ；4 ：双蒸水 ；5 ：λ-EcoT14 DNA Marker
图 2 Not I 和 Sal I 双酶切 PCL25/rhPA 电泳结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18 19 DW WT1WT2 P1 P2M13
1-19 ：F0 代待测兔基因组 ；DW ：双蒸水作空白对照 ；WT1，WT2 ：正常兔基因组 ；M ：DL2000 DNA Marker ；P1，
P2 ：显微注射片段 PCR 扩增产物作阳性对照
图 3 F0 代仔兔 PCR 检测结果
观察。
2 结果
2.1 显微注射片段纯化回收
用 Not I 和 Sal I 双酶切质粒 PCL25/rhPA，使用
胶回收纯化试剂盒纯化 16 700 bp 片段作显微注射片
段，电泳结果见图 2。
2015,31(10) 219陆睿等：重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的检测
清中检测到重组人纤溶酶原激活剂（rhPA），A11、
A12 乳清中未检测出。两只原代公兔的 F1 代母兔
（K29-1、K30-6）乳清经 ELISA 检测（图 5），其中
K29-1 乳清中检测到重组人纤溶酶原激活剂（rhPA），
但 K30-6 乳清中未检测出。A10 乳清中 rhPA 含量
为 60 μg/mL，K29-1 乳清中 rhPA 含量为 400 μg/mL，
图 5 和图 6 中结果均为样品稀释 500 倍后实验所得。
的清除相关，K2、P 区是与 t-PA 蛋白功能相关的重
要区域。Smalling 等［3］在 1995 年报道了缺失 F、E、
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18 DW M WT P13
1-6 ：K29 F1 代仔兔基因组 ；7-18 ：K30 F1 代仔兔基因组 ；DW ：双蒸水作空白对照 ；M ：DL2000 DNA Marker ；
WT ：正常兔基因组作阴性对照 ；P ：显微注射片段 PCR 扩增产物作阳性对照
图 4 原代转基因公兔 F1 代仔兔 PCR 检测结果
1
A
B
C
D
2 3 4 5 6 7
A1-A7 ：阿替普酶用 PBS 倍比稀释作阳性对照，浓度依次为 1200、600、
300、150、75、37.5 和 18.8 ng/mL；B1-B4：PBS；B5-B7，C1-C3：正常兔奶样；
C4-C7，D2 ：依次为转基因兔 A10，A11，A12，K30-6，K29-1 奶样
图 5 ELISA 检测 5 只雌性转基因兔乳清中 rhPA
1400
1200
1000
Alteplase standard curve
800
600
400
200
C
on
ce
nt
ra
tio
n
of
rh
PA
/ng·mL-1 
0
0 0.2
18.8 37.5
75 A
150
300
600
B
1200
0.4 0.6 0.8
OD280
1.0 1.2 1.4
阿 替 普 酶 浓 度 标 准 曲 线 ：18.8 ng/mL，37.5 ng/mL，75 ng/mL，150 ng/mL，
300 ng/mL，600 ng/mL，1200 ng/mL。A ：转基因兔 A10 奶样稀释 500 倍检
测结果（120 ng/mL）；B ：转基因兔 K29-1 奶样稀释 500 倍检测结果（800
ng/mL）
图 6 A10 乳清及 K29-1 乳汁中 rhPA 浓度
2.4 纤维蛋白平板溶圈法检测结果
经纤维蛋白平板溶圈法的体外活性检测，结果
（图 7）表明两只表达兔的表达产物均具有体外溶纤
活性。其中 K29-1 表达的 rhPA 活性约为阿替普酶
150-200 倍。重组人纤溶酶原激活剂转基因表达兔
K29-1 及 A10 如图 8 所示。
3 讨论
人组织纤溶酶原激活剂（ht-PA）由 5 个功能相
对独立的结构域组成［3］：F 区、E 区、三角区 K1、
三角区 K2、P 区 ；其中 F、E、K1 区与 t-PA 在体内
A B
DC
F G H I
MLK
E
J
A-E ：转基因兔 A10，A11，A12，K29-1，K30-6 奶样 ；F-J ：阿替普酶用
PBS 倍比稀释作阳性对照，浓度依次为 100 μg/mL，10 μg/mL，1 μg/mL，0.1
μg/mL，0.01 μg/mL ；K ：PBS ；L-M ：正常兔奶样作阴性对照
图 7 纤维蛋白平板溶圈法检测 5 只雌性转基因兔乳清中
rhPA 生物活性
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10220
K1 片段可延长纤溶酶原激活剂在体内的溶栓作用时
间及更好的溶栓特性。本研究以 ht-PA 的 F、E、K1
区位点缺失体为编码序列，构建了乳腺特异性表达
载体，并且重组编码序列 rhPA 基因可以在转基因
家兔乳腺细胞中表达，表达重组蛋白分泌到乳汁中，
这在国内外尚未见报道。
本研究中的乳腺特异性表达载体上携带山羊 β-
酪蛋白 /CMV 杂合启动 / 增强子。成勇［12］在 2007
年报道了山羊 β-酪蛋白 /CMV 杂合启动 / 增强子驱
动人乳铁蛋白（hLF）在小鼠乳腺中特异性表达，表
达水平可达 2-8.1 g/L，并且在血清及唾液中均未检
测到 rhLF 表达，表明山羊 β-酪蛋白 /CMV 杂合启
动 / 增强子用于乳腺生物反应器既可提高目的蛋白
表达量又能保证表达特异性。
哺乳动物乳腺细胞相对于原核生物及酵母具有
翻译后更完善的修饰和加工能力，从而能保证表达
产物能有更高的生物活性。田文静［13］于 2010 年报
道了瑞替普酶（rhPA，F、E、K1 区缺失体）在大
肠杆菌中表达，表达产物复性后具有溶栓活性。本
研究用山羊 β-酪蛋白 /CMV 杂合启动 / 增强子驱动
ht-PA 的 F、E、K1 区位点缺失体编码序列在家兔乳
腺中表达。体外溶纤试验的结果表明，表达产物具
有溶纤活性，其溶栓活性是药品阿替普酶的 150-
200 倍，这一结果也提示我们，不仅重组纤溶酶原
激活剂可以实现乳腺特异性表达，而且重组体有更
好的药理学特性，该结果显示转基因动物生产 rhPA
的优势，也为溶血栓新药的创制提供了有应用价值
的材料。
据世界卫生组织（WHO）统计分析，全球平均
每年有 1 700 万人以上死于心脑血管病（脑血栓和
心肌梗死），临床上对溶血栓药的需求量很大。目前
国内纤溶酶原激活剂溶栓药物中有阿替普酶、瑞替
普酶、孟替普酶、替尼普酶等，但这些溶血栓药大
部分是由大肠杆菌生产，比活性较低，使用副作用大。
此外，这些产品都是国外专利产品，无自主知识产权，
因此价格昂贵，大众使用受到限制。乳腺生物反应
器制备的 rhPA 具有比活性高、半衰期长、产量高、
价格便宜等特点，临床应用时可减少药物用量从而
减小毒副作用。
4 结论
本研究设计了重组人纤溶酶原激活剂编码序列
（rhPA，F、E、K1 区缺失体），并获得了乳腺特异
性表达 rhPA 基因转基因兔，乳汁中 rhPA 表达水平
达 400 μg/mL，rhPA 比活性是药品阿替普酶（ht-PA）
的 150-200 倍。
参 考 文 献
［1］ Sun XH, Berthiller J, Trouillas P, et al. Early fibrinogen degradation
coagulopathy ：A predictive factor of parenchymal hematomas
in cerebral rt-PA thrombolysis［J］. Journal of the Neurological
Sciences, 2015, 351（1-2）：109-114.
［2］ Collen D, Lijnen HR. The Tissue-Type Plasminogen Activator Story.
Arteriosclerosis［J］. Thrombosis and Vascular Biology, 2009, 29（8）：
1151-1155.
［3］ Smalling RW, Bode C, Kalbfleish J, et al. More rapid, complete,
and stable coronary thrombolysis with bolus administration of
reteplase compared with alteplase infusion in acute myocardial in
farction［J］. Circulation, 1995, 91（11）：2725-2732.
［4］ 冮洁 , 路福平 , 杜连祥 . 组织型纤溶酶原激活剂 - 及其突变体
的表达研究进展［J］. 药物生物技术 , 2003, 10（4）：251-255.
［5］ 江成英 , 郭宏文 , 冮洁 . 人组织型纤溶酶原激活剂 - 突变体的
研究现状及进展［J］. 农产品加工·学刊 , 2008, 142（7）：
141-143.
［6］ 周雪艳 . 瑞替普酶（rPA）及其突变体的构建和在大肠杆菌与
CHO 细胞中的表达研究［D］. 长春 ：吉林大学 , 2006.
［7］ 黄坚 , 龙青 , 任启生等 . 重组基因在毕赤酵母细胞中的胞内表
达研究［J］. 中国生化药物杂志 , 2003, 24（2）：58-61.
［8］ 宋绍征 , 葛欣 , 张利清 , 等 . 家兔超数排卵和胚胎移植妊娠率
A B
A ：K29-1，乳汁中 rhPA 浓度为 400 μg/mL ；B ：A10，乳汁中 rhPA 浓度为
60 μg/mL
图 8 重组人纤溶酶原激活剂转基因表达兔
2015,31(10) 221陆睿等：重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的检测
的影响因素分析［J］. 畜牧与兽医 , 2013, 45（8）：14-18.
［9］ 王田娟 , 章志国 , 邢琼 , 等 . 不同超排方法对家兔超数排卵效
果的影响［J］安徽医科大学学报 , 2011, 46（4）：355-357
［10］ 李华 , 陈陵霞 , 许瑞安 . 纤溶活性的药学测定方法研究［J］.
中国临床药理学与治疗学 , 2008, 13（9）：1066-1070.
［11］ 张守峰 , 扈荣良 , 赵君 , 等 . 体外纤溶活性及半定量检测方法
的确立［J］. 中国兽医学报 , 2002, 22（5）：436-437.
［12］ 成勇 . 乳蛋白与 CMV 复合启动子驱动 hLF cDNA 乳腺特异性
表达［D］. 南京 ：南京农业大学 , 2007.
［13］ 田文静 . 溶栓药物瑞替普酶（rPA）的大肠杆菌表达研究［D］.
天津 ：天津科技大学 , 2010.
（责任编辑 李楠）