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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第3期
RNA 沉默是一种由同源序列引起的特异 RNA
降解过程。RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是
近来发现的一种重要的基因沉默现象，通常由双链
RNA 介导。1990 年 Napoli 首次提出植物中的 RNA
沉 默 也 称 为 转 录 后 基 因 沉 默（post-transcriptional
gene silencing，PTGS）［1］。高等植物对于病毒侵染
收稿日期 ：2012-09-20
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30870109）
作者简介 ：霍晓辉，女，硕士研究生 , 研究方向 ：分子植物病毒学 ; E-mail ：xiaohui198720062006@126.com
通讯作者 ：曹雪松，E-mail ：duaixuezhongzi@163.com
马铃薯卷叶病毒 P0 蛋白抑制 RNA 沉默及其与 AGO
蛋白的相互作用
霍晓辉  申永梅  刘国富  曹雪松
（聊城大学 生命科学学院，聊城 252059）
摘 要 ： 马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus，PLRV）P0 是由开放阅读框 1（ORF1）所编码，利用农杆菌介导的瞬时
表达技术渗透注射转绿色荧光蛋白（GFP）基因的 16c 烟草叶片发现 PLRV-P0 能够抑制由 GFP mRNA 引起的基因沉默，结果表
明 PLRV-P0 是马铃薯卷叶病毒编码的一个基因沉默抑制因子。通过序列分析发现 PLRV-P0 基因序列中含有两个重复的 WG 基
序，我们将 PLRV-P0 基因序列中第 87 位和第 140 位的色氨酸（W）点突变为丙氨酸（A）（命名为 P0WA），构建植物表达载体
pCAMBIA1300-CE-P0，pCAMBIA1300-CE-P0WA，农杆菌渗透注射本氏（Nicotiana benthamiana）烟草叶片，通过荧光显微镜观察
发现 PLRV-P0 和 AGO 共同注射后有绿色荧光出现而 PLRV-P0WA 和 AGO 共同注射后则没有绿色荧光出现。研究结果初步表明，
PLRV-P0 能够和 AGO 蛋白发生相互作用，重复的 WG 基序是其与 AGO 蛋白相互作用的关键氨基酸。
关键词 ： 马铃薯卷叶病毒（PLRV） P0 蛋白 抑制 RNA 沉默 AGO 蛋白 相互作用
P0 of Potato Leafroll Virus Suppress RNA Silencing and Its
Interaction with AGO Protein
Huo Xiaohui Shen Yongmei Liu Guofu Cao Xuesong
（College of life Science，Liaocheng University，Liaocheng 252059）
Abstract:  P0 of Potato leafroll virus is encoded by the open reading frame1（ORF1）. Here we show that P0 of Potato leafroll virus
（PLRV）displays strong silencing suppressor activity in a transient expressin assay based upon its ability to inhibit PTGS of green flurescent
protein（GFP）mRNA when expressed in agro-infitraten leaves of Nicotiana benthamiana containing a GFP transgene（16c）.We found
PLRV-P0 gene sequence containing two duplicate WG motif by sequence analysising. The 87 and 140 Tryptophan（W）of Potato leafroll virus
P0 gene were mutated by Alanine（A）（named P0WA）, the plant expression vector pCAMBIA1300-CE-P0, pCAMBIA1300-CE-P0WA was
constructed. We found that there was green fluorescent under fluorescence microscopy after PLRV-P0 and AGO co-injection when expressed in
agro-infiltraten leaves of Nicotiana benthamiana. However, there was not green fluorescent under fluorescence microscopy after PLRV-P0WA
and AGO co-injection.We conclude that the PLRV-P0 interacted with AGO protein and repeated WG motif was the key amino acids.
Key words:  Potato leafroll virus（PLRV） P0 protein Suppressin of RNA silencing AGO protein Interaction
有保护自身的防御机制，当病毒侵染植物时，由病
毒 RNA 和 mRNA 介导的转基因会引起植物对病毒
的抗性，称为病毒介导的基因沉默（virus induced
gene silencing，VIGS）。它是转录后基因沉默（post-
transcriptional gene silencing，PTGS）一种特殊形式。
但是，为利于病毒侵染，植物病毒也同时编码一种
2013年第3期 71霍晓辉等 ：马铃薯卷叶病毒 P0 蛋白抑制 RNA 沉默及其与 AGO 蛋白的相互作用
蛋白用来对抗 RNAi，这类蛋白可以用于抑制 RNA
沉默的各个步骤，称为 RNAi 抑制因子［2］。据报道
已鉴定了 50 余种病毒编码的 RSS，例如马铃薯 Y
病毒属（Potyvirus）中的蚜传辅助性蛋白酶（help
component-proteinase，HC-Pro）［3］， 黄 瓜 花 叶 病 毒
（Cucumber mosaic virus，CMV）编码的 2b，马铃薯
X 病毒（Potato virus X，PXV）编码的 p25、马铃薯
卷叶病毒（Potato leafroll virus，PLRV）属编码的 P0
以及甘蔗黄叶病毒编码（Sugarcane yellow leaf virus，
SCYLV）的 P0 等［4］。
基因沉默抑制因子干扰基因沉默的机制有多种
形式 ：抑制 siRNA 的积累 ；抑制因子与 siRNA 的
结合，使之不能与蛋白核酸复合体结合形成 RISC
（RNA 诱导的沉默复合物）；抑制双链 RNA 的形成 ；
抑制因子与基因沉默核酸蛋白复合体相结合，阻止
转录后基因沉默的发生。AGO 蛋白是 RNA 沉默途
径中一个关键蛋白，AGO 蛋白可以与小 RNA 的引
导链及其他蛋白质组装形成的 RNA 诱导的沉默复合
体（RISC）。病毒编码的 RSS 与 AGO 相互作用的研
究表明，AGO 作为 RNA 沉默路径当中的关键蛋白
可能会成为很多病毒 RSS 作用的靶位点，AGO 蛋白
正确组装成 RISC 需要多种 dsRNA 结合蛋白的协助，
因此推测许多 RSS 利用其含有的“AGO 钩”（GW/WG
重复，甚至只含有单个 GW 或 WG）与 AGO 的竞争
性结合来抑制 RNA 沉默。最新研究发现，抑制因子
中含有的重复甘氨酸、色氨酸（GW/WG motif）是与
AGO 相互作用的关键氨基酸，基因序列中 GW/WG
重复二次至多次可以作为“AGO 钩”（Ago hook）与
AGO 蛋白结合并在基因沉默中发挥作用［5，6］。例如
芜箐邹缩病毒（TCV）外壳蛋白 P38 中的二个 GW
重复是与 AGO 相互作用的关键氨基酸，而且 P38 与
AGO 互作的同时会影响 DCL 的表达［7］。
马铃薯卷叶病毒属于黄症病毒科家族的马铃薯
卷叶病毒属中的黄化病毒组（Luteovirus），1916 年
被发现，是发现最早的马铃薯病毒，由多种蚜虫以
持久性方式传播，而不能由机械传播，PLRV 的分
布主要局限于在寄主植株韧皮部维管束内，主要侵
染茄科（如马铃薯、番茄等）植物。据报道，在
我国北方地区造成的马铃薯产量的损失约为 30%-
40%，严重时候可达到 80%-90%。PLRV 基因组结构
为等轴对称，直径约 24 nm。PLRV 的 RNA 的碱基
组成大体上为 28％ A、23％ U、25％ C 与 24％ G。
PLRV 的基因组含有 8 个 ORFs，其中有部分 ORF 重
叠，在通过选择性的识别起始密码后再经过移码、
通读终止密码子及利用亚基因组等各种策略分别翻
译各 ORF［8］（图 1）。P0 是由 PLRV 的 ORF1 所编码，
它是病毒侵染植株后引起病症的决定性因子，并且
是一种 RSS。
70K
1
0 2 RdRp 3 CP 5 RT 7
64 MP
17K 7.1K
14K56K23K69K28K
PLRV gRNA
图 1 马铃薯卷叶病毒基因组结构
目前已鉴定的马铃薯卷叶病毒属中的 RSS 只
有马铃薯卷叶病毒（PLRV）、甜菜西方黄化病毒
（BWYV）、南瓜蚜传黄化病毒（CABYV）和甜瓜蚜
传黄化病毒（MABYV）编码的 P0 蛋白，但对其机
制都还不清楚，而我们试图通过农杆菌瞬时表达渗
透注射转 GFP 基因的 16c 烟草叶片研究 PLRV-P0 是
否能抑制 RNA 沉默。通过序列分析发现 P0 基因序
列中含有两个重复的 WG 基序，我们首先将 P0 基
因序列中第 87 位和第 140 位的色氨酸（W）点突
变为丙氨酸（A）（命名为 P0WA），然后分别将 P0
和 P0WA 基因克隆到改造后的双分子荧光互补载体
pCAMBIA1300-CE 上，将 PLRV-P0，PLRV-P0WA 分
别和 AGO 共同进行农杆菌渗透注射野生型（N.ben）
烟草叶片，并在荧光显微镜下观察 PLRV-P0 和 AGO
及 PLRV-P0WA 和 AGO 共同注射后是否有绿色荧光
的出现，从而确定 PLRV-P0 到底能否和 AGO 蛋白
发生相互作用及其关键氨基酸。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 本氏烟草（Nicotiana benthamiana）
以及转 GFP 基因的（16c）烟草种子由 David Baulco-
mbe 教授惠赠。
1.1.2 菌 种、 质 粒 大 肠 杆 菌 DH5α， 农 杆 菌
GV3101，pWEIMING101 载 体 均 由 本 实 验 室 保 存，
双分子荧光互补载体 pCAMBIA1300-CE 以及重组质
粒 ASK-NE，ASK-CE，AGO-NE，pGR107P0WA 均
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期72
由本实验其他研究人员构建。
1.1.3 酶和试剂 限制性内切酶（Xho I，Cla I，Sal I，
Kpn I）和 T4 DNA 连接酶购自 Promega 公司；Taq DNA
聚合酶及其缓冲液，dNTP 购自 TakaRa 公司 ；胶回
收试剂盒，质粒快速提取试剂盒购自北京康润诚业
生物科技有限公司 ；DNA 分子量标准购自 Fermentas
公司，其他生化试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据 GenBank 中报道的
PLRV-P0 的基因序列，设计合成含有相关酶切位点
的上下游引物并由上海生工生物工程公司合成。
1.2.2 目的基因的 PCR 扩增
1.2.2.1 P0 基因的 PCR 扩增 以 pER8 的 cDNA 为
模板，PLRV-P0 5 ：GTTAGTCGACATGATTGTATTG-
ACCCAGTCTG（下划线为 Sal I 酶切位点）；PLRV-
P0 3 ：ACAGGGTACCTCATTCTTGTAATTCCTTTTGG
（下划线为 Kpn I 酶切位点），1300-CE-P0 5 ：GTTA-
ATCGATATGATTGTATTGACCCAGTC（ 下 划 线 为
Cla I 酶切位点）；1300-CE-P0 3 ：CACACTCGAGTT-
CTTGTAATTCCTTTTGGA（下划线为 Xho I 酶切位点）
为引物进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为 ：pER8 的
cDNA 模板 1 μL，10 × PCR Buffer 5 μL（含 Mg2+），
2.5 mmol/L 的 dNTP 4 μL，10 μmol/L 上下游引物各
1 μL，Taq DNA 聚合酶 1 μL，Pfu 0.5 μL，加去离子
水至总体积为 50 μL。PCR 反应程序 ：94℃预变性 5
min ；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，
共 30 个循环 ；72℃延伸 5 min。然后用 1% 的琼脂
糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物，胶回收试剂盒切胶
回收 PCR 产物并琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2.2 P0WA 基因的 PCR 扩增 PLRV-P0 的第 87-
140 位氨基酸的原序列如下（方框内为两个 WG 基
序）：WGLLCGTHPAIQIVGLTIVIKLDDPTTAAAYRSE-
LLRVSSSSYIQNAAGLSNGWG 。
以 重 组 质 粒 pGR107P0WA 为 模 板 PCR 扩 增，
将 PLRV-P0 的第 87、140 位的色氨酸（W）点突变
丙氨酸（A），突变之后的序列如下（方框内为两个
WG 基序突变后）：AGLLCGTHPAIQIVGLTIVIKLDD-
PTTAAAYRSELLRVSSSSYIQNAAGLSNGAG 。
以 pGR107-P0WA 质粒为模板，1300-CE-P0W-A
5 ：GTTAATCGATATGATTGTATTGACCCAGTC（ 下
划线为 Cla I 酶切位点）；1300-CE-P0WA 3 ：CACA-
CTCGAGTTCTTGTAATTCCTTTTGGA（下划线为 Xho
I 酶切位点）为引物进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为：
pGR107-P0WA 质粒 DNA 模板 1 μL，10×PCR Buffer
5 μL（含 Mg2+），2.5 mmol/L 的 dNTP 4 μL，10 μmol/L
上下游引物各 1 μL，Taq DNA 聚合酶 1 μL，Pfu 0.5
μL，加去离子水至总体积为 50 μL。PCR 反应程序 ：
94℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，
72℃延伸 45 s，共 30 个循环 ；72℃延伸 5 min。然
后用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物，胶
回收试剂盒切胶回收 PCR 产物并用 1% 的琼脂糖凝
胶电泳检测。
1.2.3 植物表达载体的构建 将纯化后的 P0 基因片
段与质粒 pWM101 分别用限制性内切酶 Sal I 和 Kpn I
进行双酶切 ；然后用限制性内切酶 Cla I 和 Xho I 对
P0，P0WA 基因进行双酶切 ；最后用限制性内切酶
Cla I，Sal I 对质粒载体 pCAMBIA1300-CE 进行酶切。
酶切后产物用胶回收试剂盒进行回收，1% 琼脂糖凝
胶电泳检测回收产物，根据外源片段和载体 DNA 条
带亮度以等摩尔比例用 T4 DNA 连接酶 16℃过夜连
接，连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，涂
布于含卡那霉素（Kan）的 LB 培养基平板上，37℃
倒置培养 12-16 h，挑取单菌落 37℃恒温振荡培养
12-16 h，以菌落为模板进行 PCR 扩增，根据菌落
PCR 结果对号提取重组质粒，然后进行质粒 PCR 和
双酶切鉴定，取 1 mL 菌液送交测序公司进行测序，
测序结果与所设计的目的基因序列进行比对。
1.2.4 农杆菌的转化 取 5 μL 重组质粒加入到 100
μL 农杆菌 GV3101 感受态细胞中，用移液枪迅速吹
打混匀后置于冰上 3-5 min，然后把混合物贴着电击
杯壁缓慢加入，预激（参数 ：电压 2.2 kV，电容 25
μF，阻抗 200 Ω）电激仪，再将电激杯至于电激仪
中进行电激脉冲放电，电激结束后吸出电激混合液
到微量离心管中，加入 600 μL 的 LB 液体培养基（含
50 mg/L Kan，50 mg/L Rif，5 mg/L Tet），28℃条件下
静置 3 h，室温 5 000 r/min 离心 5 min，取 100 μL 菌
液涂布于 LB 固体培养基（含 50 mg/L Kan，50 mg/L
Rif，5 mg/L Tet）平板上，28℃倒置培养 30-40 h，
并对长出的菌落进行菌落 PCR 鉴定。
2013年第3期 73霍晓辉等 ：马铃薯卷叶病毒 P0 蛋白抑制 RNA 沉默及其与 AGO 蛋白的相互作用
1.2.5 烟草的侵染 挑选 5-6 叶期的野生型烟草和
转 GFP 基因的 16c 烟草幼苗用于农杆菌的侵染。从
LB（含 50 mg/L Kan，50 mg/L Rif，5 mg/L Tet）固体
培养基上挑取重组单菌落，接种到 5 mL 的 LB（50
mg/L Kan，50 mg/L Rif，5 mg/L Tet）液体培养基中，
28℃，180 r/min 恒温振荡培养 24-28 h。按 1∶100
的比例把菌液转接到 20 mL 的 LB（50 mg/L Kan，50
mg/L Rif，5 mg/L Tet）液体培养基中，同时在培养
基中加入终浓度为 100 mmol/L 的乙磺酸（MES）和
终浓度为 20 μmol/L 的乙酰丁香酮（Acetosyringone，
AS），于 28℃，180 r/min 振荡培养 16-18 h，然后于 4℃
5 000 r/min 离心 5 min，弃上清，收集菌体。用农杆
菌渗透缓冲液（含 MES、AS、MgCl2，终浓度分别
为 100 mmol/L，20 μmol/L 的和 100 mmol/L）悬浮沉淀，
稀释至 OD600nm 值为 1.0，室温下静置悬浮 3 h，用已
消毒的一次性注射器将农杆菌渗透液注射到烟草叶
片叶脉的两侧，注射完毕后，将烟草置于 28℃恒温
培养室中光照 16 h，黑暗 8 h 培养。
1.2.6 烟草叶片的观察 将烟草叶片放于暗室中用
紫外灯照射观察基因沉默现象并用相机拍照记录。
选取渗透注射过的烟草叶片，用剪刀沿叶脉剪下叶
片。制作玻片标本 ：用洁净的纱布把载玻片、盖玻
片擦拭干净 ；在载玻片的中央滴一滴清水 ；用镊子
夹取叶片浸入玻片中央的水滴中 ；展平叶片 ；用镊
子夹取盖玻片，使它的一边先接触载玻片上的水滴，
然后轻轻盖在叶片上。奥林巴斯 BX51 荧光显微镜
观察烟草叶片并拍照记录。
2 结果
2.1 目的基因的PCR扩增
以 pER8 的 cDNA 为 模 板，PCR 扩 增 PLRV-P0
目的基因 ；以重组质粒 pGR107P0WA 为模板，PCR
扩增 PLRV-P0WA 目的基因，1% 琼脂糖凝胶电泳结
果（图 2）显示，成功扩增出约为 700 bp 的片段，
与预期结果大小一致。
2.2 植物表达载体的构建
将质粒载体 pWEIMING101（Sal I，Kpn I），pC-
AMBIA 1300-CE（Cla I，Sal I）和目的基因片段 P0
（SalI，KpnI ；ClaI，XhoI），P0WA（Cla I，Xho I）进
行双酶切，然后用 T4 DNA 连接酶将载体和目的基因
15000
bp M 1 2
700
10000
7500
2500
1000
250
M ：DNA 标准分子量 ；1 ：P0 基因的 PCR 扩增 ；2 ：P0WA 基因的 PCR 扩增
图 2 P0（P0WA）基因的 PCR 扩增
片段连接，转化大肠杆菌 DH5α 得到重组质粒。经
菌落 PCR 扩增检测呈阳性的克隆分别提取质粒进行
了质粒 PCR，并对重组质粒 pWEIMING101-P0（Sal I，
Kpn I），pCAMBIA1300-CE-P0（P0WA）（Cla I，Sa
lI）进行双酶切鉴定，1% 琼脂糖凝胶电泳检测图谱
中呈现 700 bp 的目的基因条带，与预期结果一致（图
3，图 4），测序结果表明插入片段长度为 700 bp，
与载体的连接方向正确，植物表达载体符合要求（图
5，图 6）。
15000
bpbp
M1
700
10000
7500
2500
1000
250
1 ：pWEIMING101-P0 酶切 ；M ：DNA 标准分子量
图 3 重组质粒 pWEIMING101-P0 双酶切鉴定
bp bp
M 1 2
700
10000
7500
2500
1000
250
M ：DNA 标准分子量 ；1 ：pCAMBIA1300-CE-P0 酶切 ；
2 ：pCAMBIA1300-CE-P0 WA 酶切
图 4 重组质粒 pCAMBIA1300-CE-P0（P0WA）双酶切鉴定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期74
hygromycin(R)
35S
35S
poryA
poryA
prom
pVS1 sta
pWEIMING101
9 961 bp
pVS1 rep
hygromycin(R)
pVS1 sta
pWEIMING101-P0
10 661 bp
pVS1 rep
pBR322hom
Kpn I+Sal I
P0
EcoR I sal I
Kpn I
Hind III35S
35S prom
pBR322 ori
Kanamyrcir(R)
pBR322hom
pBR322 ori
Kanamyrcir(R)
Xho I
Xho I
Xho I
Xho I
EcoR I NraI
Pst I
snil
BamH smal Sat I
Hind III
Xba IIKpn I
pSPYCE(35SF-NoiR)
1
1
pVS1 sta
pCAMBIA1300-CE
10 468 bp
pVS1 rep
pCAMBIA1300-CE
11 384 bp
-P0(P0WA)
pVS1 rep
pVS1 sta
pBR322 hom P0(P0WA)
EcoR I BamHI Cla I Sal I
pSPYCE(35SF-NoiR)
pBR322 oriKanamycin(R)
CaMV35S poly
pBR322 hom
pBR322 oriKanamyrcir(R)
Xho I
Xho I
Bat I
CaMV35S poly
CaMV35S promoterXba I
Hind III
Xho I
Xho I
Bst I
CaMV35S promoter
EcoR I Sal I
BamHl
Hind III
Xba II
Cla I+Sal I
图 5 pWEIMING101-P0 植物表达载体的构建 图 6 pCAMBIA1300-CE-P0（P0WA）植物表达载体的构建
A B
T2b
GFP+
P0
A ：GFP 和 T2b 共同表达结果 ；B ：GFP 和 P0 共同表达结果。（叶脉左侧为
GFP 单独表达作为对照）
图 7 PLRV-P0 抑制 RNA 基因沉默的鉴定
2.3 PLRV-P0抑制RNA基因沉默
将重组质粒 pWEIMING101-P0 电击转化农杆菌
GV3101，同时与 GFP 等体积混合共同渗透注射转
GFP 基因的（16c）烟草叶片。单独渗透注射含 GFP
基因的农杆菌菌液作为阴性对照，等体积混合渗透
注射含 GFP 和 T2b 基因的农杆菌菌液作为阳性对照，
暗室中紫外灯下观察发现在渗透注射后的第 6 天等
体积混合 GFP 和 PLRV-P0 的农杆菌菌液共同注射的
烟草叶片中有很强的绿色荧光出现，而单独渗透注
射 GFP 的叶片中则没有绿色荧光的出现（图 7）。研
究表明 PLRV-P0 确实能抑制 GFP mRNA 引起的基因
沉默。
为了保证试验的可靠性，每个试验组合渗透注
射 50 片烟草叶片，并重复至少 3 次，共 150 片叶片，
第 6 天在紫外灯下观察并进行数据统计分析，如表 1。
经分析表明 PLRV-P0 能抑制 GFP mRNA 引起的基因
沉默。
2.4 PLRV-P0和AGO相互作用荧光观察
利用农杆菌渗透注射技术把制备好的渗透注射
液分别以 ASK-NE+ASK-CE，P0-CE+AGO-NE，P0WA-
CE+AGO-NE，P0-NE+AGO-CE，1300-CE+AGO-NE，
1300-CE+1300-NE 渗透注射液组合注射本氏（Nicoti-
2013年第3期 75霍晓辉等 ：马铃薯卷叶病毒 P0 蛋白抑制 RNA 沉默及其与 AGO 蛋白的相互作用
设置了 1300-CE+1300-NE 为阴性对照。在渗透注射
后的第 24、36、48、60、72 及 96 h 分别取材进行
荧光显微镜观察，通过观察发现，在 36 h 时开始出
现荧光，在 48 h 已经有大量荧光的表达，60 h 仍然
有荧光存在，但明显不如 48 h 时亮，72 h 时只有少
量荧光表达（图 8）。每组试验渗透注射 10 片叶片，
重复至少 3 次，数据统计结果如表 2 所示，统计结
果表明 P0 能够与 AGO1 发生相互作用，产生荧光。
在第 48 h 时对所观察到的荧光用奥林巴斯 BX51 系
统照相，ASK-NE+ASK-CE 有大量的绿色荧光，说明
试验基本操作正确 ；P0-CE+AGO-NE 有绿色荧光的
出现，说明 P0 能够和 AGO 蛋白发生相互作用 ；P0-
CE+1300-NE、1300-CE+AGO-NE、1300-CE+1300-
NE 均没有绿色荧光的出现，分别排除了 P0 和 NE，AGO
和 CE，CE 和 NE 相互作用的可能性。这些结果表明，
PLRV-P0 确实能够和 AGO 蛋白发生相互作用。
3 讨论
目前已鉴定的马铃薯卷叶病毒属中的 RSS 只有
马铃薯卷叶病毒，甜菜西方黄化病毒，南瓜蚜传黄
化病毒和甜瓜蚜传黄化病毒（MABYV）编码的 P0
蛋白，但对其机制都还不清楚，而我们通过研究验
证了 PLRV-P0 确实能抑制 RNA 沉默。这对 PLRV-
P0 的抑制机制的研究有着重要的意义。
新近研究发现，一些抑制因子中含有的重复甘
氨酸、色氨酸（GW/WG motif）是与 AGO 相互作用
的关键氨基酸，序列中 GW/WG 重复二次至多次可
以作为“AGO 钩”（Ago hook）与 AGO 蛋白结合并
在基因沉默中发挥作用，这类抑制因子广泛存在于
酵母、植物和动物的细胞中［6］。例如，新近的研究
发现芜箐邹缩病毒（TCV）外壳蛋白 P38 中的二个
表 1 PLRV-P0 抑制 RNA 沉默数据统计
ana benthamiana）烟草叶片。注射完毕以后，将烟
草置于 28℃的培养室中进行培养。逐日获取注射叶
片在奥林巴斯 BX51 荧光显微镜下观察。前期试验
过程中发现 ASK-NE+ASK-CE 渗透注射烟草的第 2、
3 天能够发出很强的荧光，因此这里用它作为阳性
对照，为了排除了 YFP 的 N 末端和 C 末端单独作用，
A B C
D E F
A ： ASK-NE 和 ASK-CE 共同注射荧光观察 ； B ：P0-CE 和 AGO-NE 共同注
射荧光观察 ；C ：P0WA-CE 和 AGO-NE 共同注射荧光观察 ；D ：P0-CE 和
1300-NE 共同注射荧光观察 ；E ：1300-CE 和 AGO-NE 共同注射荧光观察 ；F ：
1300-CE 和 1300-NE 共同注射荧光观察
图 8 PLRV-P0 和 AGO 相互作用的荧光观察
表 2 渗透注射的烟草叶片出现荧光的时间
相互作用类别
烟草叶片出现荧光的时间（h）
出现荧光的叶片数量（共计 30）
24 36 48 60 72
ASK-NE+ASK-CE - + +++ ++ + 27
P0-CE+AGO-NE - + +++ ++ + 25
P0WA-CE+AGO-NE - - - - - 0
P0-CE+1300-NE - - - - - 0
1300-CE+AGO-NE - - - - - 0
1300-CE+1300-NE - - - - - 0
+++，++，+ ：分别表示荧光由强到弱 ；- ：表示无荧光
统计次数 试验组合 表达有 GFP 的叶片数量
第 1 次统计 GFP 0
GFP+T2b 47
GFP+P0 46
第 2 次统计 GFP 0
GFP+T2b 48
GFP+P0 46
第 3 次统计 GFP 0
GFP+T2b 48
GFP+P0 47
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期76
GW 重复是与 AGO 相互作用的关键氨基酸，P38 与
AGO 的相互作用同时影响 DCL 的表达［7］。我们通
过序列分析首先发现，P0 基因序列中含有两个重复
的 WG 基序，而 WG 基序可以作为 AGO 钩和 AGO
蛋白结合，所以 P0 可能是通过与 AGO 结合抑制
RNA 沉默，荧光互作试验结果证明，P0 蛋白确实能
够和 AGO 蛋白发生相互作用，PLRV-P0 的两个重复
的 WG 基序是其与 AGO 蛋白发生相互作用的关键氨
基酸。
已有研究报道，有些病毒可以通过与 AGO 蛋白
结合，并进一步作用于其下游的 F-box 泛素降解途径，
从而抑制 RNA 沉默。在 PLRV-P0 的研究中，我们
已经证明了 P0 确实能和 AGO 蛋白结合，但究竟其
是不是通过进一步作用于 F-box 泛素降解途径还有
待于进一步验证。另外，我们试图通过 Pull down 和
Western blot 分子验证，证明 PLRV-P0 确实和 AGO
蛋白相互作用，并通过其结合抑制 RNA 沉默。但是，
PLRV-P0 蛋白和 AGO 相互作用观察过程中，荧光显
微镜下观察到的荧光很少，提取的总蛋白中互作的
蛋白也很少，因此 Pull down 和 Western blot 检测过
程中还没有得到预期结果，可能正是因为 PLRV-P0
和 AGO 结合后，作用于 F-box 泛素降解途径引起了
AGO 的降解，所以才导致这种情况的出现。
4 结论
马 铃 薯 卷 叶 病 毒 运 动 蛋 白 的 P0 蛋 白 是 一 个
RNA 沉默抑制因子，它可以抑制由 GFP 的 mRNA
引起的基因沉默 ；P0 蛋白抑制 GFP mRNA 基因沉默
的机制是通过与 AGO 蛋白的相互作用，其关键氨基
酸是 P0 蛋白的 WG 基序。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）