全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-11-02
基金项目 : 哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目（RC2009XK001004）, 黑龙江省科技攻关项目（GA08B101）, 黑龙江大学高层次人才（创
新团队）支持计划（Hdtd2010-05）
作者简介 : 于海鹏 , 男 , 硕士 , 研究实习员 ; E-mail: yuhaipeng1985@sina.com
通讯作者 : 李海英 , 女 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 植物分子生态学 ; E-mail: lvzh3000@sina.com
大豆血红蛋白基因 lba 转化根瘤菌工程菌株的构建
于海鹏1,2,3 潘钰1,2 蒙明明1,2 李海英1,2
（1黑龙江大学生命科学学院 黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室，哈尔滨 150080 ；2黑龙江大学 农业微生物技术教育部
工程研究中心，哈尔滨 150500 ；3中国农业科学院农业信息研究所，北京 100081）
摘 要 : 以土著大豆根瘤菌接种大豆幼苗 45 d 后获得的根瘤为材料，提取其总 RNA 并反转录成 cDNA，采用同源序列克
隆法扩增大豆血红蛋白基因 lba 编码区序列。利用 DNA 重组技术，将 lba 基因连到 lac 启动子的下游，利用带有发光酶标记基
因 luxAB 的质粒载体 pTR102 构建表达载体 pTR-Plac-lba。采用三亲本杂交的方式，将表达载体 pTR-Plac-lba 及作为对照的空载体
pTR102 分别转化土著大豆根瘤菌，获得根瘤菌工程菌株 SFH（pTR-Plac-lba）和 SFH（pTR102）。盆栽试验发现，接种 SFH（pTR-
Plac-lba）的大豆植株各生理指标明显高于接种 SFH（pTR102）、土著根瘤菌以及未接菌的大豆植株各生理指标。试验证明，导入大
豆血红蛋白基因 lba 的根瘤菌工程菌株 SFH（pTR-Plac-lba）对于提高大豆根瘤的固氮酶活性，增加大豆产量起到显著效果。
关键词 : 土著大豆根瘤菌 大豆血红蛋白基因 lba DNA 重组技术 工程菌株 三亲本杂交
Construction of Genetic Engineering Strain of Introduction Glycine
max Leghemoglobin Gene of lba into Native Rhizobium japonicum
Yu Haipeng1,2,3 Pan Yu1,2 Meng Mingming1,2 Li Haiying1,2
（1Key Laboratory of Molecular Biology of Heilongjiang Province, College of Life Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080 ；2Engineering
Research Center of Agricultural Microbiology Technology, Ministry of Education, Heilongjiang University, Harbin 150500 ；3Agriculture
Information Institute of CAAS, Beijing 100081）
Abstract: The nodules were obtained from soybean seedlings which were inoculated by native Rhizobium japonicum for 45 days.
Moreover, the total RNA of soybean nodule was extracted and reversed transcript into cDNA, which was used to clone Glycine max leghemoglobin
gene lba by Homology-based cloning. The lba gene was inserted into the downstream of lac promoter, and expression vector pTR-Plac-lba was
constructed using plasmid pTR102 with marker gene luxAB by the DNA recombinant technique. The expression vector pTR-Plac-lba and empty
vector plasmids pTR102 were respectively transformed into native Rhizobium japonicum with method of triparental hybridization to construct
engineering strains SFH（pTR-Plac-lba） and SFH（pTR102）. Pot experiment results showed that the physiological indexes of soybean plants
infected by SFH（pTR-Plac-lba） were significantly higher than that infected by SFH（pTR102）, native Rhizobium japonicum and that were
not infected. The results showed that engineering strains SFH （pTR-Plac-lba） which was imported Glycine max leghemoglobin gene lba had a
significant effect on increaseing the soybean root nodule nitrogenase activity and soybean production.
Key words: Native Rhizobium japonicum Glycine max leghemoglobin gene lba DNA recombinant technique Engineering strain
Triparental hybridization
氮是生物生长、发育的必需元素，是组成核
酸及蛋白质的主要物质。自然界中的氮主要以游离
在大气中的气态氮的形式存在，约占空气总体积的
80%，并且不能够被大多数生物直接利用［1］。据统计，
地球上结合态氮总量有 70% 来源于生物固氮，每年
全球微生物固定的氮素总量可达 2 亿吨，约占全球
作物需氮量的 75%，相当于工业生产氮肥的 3 倍多［2］。
与化学肥料相比，生物固氮在提高粮食产量的同时
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期70
降低了化肥用量和生产成本，减小环境污染，是取
之不尽用之不竭的廉价氮源，对于推动农业与生态
环境的可持续发展具有重要意义［3］。
研究发现，在根瘤固氮过程中大豆血红蛋白发
挥着重要作用，它能够调节类菌体内的氧浓度，保
持类菌体内的低氧环境 ；同时保护对氧气敏感的固
氮酶，以维持其活性。并且根瘤中固氮酶的活性与
大豆血红蛋白含量呈正相关性，即只有大豆血红蛋
白丰富的红色根瘤才具有固氮能力［4, 5］。大豆血红蛋
白是由大豆植株中一类只在根瘤中特异表达的“隐
性基因”编码，为一个多基因家族，包括 lba、lbc1、
lbc2、lbc3 四个主要基因［6, 7］。
本研究采用同源序列克隆法克隆大豆血红蛋
白基因 lba，利用 DNA 重组技术构建原核表达载体
pTR-Plac-lba，并通过三亲本杂交法［8］将其导入土著
大豆根瘤菌中，构建出能够自身合成大豆血红蛋白
的根瘤菌工程菌株 SFH（pTR-Plac-lba），旨在为大豆
植株生长提供充足的氮源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植物 大豆（合丰 55），购自黑龙江省
农业科学院。
1.1.2 菌株及质粒载体 土著大豆根瘤菌分离自
哈尔滨周边大豆种植区，由本实验室鉴定并保藏 ；
E.coli DH5α（pET-Plac）由本实验室构建并保藏；E.coli
DH5α（pTR102）及 E. coli MM294（pRK2073）由华
中农业大学周俊初教授惠赠 ；pMD18-T 载体购自
TaKaRa 生物公司。
1.2 方法
1.2.1 大豆根瘤 cDNA 的制备 将土著大豆根瘤菌
扩培至对数期，并接种大豆（合丰 55）幼苗，盆栽
培养 45 d 后摘取根瘤。采用 TRIzol 一步法，提取
大豆根瘤总 RNA，并通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分
光光度计检测所提 RNA 的质量及浓度。以检测后
的 RNA 为模板，进行 RT-PCR 反应，获得大豆根瘤
cDNA。
1.2.2 lba 基因的克隆 以大豆根瘤 cDNA 为模板，
采用同源序列克隆法，设计 lba 基因的特异性引
物。上游引物 5-CGCCCATGGTTGCTTTCACTGAG-3
（ 下 划 线 部 分 为 Nco I 酶 切 位 点 ）；下 游 引 物
5-GCGCTCGAGTGCCTTCTTAATAGCT-3（下划线部
分为 Xho I 酶切位点），利用 PCR 方法扩增目的基因
lba 编码区全长。回收 PCR 产物与 pMD18-T Vector
Kit 进行连接并转化至 E.coli DH5α，送交生物公司进
行测序。
1.2.3 原核表达载体 pTR-Plac-lba 的构建 采用碱
裂解法提取质粒载体 pET-Plac，利用限制性内切酶
Nco I 和 Xho I 分别对 lba 基因和质粒载体 pET-Plac 进
行双酶切，酶切后连接，获得重组载体 pET-Plac-lba，
并将其转化 E.coli DH5α 感受态细胞，PCR 筛选阳性
克隆子，提取重组质粒 pET-Plac-lba 并进行双酶切鉴
定。以重组质粒 pET-Plac-lba 为模板，利用通用引物（上
游 引 物 5-CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3 ；
下 游 引 物 5-CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA-
3，引物中下划线部分为 Kpn I 酶切位点）PCR 扩增
目的片段 Plac-lba。
碱裂解法提取质粒载体 pTR102，用限制性内切
酶 Kpn I 分别对目的片段 Plac-lba 及质粒载体 pTR102
进行酶切反应，酶切后连接，构建原核表达载体
pTR-Plac-lba（图 1），并转化 E.coli DH5α 感受态细胞，
PCR 筛选阳性克隆子，提取重组质粒 pTR-Plac-lba 并
进行双酶切鉴定。
图 1 原核表达载体 pTR-Plac-lba 示意图
1.2.4 根瘤菌工程菌株的构建 采用三亲本杂交
法，通过辅助质粒 pRK2073 将对照空载体 pTR102
和原核表达载体 pTR-Plac-lba 分别转化土著大豆根
瘤菌，构建根瘤菌工程菌株 SFH（pTR102）和 SFH
2012年第2期 71于海鹏等 ：大豆血红蛋白基因 lba 转化根瘤菌工程菌株的构建
（pTR-Plac-lba）。利用载体 pTR-Plac-lba 带有发光酶基
因 luxAB 和氨苄青霉素抗性（AmpR）的特点，通过
氨苄青霉素抗性筛选及癸醛发光检测，筛选出转基
因工程菌株，并用 X 光片进行结果记录。
1.2.5 根瘤菌工程菌株的检测
1.2.5.1 转基因工程菌株 RT-PCR 检测 分别将 SFH
（pTR-Plac-lba）、SFH（pTR102）及土著大豆根瘤菌
扩培至对数期并收集菌体，采用 TRIzol 一步法，提
取根瘤菌总 RNA，并分别以其为模板进行 RT-PCR
检测。
1.2.5.2 质粒遗传稳定性检测 自生条件下质粒的
遗传稳定性检测 ：挑取构建成功的根瘤菌工程菌株
的单菌落，分别接种于 YMA（AmpR）平板培养基上，
置于 28℃恒温箱中培养 72 h，连续转接 10 次，对
每次培养的菌落进行发光性检测，并记录检测结果。
共生条件下质粒的遗传稳定性检测 ：将构建成
功的根瘤菌工程菌株扩培至对数期并制成菌悬液，
接种大豆幼苗，光照培养 3-4 周后，摘下根系上的
根瘤并用灭菌的刀片将根瘤切开，放置于平皿中，
向平皿中加入 50 μL 的癸醛溶液，在暗室中观察根
瘤发光结果，并进行记录。
1.2.5.3 大豆盆栽试验 挑选颗粒饱满大小均匀的
大豆种子，首先用 95% 乙醇预处理 10 min，无菌水
漂洗后用 0.1% 升汞表面灭菌 10 min（也可用 10%
次氯酸钠 15 min），最后用无菌水冲洗 4-5 次，每次
5 min。将灭菌后的大豆种子浸泡在无菌水中充分吸
涨后，于 28℃催芽 48 h，将催芽后的种子播种到装
有基质（草炭土、蛭石和沙土按 1 1 1 混合并灭菌）
的培养槽中，向不同的培养槽中分别接种 SFH（pTR-
Plac-lba）、SFH（pTR102）及土著大豆根瘤菌（每株
接种 1 mL 浓度为 109 个活菌 /mL 的菌悬液），并以
未接根瘤菌的大豆植株为空白对照，将培养槽置于
光照培养室中浇灌无氮营养液培养。
培养 45 d 后，测定大豆植株高度、植株鲜重和
干重、结瘤数量以及固氮酶活性，待大豆成熟后测
定其产量。
1.2.5.4 固氮酶活性的测定 采用乙炔还原法，将收
集的新鲜根瘤置于 100 mL 血清瓶中，塞上胶塞密封
后抽出 10 mL 气体，再注入 10 mL 乙炔气体，将样
品放置在 28℃恒温培养箱中反应 3 h。用微量进样
器抽取 25 μL 样品气样，注入气相色谱仪中 （GDX-502
填充柱，INJ 100，OVEN 60，FID 100，衰减 3），测
定生成乙烯峰值，根据相同条件下乙烯的标准曲线
计算样品的固氮酶活性，用每分钟每克根瘤还原乙
烯的物质的量表示（即 nmol C2H4/g/min）［9］。
2 结果
2.1 大豆根瘤总RNA提取结果
采用 TRIzol 一步法获得大豆根瘤总 RNA，检测
结果如图 2 所示，获得的 RNA 没有降解，质量较
高。RNA 浓度为 0.984 μg/μL，A260/A280=1.949，A260/
A230=2.066，可用于反转录反应。
2.2 lba基因的克隆与生物信息学分析结果
以大豆根瘤 cDNA 为模板，通过 PCR 扩增目的
基因 lba 编码区全长，检测结果如图 3 所示。获得
约 500 bp 的特异条带，与预期条带大小一致。
通过 NCBI 网站中的 BLASTn 程序对测序获得
的 lba 基因核苷酸序列进行在线分析，结果所克隆
的 lba 基因序列与 NCBI 数据库中已收录的 Glycine
max leghemoglobin gene（Lba gene）基因的核苷酸序
列相似性高达 100%。可以确定该基因为大豆根瘤中
的血红蛋白 lba 基因。
图 2 大豆根瘤总 RNA
M. DNA Marker DL2000 ；1,2. lba 基因的 PCR 产物
图 3 lba 基因 PCR 产物
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期72
2.3 原核表达载体pTR-Plac-lba构建结果
利用限制性内切酶 Nco I 和 Xho I 对重组载体
pET-Plac-lba 进行双酶切验证，结果如图 4 所示。重
组质粒 pET-Plac-lba 经双酶切后，产生两条特异性条
带，其大小分别与载体 pET-Plac 及 lba 基因的大小一
致，可以确定目的片段已经正确连入载体 pET-Plac
指定位置。
利用限制性内切酶 Kpn I 对原核表达载体 pTR-
Plac-lba 进行酶切验证，结果如图 5 所示。载体 pTR-
Plac-lba 经酶切后，分别得到大小约为 15 000 bp 和
1 000 bp 的两条特异条带，与预期一致，可以确认
目的片段 Plac-lba 已准确的连入载体 pTR102 中。
M1. DNA Marker DL2000 ；M2. DNA Marker DL15000 ；
1. 重组载体 pET-Plac-lba 的双酶切产物
图 4 重组载体 pET-Plac-lba 的酶切鉴定
M1. DNA Marker DL2000 ；M2. DNA Marker DL15000 ；
1. 原核表达载体 pTR-Plac-lba 的酶切产物
图 5 原核表达载体的酶切鉴定
2.4 转基因工程菌株的菌落发光活性检测结果
由 于 质 粒 载 体 pTR102 和 pTR-Plac-lba 中 带 有
luxAB 发光酶标记基因，因此利用 1% 的癸醛溶液
对培养的根瘤菌接合子 SFH（pTR102） 和 SFH（pTR-
Plac-lba）进行发光性检测，结果如图 6 所示。由图 6
可见，X 光片中曝光的黑点即为平板中的发光菌落，
说明质粒载体 pTR102 和 pTR-Plac-lba 已分别成功导
入土著大豆根瘤菌。
A. 根瘤菌工程菌株 SFH（pTR102）发光性检测结果 ; B. 根瘤菌工程菌株 SFH（pTR-Plac-lba） 发光性检测结果
图 6 工程菌株菌落发光性检测结果
2.5 转基因工程菌株RT-PCR检测结果
分别对提取的工程菌株及土著大豆根瘤菌总
RNA 进行凝胶电泳检测，结果如图 7 所示。
以提取的根瘤菌总 RNA 为模板分别进行 RT-
PCR 检 测， 结 果 如 图 8 所 示。 由 图 8 可 知， 以
SFH（pTR-Plac-lba） 总 RNA 为 模 板 的 RT-PCR 反
应扩增得到约 1 000 bp 的片段，与插入的目的片
段 大 小 相 同， 而 土 著 大 豆 根 瘤 菌 总 RNA 和 SFH
（pTR102）总 RNA 为模板的 RT-PCR 反应未扩增
出任何条带。
2.6 质粒遗传稳定性检测结果
对质粒的遗传稳定性进行检测，记录结果如
表 1、 表 2 所 示。 自 生 条 件 下， 连 续 转 接 10 代
的工程菌株的菌落发光性保持率均为 100% ；共
A B
2012年第2期 73于海鹏等 ：大豆血红蛋白基因 lba 转化根瘤菌工程菌株的构建
2.7 大豆盆栽试验结果
将转基因根瘤菌工程菌株 SFH（pTR-Plac-lba）
接种大豆植株，并以分别接种土著大豆根瘤菌、根
瘤菌工程菌株 SFH（pTR102）及不接种根瘤菌的大
豆植株作为对照，进行盆栽试验，45 d 后测定大豆
植株高度、鲜重和干重、结瘤数量以及固氮酶活性，
待大豆成熟后测定其产量。对测得的数据进行统计
分析，并利用 SigmaPlot 2000 软件作图，结果如图 9
所示。接种转基因根瘤菌工程菌株 SFH （pTR-Plac-lba）
的大豆植株与未接菌和接种土著大豆根瘤菌或接种
根瘤菌工程菌株 SFH（pTR102）的大豆植株相比，
在株高（图 9-A）、鲜重（图 9-B ）、干重（图 9-C）、
结瘤数（图 9-D）、固氮酶活性（图 9-E）以及大豆
产量（图 9-F）等方面均有极显著提高。对于接种
土著大豆根瘤菌的大豆植株与接种根瘤菌工程菌株
SFH（pTR102）的大豆植株，两者各种生理指标无
显著差异 ；但两者与未接菌的大豆植株相比，各生
理指标都有显著提高。
3 讨论
大豆植株中的大豆血红蛋白基因为“隐性基因”，
其表达具有明显的时空特异性。在未结瘤的大豆植
株的各个组织器官中都检测不到其 mRNA 的存在，
只有当根瘤菌侵入大豆根系后，才在大豆植株根部
特异表达［10］，并编码相应的大豆血红蛋白，以确保
固氮作用的正常进行［7］。因此，研究增加大豆血红
蛋白表达对固氮酶活性及产量的影响具有重要的现
实价值。
三亲本杂交法属于一种结合转移的细菌遗传重
组方式 , 其原理是供体菌、辅助菌及受体菌的细胞
通过结合作用紧密接触，使供体菌中的质粒在辅助
菌的协助下以接合转移的方式转入受体菌细胞中［8］。
由于根瘤菌细胞较小、细胞壁较厚、并且分泌胞外
多糖，因此，三亲本杂交法是将外源重组质粒转入
根瘤菌的最佳选择。因本研究所构建的原核表达载
体不带有 tra 转移基因，无法自行转移出供体细胞，
所以必须在带有 tra 转移基因的辅助质粒 pRK2073
的参与下才能将目的质粒导入受体细胞。
4 结论
本研究成功构建了转入大豆血红蛋白基因 lba
的原核表达载体 pTR-Plac-lba，通过三亲本杂交的
方式将其导入土著大豆根瘤菌，获得能够自身合成
大豆血红蛋白的转基因根瘤菌工程菌株 SFH（pTR-
Plac-lba）。通过盆栽试验证明，根瘤菌工程菌株 SFH
（pTR-Plac-lba）对于提高大豆根瘤的固氮酶活性，增
加大豆产量起到显著效果。
菌株名称
转接次数与质粒保持率（%）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
SFH（pTR102） 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
SFH（pTR-Plac-lba） 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
表 1 自生条件下重组质粒的遗传保持率
工程菌株 检测根瘤数 发光根瘤数 发光根瘤百分率（%）
SFH（pTR102） 154 154 100
SFH（pTR-Plac-lba） 165 165 100
表 2 工程菌株在共生条件下根瘤的发光性检测结果
生条件下，接种工程菌株的大豆根瘤的发光率为
100%。由此证实，在自生和共生条件下质粒均能
稳定遗传。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期74
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（责任编辑 李楠）