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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
农业生产中由害虫造成的损失占农作物总损失
的 15% 以上，因此对害虫的防治是农业生产中的一
项重要任务。传统的害虫防治主要为化学防治，但
长期使用化学农药会影响人类健康并对环境造成污
染。而生物农药以其简便有效，对环境和生物安全
的优点，引起了世人的高度重视［1］。目前苏云金芽
孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是世界上研究最
为深入、应用面最广的杀虫微生物。但在实际应用
中由于长期使用 Bt，使得多种害虫对 Bt 产生了抗性，
其中夜蛾科害虫粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）对 Bt 制
剂产生抗性的防治尤为棘手［2］。群体感应（Quorum
收稿日期 ： 2013-12-19
基金项目 ：河北省自然科学基金项目（C2011302008）
作者简介 ：黄媛媛，女，助理研究员，硕士，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：yuanyuanh0127@sina.com ；马宏同为本文第一作者
通讯作者 ：宋水山，男，博士，研究员，研究方向 ：微生物与生物技术 ；E-mail ：shuishans@hotmail.com
粉纹夜蛾中肠微生物中产 AHLs 群体感应信号分子
菌株的分离鉴定
黄媛媛1，2 马宏1，2 贾振华1，2 黄亚丽1，2 宋水山1，2 张霞 1，2
（1. 河北省科学院生物研究所，石家庄 050081 ；2. 河北省主要农作物病害微生物控制工程技术研究中心，石家庄 050081）
摘 要 ： 利用紫色杆菌（Chromobacterium violaceum CV026）报告系统从粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）中肠中分离出两株可
以产群体感应信号分子的菌株 Tni-9 和 Se-9。通过 16S rDNA 序列分析结果可知，分离菌株均与蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii
ATCC 43186）有高度同源性，在系统发育树内位于同一分支。选取菌株 Se-9 进行生理生化特性鉴定，进一步证实该菌株为蒙氏肠
球菌。将菌株 Se-9 进行薄层层析分析，发现该菌株可以产生两种群体感应信号分子 C6-HSL 和 3OC6-HSL。
关键词 ： 粉纹夜蛾 中肠微生物 群体感应 薄层层析 分离 鉴定
Isolation and Identification of Accumulation of Quorum Signal
Molecules Strains from the Trichoplusia ni Midgut
Huang Yuanyuan1，2 Ma Hong1，2 Jia Zhenhua1，2 Huang Yali 1，2 Song Shuishan1，2 Zhang Xia 1，2
（Biology Institute，Hebei Academy of Sciences，Shijiazhuang 050081 ；2.Hebei Engineering and Technology Center of Microbiological Control
on Main Crop Disease，Shijiazhuang 050081）
Abstract: Two strains named Tni-9 and Se-9 were isolated from Trichoplusia ni midgut by CV026 report system. The 16S rDNA
sequences of the isolates were studied, blast analysis and the phylogenetic tree showed their 16S rDNA were highly homologous to that of
Enterococcus mundtii ATCC 43186. By the physiological and biochemical characteristics, the strain Se-9 was further confirmed belong to
Enterococcus mundtii .TLC analysis present that Se-9 could produce C6-HSL and 3OC6-HSL quorum sensing signals respecctively.
Key words: Trichoplusia ni Gut microorganism quorum sensing TLC analysis Isolation Identification
sensing，QS）系统是指细菌细胞根据密度变化进行
基因表达调控的生理行为［3］，群体感应参与多种生
物学功能调节，如调控细菌毒性因子产生、抗生素
合成、生物膜形成等［4］，调节植物生长、提高植物
抗病性、对耐非生物胁迫中的作用等［5］。近年来有
研究发现昆虫中肠细菌也具有群体感应现象，2007
年，Guan 等［6］鉴定了来自舞毒蛾幼虫中肠免培养
细菌的信号分子合成基因，该研究属首次从免培养
细菌中鉴定新的群体感应诱导子类别。之后，Borlee
等［7］研究了菜粉蝶幼虫中肠土著微生物和致病微生
物产群体感应信号分子的情况，该研究证实在菜粉
2014年第7期 197黄媛媛等 ：粉纹夜蛾中肠微生物中产 AHLs 群体感应信号分子菌株的分离鉴定
蝶幼虫的碱性肠道环境中细菌之间的信号分子 AHL
是可以进行交流的，并且有利于 PAO1 的致病性。
粉纹夜蛾作为昆虫中肠防御体系研究最为深入的昆
虫，主要集中在中肠围食膜蛋白结构和 Bt 杀虫蛋白
受体方面，而对粉纹夜蛾中肠微生物群体感应的研
究尚未见系统报道。
从细菌群体感应现象出发，探索粉纹夜蛾中肠
中产信号分子的微生物与 Bt 杀虫剂的相互作用，是
强化 Bt 的杀虫作用、增强害虫生物防治效果的一个
新途径，具有重要的理论和实际意义。本研究从粉
纹夜蛾中肠中进行产群体感应信号分子菌株的筛选，
通过形态观察，生理生化鉴定和分子生物学鉴定来
确定该菌的种属，并分析其产生信号分子的种类。
该研究的进行对明确和阐明粉纹夜蛾中肠细菌群体
感应系统对 Bt 杀虫活性的可能作用与分子机理，有
望为提高生物杀虫剂防效和预防害虫对生物杀虫剂
的抗性提供新的途径与新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料
大 肠 杆 菌（Escherichia coli）DH5α， 紫 色 杆 菌
（Chromobacterium violaceum）CV026 由本实验室保存，
pMD18-T 购自宝生物工程（大连）有限公司，粉纹
夜蛾幼虫由河北农业大学郭巍教授实验室提供，信
号分子标准品（C6-HSL、3O C6-HSL）购自 Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 粉纹夜蛾中肠微生物菌株分离 选取健康粉
纹夜蛾幼虫 3 条，杀死后 75 % 的酒精中消毒 10 s、
0.1% 升汞液中消毒 2 min，灭菌水冲洗 3 次，之后
在无菌条件下解剖出中肠组织研磨，采用梯度稀释
法将研磨液稀释至 1×10 -6、1×10 -7、1×10-8，并
吸 3 个浓度的稀释液各 100 μL 分别涂布于 LB 平板
中，各稀释度重复 3 次，置于 30℃恒温培养箱培养
72 h，观察记录菌株生长情况，然后挑取菌落形态
差异明显的菌落，依次编号并进行多次纯化，得到
单菌落后 LB 试管保存备用［8］。
1.2.2 产 AHLs 群体感应信号分子菌株的筛选 将
过夜培养的报告菌 CV026 与 50 mL 含有 1.5% 琼脂
的 LB 培养基混合，倒平板。在平板底部画出十字
方格，将保存的从粉纹夜蛾消化道中分离出来的不
同菌株用牙签点接在每个方格中，30℃恒温培养，
定时观察各个菌株的生长及产生色素情况，如果菌
株周围产生紫色则初步确定该菌株为产生信号分子
的菌株。
1.2.3 菌落及菌体形态观察 将筛选出来的产信号
分子的菌株划线接种到 LB 固体培养基中，30℃恒
温培养 48 h，观察并记录 LB 培养基上出现的单菌
落形态。挑取单菌落的菌体进行 Gram 染色，在光
学显微镜下观察菌体形状、染色、产芽孢等情况［9］。
1.2.4 微 生 物 菌 株 的 16S rDNA 扩 增 及 扩 增 片 段
的测序 将产 AHLs 信号分子的菌株接种到 LB 培
养基中，30℃过夜培养，离心获得菌体后采用天
根 基 因 组 DNA 小 提 试 剂 盒 提 取 基 因 组 DNA。 以
提 取 的 细 菌 DNA 作 为 模 板， 以 16S rDNA 通 用
引 物 ：5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 和 II ：
5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 为引物对进行 PCR
扩增，PCR 反应体系为（20 μL）：10× Buffer 2 μL，
10 mmol/L dNTP 2 μL，rTaq 0.2 μL， 模 板 1 μL， 上
下游引物各 1 μL，灭菌双蒸水 12.8 μL。PCR 扩增
程序 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 1 min，56℃退
火 1 min，72℃延伸 1 min，30 个循环 ；72℃延伸 10
min。反应结束后 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，
将扩增正确的 PCR 产物送上海生工生物技术有限公
司测序。
1.2.5 菌株 16S rDNA 序列的系统发育分析 将菌
株 的 16S rDNA 测 序 结 果 输 入 到 GenBank 中， 用
BLAST 程序与数据库中的所有序列进行比较，利用
Clustal 软件进行多序列比对并计算进化距离，采用
Mega 5.2 软件进行系统发育树的构建。
1.2.6 菌株生理生化反应测定 基于细菌的 16S
rDNA 分子生物学方法鉴定的初步结果，参考伯杰氏
细菌鉴定手册，进行蒙氏肠球菌特异性生理生化反
应，包括运行性测定液体基础培养基、耐盐性试验、
是否产 H2S、不同糖类利用情况、乙酰甲基甲醇试
验（V-P 试验）、甲基红试验（M.R 试验）、吲哚试验、
硝酸盐还原试验测定等，进行细菌生理生化鉴定［10］。
1.2.7 信号分子的提取及鉴定 将产 AHLs 菌株接
种到 LB 培养基中过夜培养，菌液 5 000 r/min 离心 3
min，吸取上清液后加入等体积二氯甲烷进行萃取，
将有机相旋转蒸发后重溶于 1 mL 乙腈中，即得到信
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期198
号分子样品。用微量移液器将 4 μL 样品点在 C18 反
相薄层板上，用甲醇水（6040，V/V）的展开
剂展开，充分展开后蒸发溶剂，用混有 C. violaceum
026 检测菌株的软琼脂覆盖在薄层板上，30℃过夜
培养后观察试验结果的显色情况［11］。
2 结果
2.1 产群体感应信号分子菌株的分离
通过稀释涂平板的方法从粉纹夜蛾中肠中共分
离出细菌 120 株，将这些菌株为备用菌株进行产信
号分子菌株的筛选。
产 AHLs 信号分子菌株的分离采用平板筛选法，
用的报告菌为 Chromobacterium violaceum CV026，通
过该方法，从 120 株菌株分离出 2 株产信号分子的
菌株（图 1），菌株编号分别为 Tni-9 和 Se-9。
别为 ：KF551916，KF551917）。根据 16S rDNA 序列
对 Tni-9、Se-9 相近物种进行聚类分析及系统发育树
的构建，结果（图 5）表明 Tni-9、Se-9 的 16S rDNA
序列与蒙氏肠球菌的序列同源性最近，初步鉴定这
两个菌株属于蒙氏肠球菌。
1
2
1 ：Tni-9 ；2 ：Se-9
图 1 产群体感应信号分子的菌株筛选结果
2.2 产群体感应信号分子菌株的鉴定
2.2.1 菌株的培养特征和形态特征 将菌株 Tni-9 和
Se-9 接种在 LB 平板上，30℃培养 48 h 观察其菌落
形态，Tni-9 和 Se-9 菌落近圆形，边缘啮蚀状，颜
色为乳白色，表面光滑无光泽不透明。将菌株 Tni-9
和 Se-9 进行革兰氏染色后在显微镜下观察其形态为
圆形或卵圆形，单个或成对排列且革兰氏染色为阳
性（图 2，图 3）。
2.2.2 菌株 Tni-9、Se-9 的 16S rDNA 基因鉴定 扩
增菌株 Tni-9、Se-9 的 16S rDNA 基因得到一条明亮
的特异条带，长约 1 500 bp（图 4）。获得了 Tni-9、
Se-9 菌株 16S rDNA 核酸序列（GenBank 登录号分
图 2 Tni-9 显微镜下镜检照片（100 ⅹ）
图 3 Se-9 显微镜下镜检照片（100 ⅹ）
2000
bp
M 1 2
1500
1000
750
500
250
100
M ：DM2000 ；1 ：Tni-9 ；2 ：Se-9
图 4 菌株 Tni-9、Se-9 16s rDNA-PCR 电泳图
2.2.3 菌株的生理生化特征鉴定 根据上述的分子
鉴定结果选取菌株 Se-9 进行菌株的生理生化检测，
结果如表 1 所示，菌株 Se-9 可发酵的碳水化合物种
类广泛，接触酶阴性，在 6.5% NaCl 中可以生长，V-P
反应阳性。参照《常见细菌系统鉴定手册》鉴定菌
株 Se-9 为蒙氏肠球菌。
2014年第7期 199黄媛媛等 ：粉纹夜蛾中肠微生物中产 AHLs 群体感应信号分子菌株的分离鉴定
表 1 Se-9 主要生理生化特性
生理生化鉴定指标 Se-9
运动性测定（3 d） -
PH5.7 液体培养基中生长状况观察 -
耐盐性试验（6.5% NaCl） +
接触酶试验 -
乳糖发酵 +
D-木糖发酵 +
山梨醇发酵 +
甘露醇 +
硝酸盐还原试验 -
H2S 产生试验 穿刺法 -
纸条法 -
V-P 试验 +
M-R 试验 +
吲哚试验 +
“+”表示阳性，“-”表示阴性
2.3 菌株Se-9产信号分子种类的确定
以 3OC6-HSL 和 C6-HSL 标准样品为对照进行
薄层层析，分析 Se-9 菌株产生信号分子的种类，由
图 6 可以看出两个菌株在 3OC6-HSL 和 C6-HSL 标准
样品所在的相应位置都出现了一个紫色斑点，说明
该菌株产生 3OC6-HSL 和 C6-HSL 两种信号分子。
3 讨论
昆虫肠道栖息着大量的微生物。随着近年来
研究肠道微生物的方法不断进步，尤其是基于 16S
rDNA 的分子生物学方法的应用，人们对肠道微生
物的了解逐渐加深。肠道微生物对昆虫寄主的作用
包括提供营养、利用拓殖抗性抵抗外来微生物侵袭、
参与多重营养关系、引起昆虫免疫反应等。粉纹夜
蛾是昆虫中肠防御体系研究最为深入的昆虫，但主
要集中在中肠围食膜蛋白结构和 Bt 杀虫蛋白受体方
面，对农业上重要害虫粉纹夜蛾中肠微生物群体感
应的研究尚未见系统报道。本研究从粉纹夜蛾中肠
中分离出 120 个菌株，再利用 luxI/luxR QS 系统的
微生物传感菌紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）
CV026 分离出两株可以产信号分子的菌株 Tni-9 和
Se-9。对这两个菌株进行了生理生化分析，通过 16S
rDNA 扩增得到一条大小为 1 500 bp 左右的条带。在
NCBI 基因库中进行比对，发现这两个菌株与蒙氏
肠 球 菌（Enterococcus mundtii ATCC 43186） 的 16S
rDNA 核酸序列同源性最高达到 99%。将测序结果用
BLAST 软件与 GenBank 中的相关属种的 16S rDNA
序列进行比对，以大肠杆菌为外群，用 Mega5.2 软
件构件系统发育树。100 次比对中 98 次都与蒙氏肠
球菌聚合到同一个分支，鉴定这两个菌株属于蒙氏
肠球菌。提取菌株 Se-9 所产生的信号分子，通过薄
层层析与微生物传感菌相结合的方法对菌株产生的
信号分子进行定性分析，结果显示 Se-9 可以产生两
种信号分子 C6-HSL 和 3OC6-HSL。该菌株的获得，
为下一步利用转座子标签技术构建群体感应缺失突
变体，并在缺少及富含该产信号分子菌株条件下测
定昆虫的杀虫活性奠定基础（本试验正在进行中）。
整个研究的目的是以粉纹夜蛾为研究对象，将细菌
群体感应系统和昆虫中肠防御体系联系起来，探索
群体感应系统对微生物杀虫活性影响，为农业生产
Enterococcus hirae strain CNM418 12
Enterococcus avium strain ATCC 14025
Enterococcus pseudoavium strain ATCC 49372
Enterococcus dispar strain ATCC 51266
Enterococcus columbae strain ATCC51263
Escherichia coli strain ATCC 25922
27
61
37
56
9898
91
89
70
0.05
Enterococcus saccharolyticus strain ATCC 43076
Enterococcus gilvus strain ATCC BAA-350
Se-9
Enterococcus mundtii strain ATCC 43186
Tni-9
Enterococcus hirae strain A-TSB-8
Enterococcus hirae ATCC 9790
Enterococcus hirae strain H1
图 5 Tni-9 和 Se-9 的系统发育进化树
1 2 3
1 ：3OC6-HSL 标样 ；2 ：Se-9 ；3 ：C6-HSL 标样
图 6 菌株产信号分子种类的薄层层析分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期200
中昆虫生物防治提供理论依据和新的思路。
4 结论
从粉纹夜蛾中肠中分离出 120 个菌株，采用群
体感应报告菌株 CV026 进行复筛，分离出两株可以
产信号分子的菌株 Tni-9 和 Se-9。对这两株菌进行
形态学分析、16S rDNA 鉴定及生理生化分析，鉴定
这两株菌为蒙氏肠球菌。提取 Se-9 的信号分子，通
过薄层层析分析显示 Se-9 可以产生两种信号分子
C6-HSL 和 3OC6-HSL。
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（责任编辑 李楠）