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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-03-12
基金项目 : 江苏省高校自然基金项目（KJD180004）, 江苏省科技创新与成果转化（重大科技支撑与自主创新）专项引导资金项目（BE2011644）,
江苏省企业博士集聚计划项目 , 徐州工程学院校级课题（XKY2009123）
作者简介 : 高兆建 , 男 , 研究方向 : 应用微生物学 ; E-mail: gaozhaojian@126.com
弹性蛋白酶（elastase）是一种以水解不溶性
弹性蛋白质为主的广谱蛋白水解酶，它主要从动物
胰脏中分离获得。微生物类群如细菌、放线菌、真
菌也都有分泌胞外弹性蛋白酶的报道［1］。弹性蛋
白酶在多个领域都有重要用途。在医药领域，主要
作为治疗高血脂症，防止动脉粥样硬化的生化药
物［2］；在食品工业，因其在不同种类蛋白质存在
的情况下，对不溶性的弹性蛋白具有较高的水解活
性，故在肉类加工中，弹性蛋白酶可以用于肉的嫩
化处理［3］；在日化工业中，弹性蛋白酶可以添加
到化妆品中，去除面部角质化的死皮，具有美化皮
肤的功效［4］。故该酶具有较好的应用前景和较高
的商业价值。我国该产品的生产是从猪胰脏中提
取，由于脏器资源不足和分离纯化的工艺繁琐，生
产成本较高，这大大限制了弹性蛋白酶的应用领
域。近年来，因微生物来源的弹性蛋白酶有产量
短芽孢杆菌低温弹性蛋白酶酶学特性分析
高兆建 巫有华 张桂英 李同祥 张莉
（徐州工程学院食品（生物）工程学院，徐州 221008）
摘 要： 旨在从短芽孢杆菌（Bacillus brevis）XZE116发酵液中分离纯化低温弹性蛋白酶，并对酶学性质进行研究。利用硫
酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和 Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析等方法进行纯化。结果显示，分离纯化到了
均一的酶蛋白，酶纯度提高了 37.21倍，回收率为 35.3%。SDS-PAGE及 Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析显示酶蛋白为单亚基
蛋白，分子量是 32.6 kD。最适作用温度 25℃。在 pH7.5-10.5范围内酶活性及稳定性较高，最适作用 pH9.0，Mg2+对酶有明显激活
作用。丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂强烈抑制酶活性，表明所纯化到的弹性蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶。酶对阴离子表面活性剂（0.1%
SDS）、阳离子表面活性剂（0.1% CTAB）和非离子型表面活性剂（1% Tween80）均具有很强的稳定性。鉴于短芽孢杆菌 XZE116
弹性蛋白酶具有以上优良酶特性，它在肉品嫩化领域具有潜在的应用价值。
关键词： 短芽孢杆菌 XZE116 低温弹性蛋白酶 分离纯化 酶学性质
Characterization of Cold-active Elastase from Bacillus brevis
Gao Zhaojian Wu Youhua Zhang Guiying Li Tongxiang Zhang Li
（Department of Food Engineering （Bioengineering），Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221008）
Abstract: It was to purify a cold-active elastase from Bacillus brevis XZE116 and to characterize the enzyme. We purified the elastase
from strain XZE116 using precipitation with ammonium sulfate，DEAE-Sepharose ion exchange chromatography and Sephadex G-75 gel
filtration chromatography and examined the characterization of the elastase. Results showed the elastase from strain XZE116 was purified to
homogeneity with a 37.21-fold increase in specific activity and 35.3% recovery. Elastase purified is composed of a single polypeptide chain
having an apparent molecular mass of 32.6 kD as determined by SDS-PAGE and gel filtration through Sephadex G-75 column. The enzyme
was highly active and stable in the pH range of 7.5-10.5，with an optimum at pH9.0. It exhibited maximal activity at 25℃. The elastase was
obviously activated by Mg2+. Its activity was strongly inhibited by serine-protease inhibitors，suggesting that the purified enzyme is a serine-
protease. The enzyme showed extreme stability towards anionic （0.1% SDS），cationic （0.1% CTAB） non-ionic surfactants （1% Tween80）.
Considering its promising properties，the elastase from Bacillus brevis XZE116 may find potential application in meat tenderization field.
Key words: Bacillus brevis XZE116 Cold-active elastase Purification Characterization
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期150
高、稳定性好、分离纯化工艺简单、不受原料限制
等优势，已越来越受到人们的关注。近年来已经从
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［4］、地衣芽孢杆菌
（Bacillus licheniformis）［5］、藤黄微球菌（Micrococcus
luteus）［6］、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aerugino-
sa）［7］、嗜碱芽孢杆菌（alkalophilic Bacillus）［8］等微
生物中分离到弹性蛋白酶。这些酶能否在食品加工
及其他行业中使用还受到诸多因素的限制，如环境、
pH 值、温度、氧化剂以及金属离子等对蛋白酶活性
及稳定性的影响。
本实验室分离到一株产生弹性蛋白酶活性较高
的短小芽孢杆菌（Bacillus brevis）XZE116，初步研
究发现该菌株所产弹性蛋白酶低温下酶活性较高。
本研究通过对该酶的分离纯化和酶学性质进行分析，
旨在为对其深入研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂和仪器 Sephadex G-75、DEAE-Sep-
harose购自瑞典Amersham pharmacia公司；弹性蛋白、
刚果红 -弹性蛋白从 Sigma 公司购买；其他试剂均为
国产或进口分析纯。蛋白纯化系统为 AKTA Explorer
型美国安玛西亚公司产品 ；蛋白电泳槽 DYCP-31BN
型北京六一仪器厂 ；台式冷冻离心机 SIGMA3K30 型
德国 Sigma 公司。
1.1.2 菌种和培养基
1.1.2.1 菌种 弹性蛋白酶菌株本实验室分离筛选
得到。鉴定并命名为短芽孢杆菌（Bacillus brevis）菌
株 XZE116。
1.1.2.2 培养基和培养条件 种子培养基（g/L）：蛋
白胨 5，葡萄糖 10，酵母膏 5，KH2PO4 2，MgSO4·
7H2O 0.1，pH7.0，121℃蒸汽灭菌 15 min。
摇瓶发酵培养基（g/L）：干酪素 10，蛋白胨 5，
酵母膏 5，葡萄糖 5，K2HPO4 1，KH2PO4 0.5，MgSO4·
7H2O 0.1，pH7.0，121℃灭菌 15 min。
种子液培养温度 30℃，摇床转速 180 r/min，培
养 18 h 后将培养好的菌液按 6% 的接种量接种于装
有发酵培养基中，摇瓶容量 500 mL，装量 100 mL，
培养温度 26℃，摇床转速 180 r/min，培养时间 36 h。
发酵结束后。发酵培养物在 4℃下 6 000 r/min 离心
20 min，去除细胞，上清液做进一步分离纯化。
1.2 方法
1.2.1 酶的分离纯化 发酵上清液中加入硫酸铵至
0-90% 饱和度，4℃静置过夜，6 000 r/min 冷冻离
心 30 min，沉淀用少量缓冲液溶解，透析除盐。测
定不同区间透析液的酶活力和蛋白质含量，确定盐
析适宜的硫酸铵饱和度。透析后粗酶液上样 DEAE-
Sepharose fast flow（2.5 cm×30 cm）阴离子交换柱，
用 0-1.0 mol/L NaCl 溶液进行线性洗脱，洗脱速度为
0.5 mL/min，每管收集 4 mL。测定收集管中溶液的
酶活力。有活性部分合并，装入透析袋，聚乙二醇
20000 包埋浓缩，浓缩后的样品上样 Sephadex G-75
（1.6 cm×90 cm）分子筛凝胶柱。洗脱液经紫外检测
并分部收集（3 mL/管），将有活性的部分合并，用
于检测酶纯度及用于酶学性质的研究。
1.2.2 酶活性检测 参照 Sachar［9］的方法进行酶活
测定。称取 10 mg 刚果红-弹性蛋白，加入 pH8.0，0.2
mol/L 的硼酸缓冲液，取 1 mL 适当稀释的酶液，于
25℃振荡反应 1 h，加入 pH6.0，0.2 mol/L 磷酸缓冲
液 2 mL 终止反应，12 000 r/min 离心 5 min，测定上
清液在 590 nm 处的吸光度。以不加酶液反应系统为
空白对照，该条件下，水解 1 mg 刚果红- 弹性蛋白
所需的酶量定义为一个弹性蛋白酶活单位。
1.2.3 蛋白浓度测定 采用 Lowry 法测定蛋白浓
度［10］，以牛血清白蛋白制作蛋白浓度标准曲线。
1.2.4 分子量测定
1.2.4.1 凝胶过滤 蓝色葡聚糖上样 Sephadex G-75
色谱柱，测定柱空隙体积（Vo），然后上样标准蛋白
及样品蛋白，测定各蛋白的洗脱体积（Ve），以各标
准蛋白的洗脱体积同柱空隙体积的比率（Ve/Vo）与
标准蛋白的分子量对数（log MW）制作标准曲线。
从标准曲线中求出该弹性蛋白酶的表观分子量。标
准蛋白为兔磷酸化酶 B、牛血清白蛋白、兔肌动蛋白、
胰蛋白酶抑制剂和鸡蛋清溶菌酶。
1.2.4.2 SDS-PAGE SDS-PAGE 参照 Laemmli 等［11］
的方法进行，分离胶浓度 12%，浓缩胶浓度 5%。将
样品及标准蛋白〔兔磷酸化酶 B （97.4 kD）、牛血清
白蛋白（66.2 kD）、兔肌动蛋白（43 kD）、牛碳酸酐
酶（31 kD）、胰蛋白酶抑制剂（20.1 kD）、鸡蛋清溶
2012年第9期 151高兆建等 ：短芽孢杆菌低温弹性蛋白酶酶学特性分析
菌酶（14.4 kD）〕上样凝胶，以相对迁移率对分子
量作图，从图中求出该弹性蛋白酶的分子量。
1.2.5 弹性蛋白酶性质研究
1.2.5.1 温度和 pH 值的影响 最适温度的测定在
0.02 mol/L 的硼酸缓冲液中，不同温度（10-55℃）
下进行酶促反应。热稳定性测定是将酶在不同温度
（40-80℃）下保温 120 min，每隔 30 min 测定酶活，
冰水中冷却，按照标准方法测定残余酶活。以未经
过热处理的酶液作为空白对照（100%）。
纯化后的弹性蛋白酶在不同 pH（6.0-12.0）下
进行酶促反应以测定其最适 pH。pH 稳定性测定是
将酶液加入到 20 mmol/L 的不同 pH 值缓冲液中，于
30℃保温 1 h，按照标准方法测定酶活性。所用缓冲
液 ：pH6.0-7.5 的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，
pH8.0-8.5 的 Tris-HCl 缓冲液，pH9.0-10.5 的甘氨酸-
氢氧化钠缓冲液，pH11.0-12.0 的磷酸氢二钠-氢氧
化钠缓冲液。
1.2.5.2 金属离子、抑制剂和表面活性剂的影响 取
适当稀释的酶液，向其中分别加入用蒸馏水配制
的金属盐溶液，使金属离子终浓度达到 5 mmol/L，
30℃保温 1 h 后，标准方法测定残余酶活。
将各种不同的酶抑制剂与酶液混合，在 30℃孵
育 1 h 后，标准方法测定残余酶活。
测定表面活性剂对酶稳定性的影响，纯化后的
酶液同表面活性剂 30℃孵育 1 h，标准方法测定残
余酶活。以上均以不加金属离子、表面活性剂及抑
制剂的酶液作为空白对照（100%）。
2 结果
2.1 弹性蛋白酶的分离纯化
弹性蛋白酶在硫酸铵饱和度大于 35% 时开始析
出，并且在较广的硫酸铵饱和度范围内存在，故收
集 35%-80% 饱和区间内的蛋白沉淀进行透析。充
分透析后，很大部分色素及杂蛋白从粗酶液中去除，
接着样品上样 DEAE-Sepharose FF 阴离子交换柱，
洗脱曲线如图 1 所示。样品中大部分杂蛋白及残余
色素完全同酶蛋白分开。在 NaCl 浓度约为 0.7 mol/L
时，酶蛋白洗脱出。合并有酶活性的收集管，聚乙
二醇 20000 包埋法浓缩，继续上样 Sephadex G-75 分
子筛凝胶柱。检测到一个蛋白峰含有较强酶活性（图
2）。经过以上纯化步骤，酶比活力达到1 607.84 U/mg，
纯化了 35.3 倍，回收率 37.21%（表 1）。
经过以上各步分离纯化的酶液 SDS-PAGE 检测，
考马斯亮蓝 R-250 染色，脱色后显现单一条带，说
明该酶已经达到电泳纯，结果（图 3）显示，对比
分子量标准蛋白的相对迁移距离，计算得到样品蛋
白质的分子量约为 32.6 kD，与通过 Sephadex G-75
表 1 短芽孢杆菌 XZE116弹性蛋白酶的分离纯化
纯化步骤 总活力 （U） 总蛋白 （mg） 比活力 （U/mg） 产率 （%） 纯化倍数 （n-fold）
Culture supernatant 24 356 563.67 43.21 100.00 1.00
Ammonium sulfate Precipitation 20 589 202.75 101.55 84.53 2.35
DEAE- Sepharose 14 090 21.37 659.38 57.85 15.26
Sephadex G-75 8 598 5.35 1 607.84 35.30 37.21
图 2 Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析图 1 DEAE-Sepharose FF离子交换层析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期152
色谱柱测得的分子量相一致。由此推断，纯化到的
弹性蛋白酶是单亚基蛋白。
pH7.0-11.0 之间酶活性仍能保持 85% 以上，在
pH6.0 和 pH12.0 活性还有接近 60%，表明弹性蛋白
酶酸碱耐受性很强，特别是在碱性环境下酶较稳定。
图 3 短芽孢杆菌 XZE116弹性蛋白酶 SDS-PAGE图谱
M. 低分子量标准蛋白质；1. 分子筛凝胶过滤层析；
2. 离子交换层析 ；3. 硫酸铵盐析
2.2 弹性蛋白酶的酶学性质
2.2.1 最适作用温度及热稳定性 酶在不同温度下
的测定结果如图 4 所示。在温度 10-25℃之间，酶
活性随温度上升大幅增加 ；但当温度高于 25℃时，
酶活性逐渐降低 ；当温度高于 55℃时，酶活性极
低，相对酶活仅有 20% 左右。故酶最适作用温度
为 25℃。
图 5 温度对短芽孢杆菌 XZE116弹性蛋白酶稳定性的影响
图 4 温度对短芽孢杆菌 XZE116弹性蛋白酶活性的影响
图 6 pH对短芽孢杆菌 XZE116弹性蛋白酶活性及
稳定性的影响
2.2.3 金属离子、表面活性剂及抑制剂对酶活性的
影响 纯化后的酶液中分别加入金属离子、表面活
性剂及酶特异性抑制剂，孵育 1 h 后标准方法测定
酶活。结果（表 2）显示，在 5 mmol/L 的浓度下，
Hg2+、Pb2+ 对酶有强烈抑制作用，Ca2+、Zn2+、Fe2+、
Na+ 和 K+ 对酶活性无显著作用，Mn2+、Cu2+ 能轻微
地抑制酶活性 ；但 Mg2+ 对酶有显著的激活作用，初
步推测 Mg2+ 在酶的催化中心结构方面具有一定的
功能。表面活性剂不同程度地抑制酶活性，其中
Trition X-100 抑制作用最强，经过处理后，相对酶活
降至 65%，Tween-80 对酶活性无显著影响。金属螯
合剂 EDTA 对酶有轻微的抑制作用。丝氨酸蛋白酶
特异性抑制剂 PSFM 几乎完全抑制酶活性，表面菌
株 XZE116 弹性蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶。E-64 对
酶活性几乎没有影响，故该酶不属于半胱氨酸型蛋
白酶。
3 讨论
菌株 XZE116 弹性蛋白酶分子量与报道的弹
酶的热稳定性结果如图 5 所示，弹性蛋白酶在
50℃以下比较稳定，经过 90 min 的孵育后，残余酶
活性都在 85% 以上。
2.2.2 酶的最适作用 pH 及稳定性 在不同 pH 的缓
冲体系中，25℃下测定酶活性，在 pH9.0 之前，酶
活性快速增加，而在 pH9.0 之后，酶活性逐渐降低，
故酶的最适作用 pH9.0（图 6）。
弹性蛋白酶 pH 值稳定性结果如图 6 所示，在
2012年第9期 153高兆建等 ：短芽孢杆菌低温弹性蛋白酶酶学特性分析
性蛋白酶相比较，同源于滕黄微球菌（Micrococcus
luteus）（32.812 kD）［6］、铜绿假单胞菌（Pseudomonas
aeruginosa）（33 kD）［7］、枯草芽孢杆菌（Bacillus
subtilis）（31 kD）［12］弹性蛋白酶分子量相接近，比
来源于地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）（29
kD）［13］、嗜碱芽孢杆菌（alkalophilic Bacillus）（23.7-25
kD）［8］、绵羊胰腺（25 kD）［14］弹性蛋白酶分子量要大，
但小于来自嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）（38
kD）［15］的弹性蛋白酶分子量。
本研究中弹性蛋白酶最适作用温度比所报道的
大部分弹性蛋白酶最适温度都要低，如滕黄微球菌
（Micrococcus luteus）（57-59℃）［6］、嗜碱芽孢杆菌
（alkalophilic Bacillus Ya-B）（60℃）［16］、地衣芽孢杆
菌（Bacillus licheniformis）（55℃）［13］，铜绿假单胞
菌（Pseudomonase aeruginosa）（50℃）［17］等，但同
所报道的基因重组弹性蛋白酶温度（28℃）比较接
近［18］。较低的温度下酶保持高活性，在弹性蛋白酶
的应用中具有重要意义。弹性蛋白酶在肉类嫩化中
具有重要应用。嫩化的工艺条件，特别是嫩化温度，
对肉的品质影响较大。所报道的弹性蛋白酶最适作
用温度一般都在 30℃以上，在该温度下做肉嫩化处
理，很容易滋生腐败微生物，引起肉的腐败变质。
故常规的弹性蛋白酶，肉类嫩化应用中受到限制。
弹性蛋白酶热稳定性研究发现，在 50℃以下
比较稳定，高于该温度，酶活性急剧降低，表明酶
热稳定性较差。同所报道的其他微生物如嗜水气
单胞菌（Aeromonas hydrophila）［19］、枯草芽孢杆菌
（Bacillus subtilis）［12］等弹性蛋白酶比较，短芽孢杆
菌 XZE116 弹性蛋白酶对高温敏感，短时间即可引
起酶的失活，但低温下稳定性较好。综合考虑酶的
最适作用温度和热稳定性，该酶适合在低温环境下
应用。
酶最适作用 pH9.0，比嗜碱芽孢杆菌（alkalophi-
lic Bacillus Ya-B）最适作用 pH11.75［8］要低，但比
来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［12］、毕赤酵母
重组菌［20］、 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）［5］
的弹性蛋白酶最适作用 pH 要高。
目前，虽然有几种来源于微生物的弹性蛋白酶
被分离纯化，但来源于短芽孢杆菌的弹性蛋白酶还
未见报道。
4 结论
本课题组采用硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepha-
rose 阴离子交换层析和 Sephadex G-75 分子筛凝胶过
滤层析的纯化方法，结合弹性蛋白酶的活性凝胶电
泳检测，纯化到了电泳纯的酶蛋白。从短芽孢杆菌
XZE116 中分离并纯化了胞外弹性蛋白酶，该酶也与
其他的弹性蛋白酶相似，分子量 32.6 kD。但与其他
报道显著不同的是，本课题组分离的弹性蛋白酶最
适反应温度仅为 25℃，远远低于所报道的温度范围。
酶学性质研究表明，短芽孢杆菌 XZE116 弹性蛋白
酶不仅在较低的温度下具有高活性，而且较广的碱
性条件下维持高活性并十分稳定，而且高浓度的表
面活性剂都对酶活性无较大影响。在 pH7.5-10.0 之
间孵育 1 h，测得酶活高于 85%。相对来说，它是一
种低温下活性较高的弹性蛋白酶。这些优良特性使
该酶在食品领域有着潜在应用价值。
参 考 文 献
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表 2 抑制剂及金属离子对弹性蛋白酶活性的影响
试剂 浓度 相对酶活（%）
None - 100±3.1
Na+ 5.0 mmol/L 102±1.5
K+ 5.0 mmol/L 100±2.6
Mg2+ 5.0 mmol/L 128±6.4
Ca2+ 5.0 mmol/L 94±2.4
Mn2+ 5.0 mmol/L 78±3.8
Fe2+ 5.0 mmol/L 91±2.9
Cu2+ 5.0 mmol/L 80±3.6
Zn2+ 5.0 mmol/L 91±4.8
Hg2+ 5.0 mmol/L 34±1.6
Pb2+ 5.0 mmol/L 27±4.4
SDS 0.1% 79.2±3.1
CTAB 0.1% 80.9±2.9
Tween-80 1% 91±3.1
Trition X-100 1% 65±2.3
EDTA 5.0 mmol/L 83.4±2.7
PSFM 4.0 mmol/L 9.2±0.8
E-64 0.2 mmol/L 99±4.2
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期154
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（责任编辑 马鑫）