全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):149-156
卵黄原蛋白（Vitellogenin，Vg）是一种特异存
在于非哺乳类性成熟卵生雌性动物血液中的磷糖脂
蛋白质，是几乎所有卵生动物卵黄磷蛋白的前体［1］。
Vg 是 Telfer 和 Williams［2］于 1953 年用免疫化学方
法在惜古比天蚕蛾（Hyalophora cecropia）的血液中
首先发现，当时称为雌性特异血蛋白。Pan 等［3］将
此雌性血蛋白特称 Vg，后来把这种在卵生动物的卵
黄形成过程中，雌性个体血浆中大量存在的含糖、
磷、脂的大分子蛋白定义为卵黄原蛋白。卵黄原蛋
白是卵黄发生的关键性物质，是一种重要的生殖蛋
收稿日期 ：2015-01-23
基金项目 ：“973”项目（2013CB127600）和 “948”项目（2011-G4）
作者简介 ：梁慧芳，女，硕士研究生，研究方向 ：天敌昆虫分子生物学及人工饲料的研究 ；E-mail ：kaoyanlhf@126.com
通讯作者 ：曾凡荣，男，博士，研究员，研究方向 ：天敌昆虫分子生物学及人工饲料的研究 ；E-mail ：zengfr@caas.net.cn
大眼长蝽卵黄原蛋白基因克隆、序列分析及表达研究
梁慧芳  曾凡荣  毛建军
（中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193）
摘 要 ： 旨在为研究大眼长蝽（Geocoris pallidipennis）卵黄原蛋白（Vitellogenin，Vg）分子特性及其基因生理功能。利用
RT-PCR、RACE 及 ELISA 方法对大眼长蝽 Vg 基因进行克隆、序列分析和表达研究。该基因 cDNA 全长 5 667 bp（GenBank 登录号：
KP688587），编码 1 848 个氨基酸残基，N-末端的前 19 个氨基酸为信号肽。氨基酸序列中有两个保守的多聚丝氨酸区域和 RXXR
酶切位点，接近 C-末端有 GLAG 基序，其后有 5 个保守的半胱氨酸残基，DGYR 基序位于 GLAG 上游 18 个氨基酸残基处。该基因
编码氨基酸序列与其它半翅目昆虫 Vg 氨基酸序列相似度较高，氨基酸序列分析显示它有 Vg 的典型特征，表明克隆的 cDNA 序列
是大眼长蝽的 Vg 基因序列。ELISA 检测发现随着发育时间的延长，卵黄原蛋白表达量逐渐增加，羽化后 22 d 达到高峰，随后开
始下降，结果表明大眼长蝽雌虫卵黄原蛋白的表达量与大眼长蝽产卵量紧密相关。
关键词 ： 大眼长蝽 ；卵黄原蛋白 ；Vg 基因 ；序列分析 ；Vg 表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.024
Gene Cloning，Sequence Analysis and Expression Studies of
Vitellogenin Gene in Geocoris pallidipennis
Liang Huifang Zeng Fanrong Mao Jianjun
（Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）
Abstract:  It was to study Vitellogenin（Vg）and the function of Vg gene in G. pallidipennis. In this study, the gene cloning, sequence
analysis and expression studies of Vg gene of G. pallidipennis were carried out by RT-PCR, RACE and ELISA. The full-length cDNA of the Vg
gene was 5 667 bp（GenBank accession number ：KP688587）, encoding 1848 amino acids residues, and there was a signal peptide of 19
amino acids in N-terminal. There were 2 conserved polyserine regions and 1 RXXR cleavage site in amino acid sequences. Close to the C-terminus
there was a GLAG motif followed by 5 conserved cysteine residues, and a DGYR motif was located in the 18th residue of the GLAG upstream.
The deduced amino acid sequence of the Vg gene showed a high similarity with the Vg sequences from other hemipterainsects. Typical features
of Vg were found through sequence analysis. The results indicated that the cDNA obtained was Vg gene from G. pallidipennis. The Vg detected
by ELISA showed it increased gradually and reached the peak on the 22th day after adult emergence, then decreased. The results also indicated
that the egg production was closely correlated to Vg expression.
Key words:  Geocoris pallidipennis ；vitellogenin ；gene cloning of Vg ；sequence analysis ；expression of Vg
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10150
白，在卵生动物的生殖、发育等生命过程起重要作
用。该蛋白是一类大分子量的糖脂复合蛋白，含有
1%-14% 的糖类，6%-16% 的脂类和大约 84% 的氨
基酸［4］。在大多数昆虫中，卵黄原蛋白在脂肪体中
合成，通过受体介导的胞吞作用被发育中的卵母细
胞所摄取，为正在发育的胚胎提供氨基酸、碳水化
合物、维生素、脂肪等营养和功能性物质，是胚胎
发育的重要物质基础［5］，能影响昆虫产卵的数量和
质量。Vg 作为存储蛋白，一直被认为只有营养存储
的功能，但是近年来，科学家也发现 Vg 不仅参与卵
母细胞成熟和给胚胎发育提供营养物质外，还有一
些其它重要生理功能［6］，例如意蜂中 Vg 参与免疫
防御、锌离子转运、寿命调控等多种生物学功能和
复杂的新陈代谢过程［7，8］，同时卵黄原蛋白也是检
测环境激素的生物指标［9］。
天敌昆虫在生物防治中的应用受到越来越多的
关注，生物防治既可以降低农药对环境造成的污染，
保护生态坏境，又可以提供安全的农产品，避免高
毒农药对人体健康可能产生的某些不良影响。但是
由于天敌昆虫繁殖基础等方面的研究薄弱，天敌昆
虫在害虫生物防治中的应用受到了限制。卵黄原蛋
白对昆虫生殖繁育至关重要，因此卵黄原蛋白研究
对天敌昆虫的繁育以及促进害虫生物防治的应用意
义重大。
鉴于昆虫卵黄原蛋白的重要性，该蛋白研究成
为昆虫生物学和生物化学的研究热点［10-13］，自 20
世纪 60 年代以来，对昆虫 Vg 的研究持续深入，目
前已有 7 个目 50 多种昆虫的 Vg 基因序列被克隆，
研究主要集中在鳞翅目、双翅目、膜翅目和半翅
目［14］。大眼长蝽（Geocoris pallidipennis）隶属半翅
目长蝽科，是一种重要的捕食性天敌昆虫，主要捕
食蚜虫、螨类、蓟马、鳞翅目的卵和初孵幼虫，是
很多农业害虫的重要天敌［15］，在害虫生物防治中具
有广阔的应用前景。但是国内外对大眼长蝽的研究
主要集中在食物、温度、光周期对其发育的影响［16，
17］，生物学特性，捕食功能［18，19］等领域，对其繁
殖关键因子——卵黄原蛋白的分子生物学基础研究
未见报道。本研究首先利用 RT-PCR 方法，对大眼
长蝽的 Vg 基因进行克隆并测序，在获取 cDNA 片
段基础上，采用 RACE 技术得到 Vg 基因的全长序
列，并利用生物信息学方法对 Vg 的氨基酸序列组成
成分、理化性质、信号肽、结构域等方面进行分析，
揭示其分子特性，旨在为 Vg 基因的功能及其在昆虫
生殖中的作用机理研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 昆虫材料 实验所用大眼长蝽采自北京市小
月河，在实验室用人工饲料饲养多代。饲养条件为：
温度（25±1）℃，相对湿度（RH）为（70±5）%，
光周期 L∶D=16 h∶8 h，人工饲料［20］为本实验室
研制，分装到石蜡膜制成的袋子中，-20℃保存备用。
1.1.2 菌种、质粒与试剂 大肠杆菌 DH5α 购自北
京江晨生物公司 ；克隆载体 pMD19-T、DNA 分子量
Marker 购自 TaKaRa 公司 ；琼脂糖凝胶 DNA 回收试
剂盒购自天根公司；反转录试剂盒、Taq 聚合酶（HiFi）
购 自 TransGen Biotech 公 司 ；SMARTTM RACE cDNA
Amplification Kit 购自 Clontech 公司。其他试剂均为
分析纯。
1.2 方法
1.2.1 虫 体 总 RNA 的 提 取 和 cDNA 第 一 链 的 合
成 取羽化后 7 d 的大眼长蝽雌虫放入液氮预冷
的 1.5 mL 离心管中，充分研磨虫体直至研磨成粉
末状，加入 1 mL 的 Trizol 试剂，按照试剂说明书
提取总 RNA。提取样品的完整性用 1% 的琼脂糖凝
胶电泳检测。以反转录（TransScript One-Step gDNA
Removal and cDNA Synthesis SuperMix）试剂盒合成
cDNA 第一链 ；利用 3 和 5RACE（SMARTTM RACE
cDNA Amplification Kit） 试 剂 盒 合 成 3 和 5RACE
cDNA 第一链。
1.2.2 引物设计 本实验设计的引物根据 NCBI（美
国国家生物技术信息中心）数据库中点蜂缘椿象
（Riptortus clavatus，U97277）、赤须盲蝽（Trigonotylus
caelestialium，AB600673）、大田鳖（Lethocerus deyr-
ollei，AB425334）、褐飞虱（Nilaparvata lugens，AB-
353856）、琉璃叶蝉（Homalodisca coagulata，DQ11-
8408）、斯氏珀蝽（Plautia stali，AB033500）、斯氏
珀蝽（Plautia stali，AB033499）、斯氏珀蝽（Plautia
stali，AB033498）、油蝉（Graptopsaltria nigrofuscata，
AB026848）共 9 个物种的卵黄原蛋白基因保守序列
2015,31(10) 151梁慧芳等 ：大眼长蝽卵黄原蛋白基因克隆、序列分析及表达研究
设计简并引物，根据简并引物扩增结果设计特异性
引物，引物序列见表 1。所用引物由北京生物工程
有限公司合成。
1.2.3 大眼长蝽卵黄原蛋白基因的克隆
1.2.3.1 卵 黄 原 蛋 白 基 因 cDNA 片 段 的 扩 增 以
cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反应体系 ：10×Buff-
erII（Mg2+）5 μL，GpVg1/GpVg2 正 反 向 引 物（10
μmol/L） 各 1 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，Taq-
polymerase（HiFi）2.5 U，cDNA 模板 2 μL，加 ddH2O
至 50 μL。PCR 反应条件为 ：94℃ 3 min ；94℃ 30 s，
53.8℃/44.3℃ 30 s，72℃ 1 min，35 个循环 ；72℃ 10
min。扩增产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。根据
获得的 Vg 基因序列设计的 GpVg3-GpVg9 一系列引
物，利用 PCR 扩增将两目的片段之间的序列克隆并
测序。
1.2.3.2 卵黄原蛋白基因 cDNA3 末端快速扩增 以
3RACE cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反应体系 ：
3RACE cDNA 2.5 μL，GpVg-F 1 μL，UPM 5 μL，
10×Advantage 2 PCR Buffer（Clontech）5 μL，dNTP
Mix 1 μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix（Clontech）
1 μL，加 ddH2O 至 50 μL。PCR 反应条件为 ：94℃ 3
min ；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 2 min，35 个循环 ；
72℃ 10 min。扩增产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3.3 卵黄原蛋白基因 cDNA 5 末端快速扩增 以
5 RACE cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反应体系 ：
5 RACE cDNA 2.5 μL，GpVg-R 1 μL，UPM 5 μL，
10×Advantage 2 PCR Buffer（Clontech）5 μL，dNTP
Mix 1 μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix（Clontech）
1 μL， 加 ddH2O 至 50 μL。PCR 反 应 条 件 为 ：94℃
3 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，35 个循环；
72℃ 10 min。 扩 增 产 物 进 行 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳
检测。
1.2.3.4 PCR 扩增产物的克隆及测序 PCR 扩增产
物用 1% 琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外凝胶成像仪
下将目的条带切下，采用琼脂糖凝胶 DNA 回收试
剂盒回收纯化。回收产物与 pMD19-T 载体连接，连
接体系包括 ：PCR 产物 4 μL，pMD19-T 载体 1 μL，
solution I 5 μL，16℃连接过夜，转化大肠杆菌 DH5α
感受态细胞，涂布于含有 Amp 的 LB 培养平板上，
于 37℃恒温培养过夜。通过蓝白斑和菌落 PCR 筛选
阳性克隆，并送北京生物工程有限公司测序。
1.2.4 序列测定及大眼长蝽卵黄原蛋白系统进化分
析 利用美国国家生物技术信息中心的 Blast 工具
与 GenBank 数据库中的其它物种进行同源性序列比
对，确定目标产物的可靠性。蛋白质分子量和等电
点 采 用 ExPASy ：http ：//www.expasy.org/tools/pi_tool.
html 软件进行预测 ；信号肽序列预测采用 SignalP 4.0
Server［21］：http ：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ 软
件进行 ；功能结构域预测采用 NCBI 的 CCD ：http ：//
www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi软件进行；
序列比对使用 Clustal W 软件，系统发育树的构建采
用 MEGA 5 软件。
1.2.5 卵黄原蛋白在大眼长蝽中的表达分析
1.2.5.1 卵黄原蛋白样品的制备 参照龚和等［22］的
方法制备，收集大眼长蝽新鲜的卵，用蒸馏水清洗
干净，滤纸吸干后用 0.4 mol/L NaCl 溶液研磨粉碎，
表 1 大眼长蝽卵黄原蛋白基因克隆的引物序列
引物名 上游引物序列（5-3） 下游引物序列（5-3）
GpVg1 GCHCTNGGHAACATDGCTCA GCNGGAGGGTTGGTCTTCATCA
GpVg2 ACHTTCAACAACAGGTCNTA AGGTDCCACANAGACCNCG
GpVg3 TGCAGCTGATGAAGACCAAC CATGATAGCAGTTGCCGAGG
GpVg4 AGGCTGGAACTGGACCAGC AGCGATGATGGTAAGCCTCTGGAACTG
GpVg5 TGATGAAGACCAACCCTCCGGC ATNGTGTGGTTGTCNAAGG
GpVg6 TGCCAACAVCARATGSA GGGTATGACCTGTTGTTGAAGGT
GpVg7 ACTGACAGTCAATTGCAAGTCGAGG GCAGGTTGGATGTAGTTGGATTTCT
GpVg8 TTCGTCGCCATGACCTGATCTCTGC TGCTTCTGTTCGTTTCTCCATTCCA
GpVg9 TACACCATCCAATCNTCNGTCAC GTTGGGCAGCTTCTTCACCTTGGACTTT
GpVg-R CCTAGTGCCTTGTTTGTACTCAT
GpVg-F CGACTCCCAACACAAAGAAATC
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10152
4℃ 12 000 r/min 离心 30 min，取上清，重复此步骤
一次，收集上清，按 1∶10 的比例加入冷重蒸水，
使卵黄原蛋白沉淀。置于 4℃过夜，5 000 r/min 离心
20 min，弃上清，沉淀溶于 0.4 mol/L NaCl 中，低速
离心，取上清按照 1∶10 加入冷重蒸水使卵黄原蛋
白沉淀。用考马斯亮蓝法测定卵黄原蛋白的浓度。
1.2.5.2 ELISA 法制备标准曲线和测定卵黄原蛋白
在大眼长蝽中的表达量 ELISA 法制备标准曲线 将
测定浓度的卵黄原蛋白提取液用包被液按照 100、
250、500、1 000 和 2 000 倍 稀 释， 每 个 酶 标 孔 加
100 μL，4℃包被过夜，洗涤 3 次，加 300 μL 封闭液，
37℃温育 2 h，洗涤，加入 1∶8 000 稀释的一抗［23］
100 μL，37℃温育 2 h，洗涤，加入 1∶8 000 稀释的
酶标二抗 100 μL，37℃温育 1 h，洗涤，反应孔中加
入刚配制的 TMB（2 mg TMB 溶于 1 mL 乙醇中，配
制成 2 mg/mL TMB 溶液，取 0.05 mL TMB 溶液、0.95
mL 底物缓冲液和 0.001 mL 30% H2O2 配成 1 mL TMB
显色液）底物缓冲液 100 μL，37℃暗反应 15 min，
之后加入 50 μL 的 2 mol/L 硫酸终止反应，读取 450
nm 下各反应孔的 OD 值。
ELISA 法测定卵黄原蛋白在大眼长蝽中的表达
量 分别将羽化后 3、5、8、10、14、18、22、26 和
30 d 的大眼长蝽雌虫用匀浆缓冲液在冰上研磨粉碎
后，4℃，12 000 r/min 离心 30 min，取上清，再次离
心，取上清即为待测样品。按照上述标准曲线制备
的步骤测定大眼长蝽羽化后不同时间段卵黄原蛋白
的表达量。
2 结果
2.1 大眼长蝽卵黄原蛋白基因cDNA全长克隆
PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在约
250 bp 和 500 bp 处分别有一明亮的条带（图 1-A），
PCR 产物经连接转化后测序，结果得到大小为 248
bp 和 445 bp 的 cDNA 片段，经 Blastx 分析，两目的
片段与点蜂缘椿象（Riptortus clavatus）的相似性分
别达到 76% 和 54%，表明克隆的 cDNA 片段是大眼
长蝽卵黄原蛋白基因的部分序列。根据已经获得的
卵黄原蛋白基因序列设计一系列引物，扩增获得两
目的片段之间的 cDNA 序列（图 1-B）。
在扩增得到大眼长蝽卵黄原蛋白基因 cDNA 序
列的基础上，采用 RACE 技术分别获得卵黄原蛋白
基因的 3 端序列 1 049 bp 和 5 端序列 828 bp（图
M 1 M 2 MA
M 1 M 2 M 3 M 4 M 5 M 6 M 7B
C 1 M 2
M ：DNA Marker DL2000 ；A ：1 ：简并引物 GpVg1 扩增产物 ；2 ：简并引物 GpVg2 扩增产物 ；B ：1-7 ：分别代表
引物 GpVg3-GpVg9 扩增产物 ；C ：1 ：3 RACE PCR 扩增产物 ；2 ：5 RACE PCR 扩增产物
图 1 PCR 扩增产物
2015,31(10) 153梁慧芳等 ：大眼长蝽卵黄原蛋白基因克隆、序列分析及表达研究
1-C）。利用 DNAman 软件进行序列拼接，获得大眼
长蝽卵黄原蛋白基因 5 667 bp 全长序列。卵黄原蛋
白 cDNA 序列的 5 起始密码子 ATG 前有一段长 30
bp 的非编码区，3 末端有 Poly A 多聚核苷酸的尾巴
和 90 bp 的 3 非翻译区，表明该 cDNA 序列的完整性。
2.2 大眼长蝽卵黄原蛋白cDNA序列分析
利用 DNAman 软件对卵黄原蛋白基因序列进
行分析，其开放读码框（ORF）为 5 547 bp，编码
1 848 个氨基酸残基（图 2）。根据在线软件 SignalP
4.0 分析其氨基酸信号肽序列，得到大眼长蝽卵黄原
蛋白的 N-端从起始密码子开始前 19 个氨基酸为信
号肽，最可能信号肽切割位点在第 18 位与 19 位氨
基酸之间。预测的分子质量为 210.56 kD，等电点为
7.02。通过同源性比对，大眼长蝽卵黄原蛋白氨基
酸序列与点蜂缘椿象的 Vg 序列相似度达 59%，与
斯氏珀蝽的相似度达 46%。用 Blast 分析该卵黄原
蛋白氨基酸序列，在 N-末端含有 Vitellogenin-N 结
构域，在 C-末端含有一个 Willerbrand factor type D
（VWD）结构域，这些结构域都是卵黄原蛋白所特
有的。分析该卵黄原蛋白的氨基酸序列可能在位点
RIRR（第 387-390 位氨基酸）处被切割成两个亚基，
在切割位点上下游分别有一个保守的多聚丝氨酸区
域。C-末端有 5 个保守的半胱氨酸残基，在其上游
有 GLAG 保守氨基酸基序，DGYR 基序位于 GLAG
基序上游第 18 个氨基酸残基处。
2.3 大眼长蝽卵黄原蛋白系统进化分析
在 GenBank 中搜索昆虫纲已克隆的 Vg 序列，
应用 MEGA5.0 软件采用邻接法对 27 个物种的卵黄
原蛋白进行系统进化分析，以 1 000 次回抽的置信
度作置信分析，结果（图 2）显示，27 个物种的卵
黄原蛋白分为 I、II 两组，分别代表全变态昆虫、半
变态昆虫，第一组又分为 4 个亚组 Ia、Ib、Ic 和 Id，
分别代表双翅目、鳞翅目、鞘翅目和膜翅目 ；第二
组分为 2 个亚组 IIa、IIb，分别代表网翅目、半翅目。
98
75
77
89
100
100
100
100
100
100
100
100
100
77
100
100
100
100
92
79
61
61
83
95
Satumia_iaponica⁏㳅
Satumia_cynthia_pryeriⴹ㓩ཙ㳅㴮
Bombyx_moriᇦ㳅
Onaphalocrocis_medinalisに㓥ধਦ᭿
Lymantria_dispar㡎∂㴮
Oulex_tarsalis-2bીᯁᓃ㲺
Aedes_aegyptiෳ৺Ժ㲺
Taxorhynchites_amboinensisᆹ䛖ᐘ㲺
Anopheles_albimanus␑㢢᤹㲺 I
II
IIb
IIa
Id
Ic
Ib
Ia
Anopheles_stephensiᯟ∿᤹㲺
Tenebrio_mditor哴㊹㲛
Anthonomus_grandisỹ䫳䊑⭢
Bombus_ignitus㓒ݹ䳴㴲
Sdenopsis_invicta㓒⚛㲱
Pimpla_nipponicaᰕᵜⱔလ㴲
Pteromalus_puparum㶦㴩䠁ሿ㴲
Encarsia_formosaѭ㳌ሿ㴲
Blattella_germanicaᗧഭሿ㸺
Rhyparobia_maderae傜ᗧ᣹㵊㸺
Graptopsaltria_nigrofuscata⋩㵹
Riptortus_clavatus⛩㴲㕈Ὧ䊑
Geocoris_palliclipennisབྷ⵬䮯㶭
Plautia_stali_Vg-1ᯟ∿⧰㶭
Nilaparvata_lugens㽀伎㲡
Homaloclisca_vitripennis⨹⪳ਦ㵹
Trigonotylus_caelestialium䎔享ⴢ㶭
Lethocerus_deyrolleiབྷ⭠匆
图 2 不同物种间卵黄原蛋白的系统进化分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10154
大眼长蝽卵黄原蛋白基因属于亚组 IIb，与点蜂缘椿
象的亲缘关系最近。
2.4 ELISA法制备标准曲线和测定卵黄原蛋白在
大眼长蝽中的表达量
2.4.1 ELISA 方法制作的标准曲线 图 3 显示，卵
黄原蛋白浓度与 OD 值成线性关系（R2=0.950 3），
可以用于测定羽化后不同时间卵黄原蛋白表达量。
物化学研究领域的关注。但是目前在 GenBank 数据
库中公布的半翅目卵黄原蛋白基因序列，还未见大
眼长蝽卵黄原蛋白（Vg）基因报道。本研究克隆获
得了大眼长蝽卵黄原蛋白基因，该基因是半翅目昆
虫中的一种新基因，填补了半翅目长蝽科 Vg 分子特
性的信息，有助于揭示 Vg 基因在长蝽科昆虫代谢、
生殖及进化中的生理功能。
本研究利用 RT-PCR 及 RACE 技术，得到了大
眼长蝽卵黄原蛋白基因 cDNA 全序列，该序列全长
5 667 bp，包括 30 bp 的 5 非翻译区（UTR），编码
1 848 个氨基酸残基的开放阅读框，90 bp 的 3 非翻
译区（UTR）。预测卵黄原蛋白的分子质量为 210.56
kD，等电点为 7.02。氨基酸保守结构域分析该蛋白
在 488-822 氨基酸残基处有一个 Vitellogenin-N 结构
域，C-末端的 1 598-1 762 位氨基酸残基处有 VWD
结构域，这些结构域为卵黄原蛋白基因所特有的，
也与脂质转移活动密切相关［24］。
同时，大眼长蝽卵黄原蛋白基因序列分析表
明，从甲硫氨酸开始的前 19 个氨基酸为信号肽，而
一般昆虫卵黄原蛋白 N-末端的 15-18 个氨基酸为
信号肽［25］。本研究结果也揭示大眼长蝽 Vg 氨基
酸序列中有 RIRR 的酶切位点，将卵黄原蛋白切割
成大小两个亚基，该酶切位点识别的氨基酸序列在
昆虫中较为保守，一般为（R/K）X（R/K）R 或者
RXXR［26］。尹志亮等［27］研究柳蚕卵黄原蛋白也发
现该氨基酸残基在 RSRR 酶切位点处被切割成大小
两个亚基，但 Nose 等［28］研究寄生蜂卵黄原蛋白基
因得出其保守的 RXXR 位点突变为 LYRR，并且不
被切割。大眼长蝽卵黄原蛋白氨基酸序列 C-末端区
域存在保守的 GLAG 基序，该基序不同于大多数昆
虫的 GL/ICG［29，30］，而与点蜂缘椿象［31］的保守基
序完全一致。其他学者研究表明红光雄蜂［13］和大
草蛉［32］的 Vg 氨基酸序列在 GL/ICG 基序的下游有
9 个保守的半胱氨酸残基，天蚕、蓖麻蚕中 GL/ICG
基序下游的保守半胱氨酸残基数为 6，而家蚕中为 7，
而本研究结果显示大眼长蝽卵黄原蛋白氨基酸序列
在 GLAG 基序的下游只有 5 个保守的半胱氨酸残基，
可见不同物种保守的半胱氨酸残基数目有差异。此
外，大眼长蝽 DGYR 位于 GLAG 基序上游 18 个氨
基酸残基处，这与目前已知的大部分昆虫的 DGXR
0
0 0.005 0.01⎃ᓖmg·mL-1 0.015 0.020.51.5
2.5 y=98.458x+0.2592
R2=0.9503
2.0
O
D
45
0
nm
1.0
图 3 卵黄原蛋白标准曲线
2.4.2 卵黄原蛋白在大眼长蝽中的表达 羽化后不
同时间的大眼长蝽雌虫卵黄原蛋白如图 4 所示，卵
黄原蛋白表达在羽化后第 3 天就可以检测到，随着
发育时间的增加，卵黄原蛋白含量也随之增加，在
羽化后第 22 天达到最大值，然后开始下降。
6
3 5 8 10 14 18 22 26 30
9
12
15
18
䳼ᡀ㲛ਁ㛢ᰦ䰤dথ哴৏㳻ⲭਜ਼䟿μg
·m
L-
1 
图 4 大眼长蝽雌虫羽化后不同时期卵黄原蛋白的含量
3 讨论
现有研究表明，卵黄原蛋白是一种重要的营养
物质，在卵生雌性动物胚胎发育中起关键性作用，
是卵母细胞生长发育所需营养物质的主要来源。卵
黄原蛋白因其所具有的特性，备受昆虫生物学和生
2015,31(10) 155梁慧芳等 ：大眼长蝽卵黄原蛋白基因克隆、序列分析及表达研究
基序相同［33］。
Blast 比对和系统发育树的分析发现，大眼长
蝽卵黄原蛋白基因氨基酸序列与昆虫卵黄原蛋白有
较高的相似度，它与半翅目昆虫相似度达到 33%-
59%。 其 中 与 点 蜂 缘 椿 象（Riptortus clavatus）、 斯
氏 珀 蝽（Plautia stali）、 琉 璃 叶 蝉（Homalodisca
vitripennis）、褐飞虱（Nilaparvata lugens）等的相似
度分别为 ：59%、46%、37% 和 34%。大眼长蝽卵
黄原蛋白与点蜂缘椿象具有较高的相似度，与这两
种昆虫同属于半翅目有关。
用 ELISA 方法对大眼长蝽雌虫卵黄原蛋白的表
达分析显示，大眼长蝽雌虫中卵黄原蛋白含量在羽
化后第 3 天即可检测到，并随着发育时间的延长，
卵黄原蛋白含量逐渐升高，在羽化后第 22 天达到高
峰，而后逐渐下降。观察也发现大眼长蝽一般在羽
化后 7-10 d 开始产卵，可见，大眼长蝽雌虫并不是
在卵黄原蛋白合成的初期开始产卵，只有卵黄原蛋
白累积到一定程度才开始产卵，产卵量会随着卵黄
原蛋白含量的增加而增加，该结果表明大眼长蝽雌
虫卵黄原蛋白的表达量与大眼长蝽产卵量紧密相关。
昆虫的生殖力是衡量种群生存与繁殖的重要指
标［34］，卵黄原蛋白是昆虫繁殖的关键因子，尽管不
同昆虫卵黄原蛋白合成的调控方式有差异，而卵黄
原蛋白的合成与激素［35］及相关基因特别是 Vg 基因
紧密关联。本研究克隆得到的大眼长蝽卵黄原蛋白
基因，将有利于进一步研究基因对天敌昆虫大眼长
蝽卵黄原蛋白的合成调控及促进大眼长蝽大量繁殖
的关键技术。
4 结论
本研究成功克隆了大眼长蝽卵黄原蛋白基因，
该基因包含有高度保守的 Vg-N 和 VWD 结构域，同
时系统进化树分析结果表明大眼长蝽 Vg 与点蜂缘椿
象的 Vg 亲缘关系密切。本研究结果也揭示了大眼长
蝽雌虫卵黄原蛋白的表达量与大眼长蝽产卵量紧密
相关。
参 考 文 献
［1］ Utarabhand P, Bunlipatanon P. Plasma vitellogenin of grouper
（Epinephelus malabaricus）：isolation and properties［J］.
Comparative Biochemistry Physiology, 1996, 115（2）：101-110.
［2］ Telfer WH. Immunological studies of insect metamorphosis. Ⅱ . The
role of a sex-limited blood protein in egg formation by the Cecropia
silkworm［J］. Journal of General Physiology, 1954, 37（4）：539-
558.
［3］ Pan ML, Bell WJ, Telfer WH. Vitellogenic blood protein synthesis
by insect fat body［J］. Science, 1969, 165（3891）：393-394.
［4］ 董胜张 , 叶恭银 , 刘朝良 . 昆虫卵黄原蛋白分子进化的研究进
展［J］. 昆虫学报 , 2008, 11 ：1196-1209.
［5］ 张年国 , 张颖 , 孙大江 , 曲秋芝 . 卵黄蛋白原的发生、结构及
功能研究现状［J］. 水产学杂志 , 2007, 20（1）：97-106.
［6］ Piulachs MD, Guidugli KR, Barchuk AR, et al. The vitellogenin of
the honey bee, Apis mellifera ：structural analysis of the cDNA and
expression studies［J］. Insect Biochemistry and Molecular Biology,
2003, 33 ：459-465.
［7］ Amdam GV, Simões ZLP, Hagen A, et al. Hormonal control of the
yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity
in honeybees［J］. Experimental Gerontology, 2004, 39 ：767-773.
［8］ Gro VA, Kar i N , Arne H, e t a l . Soc ia l exp lo i ta t i on o f
vitellogenin［J］. Proceeding of the National Academy of Scienses
of the United States of America, 2003, 100 ：1799-1802.
［9］ 汝少国 , 潘宗保 , 田华 . 鱼类卵黄原蛋白研究进展［J］. 海洋
湖沼通报 , 2012（2）：22-32.
［10］ Hatakeyama M, Sawa M, Oishi K. Ovarian development and
vitellogenesis in the sawfly, Athalia rosae ruficornis Jakovlev
（Hymenoptera, Tenthredinidae）［J］. Invertebrate Reproduction
and Development, 1990, 17（3）：237-245.
［11］ Raikhel AS, Brown MR, Belles X. Hormonal control of reproductive
process［M］. Oxford ：Comprehensive Molecular Insect Science,
2005, 433-491.
［12］ Swevers L, Raikhel AS, Sappington TW, et al. Vitellogenesis and
post-vitellogenic maturation of the insect ovarian follicle［M］.
Oxford ：Comprehensive Molecular Insect Science, Elsevier Ltd.,
2005 ：87-155.
［13］ Shaul R, Shmuel P, Carmen S, et al. Complete sequence of
Litopenaeus vannamei（Crustacea ：Decapoda）vitellogenin
cDNA and its expression in endocrinologically induced sub-adult
females［J］. General and Comparative Endocrinology, 2006, 145
（1）：39-50.
［14］ 李继莲 , 吴杰 , 彩万志 , 彭文君 . 红光熊蜂卵黄原蛋白基因的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10156
cDNA 全长序列克隆和表达分析［J］. 应用昆虫学报 , 2012,
49（5）：1132-1139.
［15］ 彩万志 , 庞雄飞 , 花保祯 . 普通昆虫学［M］. 北京 ：中国农
业大学出版社 , 2001 ：413.
［16］ Decker KB, Yeargan KV. Seasonal phenology and natural enemies
of the squash bug（Hemiptera ：Coreidae）in Kentucky［J］.
Environmental Entomology, 2008, 37（3）：670-678.
［17］ Mansfield S, Scholz B, Armitage S, et al. Effects of diet, temperature
and photoperiod on development and survival of the big eyed bug,
Geocoris lubra［J］. Biology, 1951, 28（2）：173-180.
［18］ Tillman G, Lamb M, Mullinix JB. Pest insects and natural
enemies in transitional organic cotton in Georgia［J］. Journal of
Entomological Science, 2009, 44 ：11-23.
［19］ Torres JB, Silva-Torres CS, Ruberson JR. Effect of two prey
types on life-history characteristics and predation rate of Geocoris
floridanus（Heteroptera ：Geocoridae）［J］. Environmental
Entomology, 2004, 33 ：964-974.
［20］ Liu FJ, Zeng FR. The influence of nutritional history on the
functional response of Geocoris pallidipennis to its prey, Myzus
persicae［J］. Bulletin of Entomological Research, 2014, 7 ：1-5.
［21］ Petersen TN, Brunak S, Von Heijne G, et al. SignalP 4. 0 ：
discriminating signal peptides from transmembrance regions［J］.
Nature Methods, 2011, 8 ：785-786.
［22］ 龚和 , 翟启慧 , 魏定义 . 七星瓢虫的卵黄发生 ：卵黄原蛋白
的发生和取食代饲料的影响［J］. 昆虫学报 , 1980, 23 ：252-
259.
［23］ 刘丰姣 . 食物对大眼长蝽营养生理生化及行为影响的研
究［D］. 北京 ：中国农业科学院 , 2013.
［24］ Smolenaars MMW, Madsen O, Rodenburg KW, et al. Molecular
diversity and evolution of the large lipid transfer protein
superfamily［J］. The Journal of Lipid Research, 2007, 48（3）：
489-502.
［25］ 刘朝良 , 董胜张 , 王磊 , 等 . 昆虫卵黄原蛋白（Vg）分子生物
学研究进展［C］. 食品安全的理论与实践——安徽食品安全
博士科技论坛论文集 , 2005.
［26］ Matthews DJ, Goodman LJ, Gorman CM, et al. A survey of furin
substrate specificity using substrate phage display［J］. Protein
Science, 1994, 3 ：1197-1205.
［27］ 尹志亮 , 刘朝良 , 邵引刚 , 李锋 . 柳蚕卵黄原蛋白 cDNA 的克
隆及序列分析［J］. 激光生物学报 , 2007, 16（5）：552-558.
［28］ Nose Y, Lee JM, Ueno T, et al. Cloning of cDNA for vitellogenin
of the Parasitoid Wasp. Pimpla nipponica（Hymenopetera ：
Apocrita ：Ichneumonidae）：Vitellogenin Primary Structure
and Evolutionary Considerations［J］. Insect Biochemistry and
Molecular Biology, 1997, 27（1）：47-56.
［29］ Lee JM, Nishimori Y, Hatakeyama M, et al. Vitellogenin of the
cicada Graptopsaltria nigrofuscata（Homoptera）：analysis of
its primary structure［J］. Insect Biochemistry and Molecular
Biology, 2000, 30（1）：1-7.
［30］ Piulachs MD, Guidugli KR, Barchuk AR, et al. The vitellogenin
of the honey bee, Apis mellifera ：structural analysis of the cDNA
and expression studies［J］. Insect Biochemistry and Molecular
Biology, 2003, 33（4）：459-465.
［31］ Hirai M, Watanabe D, Kiyota A, et al. Nucleotide sequence
of vitellogenin mRNA in the bean bug, Riptortus clavatus ：analysis
of processing in the fat body and ovary［J］. Insect Biochemistry
and Molecular Biology, 1998, 28（8）：537-547.
［32］ 刘昌燕 . 大草蛉卵黄原蛋白基因功能研究［D］. 北京 ：中国
农业科学院 , 2013.
［33］ Tufail M, Takeda M. Molecular characteristics of insect
vitellogenins［J］. Journal of Insect Physiology, 2008, 54 ：1447-
1458.
［34］ 王利娜 . 龟纹瓢虫幼虫人工饲料的研究［D］. 北京 ：中国农
业科学院 , 2008.
［35］ Zeng F, Shu S, Park YI, et al. Vitellogenin and egg production in
the moth, Heliothis virescens［J］. Archives of Insect Biochemistry
and Physiology, 1997, 34（3）：287-300.
（责任编辑 马鑫）