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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 : 2011-11-16
基金项目 : 聊城大学博士启动基金项目（31805）
作者简介 : 冀芦沙 , 女 , 博士 , 研究方向 : 植物分子生物学 ; E-mail: jilusha@lcu.edu.cn
拟南芥甲基结合蛋白基因 AtMBP11启动子在种子
形成和萌发中的功能鉴定
冀芦沙 于守超 赵燕 肖庆振 王曰文
（聊城大学 植物分子生物学重点实验室，聊城 252059）
摘 要： 为研究拟南芥甲基结合蛋白基因 AtMBP11在种子形成和萌发过程中的调控模式，克隆拟南芥 AtMBP11启动子，将
其替换植物表达载体 pBI121的 35S启动子序列，转入拟南芥基因组中。转基因拟南芥后代卡那霉素抗性发生分离，选取具有 3 1
分离比的后代自交，产生纯合的具有单拷贝插入的后代。转基因后代 GUS染色结果表明，新克隆的 MBP启动子控制基因在种子、
花药和花粉中高效表达。通过对 AtMBP11核心启动子缺失分析表明，G-box元件是主要功能元件。
关键词： 拟南芥 启动子 甲基结合蛋白（MBP）
Functional Identification of the Promoter from Arabidopsis Methly-
binding Domain Proteins AtMBP11 in Seed
Ji Lusha Yu Shouchao Zhao Yan Xiao Qingzhen Wang Yuewen
（Key Laboratory of Plant Molecular Biology, Liaocheng University, Liaocheng 252059）
Abstract: To investigate the regulation mechanisms involved in the development and germination of the Arabidopsis seeds, the plant
expression vector pBI121 was constructed with the AtMBP11 promoter driving β-glucuronidase (GUS) gene which was transformed into the
Arabidopsis genome with flower-dip infiltration. In T2 generation, in which the kanamycin resistance segregated, the individual plant with 3 1
segregation ratio was selected and then selfed fertilized to produce single copy homozygous transformant. Subsequently, GUS staining profile of
the transformants showed that staining was mainly appeared in germinated seeds, pollen and anther. The deletion analysis showed that the G-box
is cole function element of the AtMBP11 promoter.
Key words: Arabidopsis Promotor Methly-binding domain proteins（MBP）
近年来研究表明，依赖于 DNA 甲基化的基因表
达调控在植物生长发育的分子调控中发挥着重要的
作用，大量的基因组印迹试验表明植物种子发育过
程中普遍存在 DNA 甲基化的发生［1, 2］。甲基结合蛋
白（Methly-binding domain proteins, MBP）是特异识
别甲基化 DNA 的重要反式作用因子，直接参与依赖
于 DNA 甲基化的基因表达调控［3］。拟南芥是目前
最主要的模式植物，探讨拟南芥种子发育及萌发的
分子调控机理对于研究植物生长有着重要意义。
甲基结合蛋白（MBP）可通过与甲基化 DNA 的
互作参与相关基因的表达调控，有关 MBP 的研究已
成为表观遗传学领域的研究热点之一［4］。研究发现，
拟南芥的 MBP 家族包含 11 个成员（AtMBP1-11），
依据其保守域的相似性可分为8个亚类［5］。Berg 等［6］
研究发现，拟南芥的 MBP 基因 AtMBP2、AtMBP4、
AtMBP5、AtMBP6、AtMBP7 和 AtMBP11 在 成 熟 的
拟南芥种子中均有较高水平的表达，而在幼嫩角果
中 AtMBP11 基因的表达尤为明显。虽然 MBP 基因
在各个组织中存在明显的表达差异，但其在拟南芥
种子发育及萌发过程中的表达特性及调控功能仍不
清楚。本研究拟在前人研究的基础上，分离甲基化
相关基因 AtMBP11 启动子序列，分析其序列特性及
2012年第4期 75冀芦沙等 ：拟南芥甲基结合蛋白基因 AtMBP11 启动子在种子形成和萌发中的功能鉴定
其在拟南芥种子发育和萌发过程中的表达模式，以
期为探讨种子发育及萌发过程的分子调控机制积累
重要资料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒载体 大肠杆菌（E. coli）菌株
DH5α、BL21、农杆菌菌株 LBA4404、pBI121 载体
等由聊城大学植物分子生物学实验室提供 ；pGEM-T
easy Vector 购自 Promega 公司。
1.1.2 植物试验材料 拟南芥（Arabidopsis thaliana
Columbia）由聊城大学植物分子生物学实验室提供。
1.1.3 工具酶和化学试剂 各种限制性内切酶、修
饰酶和 X-gluc 购自 Promega 公司 ；其他化学药品均
为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 拟南芥 DNA 的提取 以叶片为材料，采用
CTAB 法提取植物总 DNA［7］。
1.2.2 基因启动子的分离 根据拟南芥全基因组序
列预测 AtMBP11 基因（At3G15790.1）序列，推测
出其启动子的序列，并合成引物 ：FW: 5-CTTTCC-
CAGTCTCCATCTGATCATGC-3；RV: 5-GACCTTTA-
CTACCAGAAACACACAGAG-3，引物末端分别添加
Hind Ⅲ和 BamH Ⅰ的酶切位点。取拟南芥基因组
DNA 20 ng 为模板，以 FW 和 RV 为引物，进行 PCR
扩增，反应程序为 ：94℃预变性 10 min ；94℃变性
1 min，50℃退火 45 s，72℃延伸 120 s，35 个循环 ；
72℃延伸 10 min。PCR 产物经 1% 的琼脂糖凝胶电
泳后，回收纯化。连接到 pGEM-T easy 载体，转化 E.
coli菌株 BL21，获得的重组质粒 pT1。
1.2.3 植物表达载体构建 将构建的重组质粒 pT1
用 Hind Ⅲ /BamH Ⅰ双酶切，回收目的片段，连接
到同样经 Hind Ⅲ /BamH Ⅰ双酶切处理的 pBI121 载
体上（切除 pBI121 载体上 35S 启动子）。将连接产
物转化入 E. coli 菌株 DH5α。在含有卡那霉素（Kan，
50 mg/L）的 LB 培养基平板上筛选植物表达载体
pT2。
1.2.4 启动子缺失分析及表达载体构建 按李宝珍
等［8］的研究方法，运用 Overlap-PCR 技术对全长启
动子上的 G-box 元件和 ABRE 元件进行系列缺失。
缺失引物见表 1。
表 1 启动子缺失元件所需引物
名称 缺失元件 正向引物（5-3） 反向引物（5-3）
P1 GT1-motif GAGCGCATTTTATAGGTTAAACTTAATTG CAATTAAGTTTAACCTATAAAATGCGCTC
P2 Gap-box TTCCCCCAAAATGGAACTATTTGGCACGTGTATTG CAATACACGTGCCAAATAGTTCCATTTTGGGGG
P3 ABRE1 GTCGTTAACTATTTGTATTGCATGAGCACCAAG CTTGGTGCTCATGCAATACAAATAGTTAACGAC
P4 ABRE2 GAGCGCATTTTATATCACTGGTTAAACTTAATTG CAATTAAGTTTAACCAGTGATATAAAATGCGCTC
1.2.5 拟南芥转化 将 pT2 质粒用电击转化法转
入农杆菌 LBA4404 中，挑取含有 pT2 质粒的农杆
菌的单菌落，接种于 5 mL YEB（Spec 50 mg/L，Rif
50 mg/L）液体培养基中，28℃，250 r/min 培养 36 h。
按照 1 300 转接至 200 mL YEB（Spec 50 mg/L，Rif
50 mg/L）液体培养基中，28℃，250 r/min 培养约 15 h，
至 OD600 ≈ 2.0。5 000 r/min 离心 5-6 min，菌体重悬
于约2倍体积的5%的蔗糖溶液，至OD600≈1.0左右，
加入 0.02% 的 Silwet 70。采用花沾法转化拟南芥收
获种子，在含有 Kan 50 mg/L 的 1/2MS 培养基上筛选，
获得抗性植株。
1.2.6 抗性植株 PCR 检测 提取转基因植株基因
组 DNA 进行 PCR 检测，引物序列如下：FW: 5-ACC-
CACAGATGGTTAGAGAGGC-3；RV: 5-CTCTCC-
AAATGAAATGAACTTC-3。PCR 扩增程序 ：94℃预
变性 10 min ；94℃变性 1 min，55℃退火 30 s，72℃
延伸 120 s，30 个循环；72℃延伸 10 min。电泳检测。
1.2.7 GUS 染色 取不同生长时期的阳性拟南芥植
株（22℃，16 h 光照），进行 GUS 染色（100.0 mmol/L
磷酸二氢钠、0.5 mmol/L 高铁氰化钾、0.5 mmol/L
亚 铁 氰 化 钾、1.0 mmol/L X-gluc, 50 mg/mL DMSO、
0.1% Triton-100，37℃，过夜），95% 乙醇脱色后，
在体视镜下（Nikon DIGITAL CAMERA Dxm 1200F）
观察。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期76
2 结果
2.1 植物表达载体的构建及转基因拟南芥的检测
用 Hind Ⅲ /BamH Ⅰ双酶切切去植物表达载体
pBI121-GUS（35S::GUS）中的 35S 启动子，作为载
体部分，用同样的酶切组合在 pT1 中切下 AtMBP11
启动子部分作为插入片段，T4 DNA 连接酶连接载体
和插入片段，构建成 pT2（PAtMBP11::GUS）。如图 1-A
所示，Hind Ⅲ /PstⅠ双酶切构建成的 pT2，能切出
AtMBP11 启动子和 GUS 基因部分片段共 1.1 kb，证
实载体构建成功。
图 1 植物表达载体的构建（A）及转基因拟南芥的检测（B）
采用农杆菌介导法转化拟南芥 , 在含 Kan 50
mg/L 的 1/2MS 培养基上进行筛选，获得具有卡那霉
素抗性的转基因植株，提取基因组 DNA，进行 PCR
检测。得到抗性植株，自交收获的 T2 代种子在卡
那霉素培养基上播种，抗性发生分离。5 个株系中
有 3 个表现出 3 1 的分离比率（表 2）。选取 2 个
表 2 T2代株系卡那霉素抗性分离统计
T2 代株系 绿苗株数 黄苗株数 比率 符合 转基因拷贝数
T2-1 175 13 13.5 1 15 1 2
T2-3 138 56 2.5 1 3 1 1
T2-6 65 24 2.7 1 3 1 1
T2-7 49 22 2.2 1 3 1 1
T2-9 125 10 多拷贝基因插入
后代分离比是 3 1 的单拷贝插入株系进行 PCR 分
析以验证插入片段的存在。如图 1-B 所示，野生型
的拟南芥基因组中不含有 35S 的序列，所选的两
个株系都能扩增出 500 bp 的 35S 启动子片段（取
35S 启动子中间片段），进一步表明了外源基因的
存在。
2.2 GUS组织化学染色观察启动子的时空表达
在获得的 PCR 阳性的转基因拟南芥株系中，挑
选具有代表性的野生型、转 35S::GUS 拟南芥、转
PAtMBP11::GUS 的拟南芥株系分别在其萌发（3 d）、生
长（1 周）、开花（3 周）和结种的不同时期进行
GUS 组织化学染色观察。
如图 2 所示，T2 代转基因拟南芥种子在萌发 3
d 后染色观察发现，GUS 在子叶中表达最强、胚轴
次之，而胚根不表达 ；萌发 1 周以后的植株除主叶
脉有 GUS 表达外，其他部位均未有表达 ；萌发 3 周
后的植株，在各个部位均未发现 GUS 表达 ；在转
基因拟南芥的花器官中，发现在花药和柱头部位有
GUS 表达，在花器官的其他部位未检测到 GUS 表达；
转基因拟南芥果夹染色结果显示，GUS 在转基因种
子中也有表达。由此可见，AtMBP11 启动子调控最
强的部位是成熟的种子、花药和柱头，在种子萌发
初期检测有 GUS 表达，而 GUS 表达随着拟南芥营
养生长而逐渐减少，说明该启动子的表达具有明显
2012年第4期 77冀芦沙等 ：拟南芥甲基结合蛋白基因 AtMBP11 启动子在种子形成和萌发中的功能鉴定
的组织特异性，且与拟南芥生殖生长相关。
2.3 启动子序列结构特征及序列缺失分析
根据拟南芥 AtMBP11 的基因组 DNA 序列推
测其启动子序列，设计引物进行 PCR 扩增，得到
AtMBP11 基 因 ATG 上 游 746 bp 的 DNA 片 段。 根
据序列特征推测该启动子的 TATA box 和 CAAT box
分别位于距转录起始位点上游 -241--348 bp 处。如
图 3-A 所示，AtMBP11 启动子转录起始位点上游
800 bp 范围（-800-0 bp 处），预测到的顺式作用元
件中有 4 种与光调控有关（2 个 G-box，1 个 GT1-
motif，1 个 Gap-box），同时还发现 2 个 ABA 响应元
件（ABRE），ABRE 元件与 G-box 元件重叠。说明
AtMBP11 启动子区域中含有大量的与光调控和激素
调控有关的元件，说明 AtMBP11 的表达可能受光和
激素的调控。
运用 Overlap-PCR 对启动子上的光调控元件和
ABRE 元件进行缺失，将缺失后的启动子片段替换
表达载体 pBI121 上的 35S 启动子并转入拟南芥，通
过检测转基因拟南芥中 GUS 活性（单位时间内单位
蛋白产生 4-methlumbelliferone 的量，4-MU pmol/mg）
来验证核心启动子的功能（图 3）。结果显示，与
AtMBP11 全长启动子诱导的 GUS 活性相比，GT1-
motif 的缺失使 GUS 活性下降 10%，ABRE 的缺失使
GUS 活性下降 23%，G-box 和 ABRE 元件全部缺失
使 GUS 活性下降 27%。说明 G-box 和 ABRE 元件对
全长启动子的功能起着主要作用。
3 讨论
种子发育是植物有机体个体发育的最初阶段，
是联系植物营养生长和生殖生长的纽带［9］。研究
发现，DNA 甲基化调控相关的基因（如 AtDMT5、
AtDMT6 和 AtMBP11）在拟南芥胚乳发育的早期就
有较高水平的表达［10］，是能与甲基化 DNA 结合的
重要反式作用因子，在依赖于 DNA 甲基化的基因表
达调控过程中发挥着重要的功能［11-13］。研究显示，
在种子萌发过程中依赖于 DNA 甲基化的表观遗传学
调控发挥着重要的作用［14］。本研究对拟南芥中调节
甲基结合蛋白基因的启动子在种子萌发过程中的表
达特性分析也发现，AtMBP11 基因在种子萌发和形
成过程中发挥重要的调控作用，同时为后续检测启
动子甲基化的发生提供了有利的试验证据。
许多研究证明，外源基因转入植物后，在不同
个体、组织、器官基因表达水平都有一定的差别［15, 16］，
在测定 AtMBP11 全长启动子的 GUS 活性时发现，
同一类群不同个体的 GUS 活性相差很大，直接证实
图 2 转 35S::GUS拟南芥、野生型拟南芥（WT）、转基因拟南芥 GUS组织化学染色结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期78
前人的研究观点。一般情况下，农杆菌介导外源基
因的转化，都是低拷贝整合，但也多次报道过多拷
贝整合现象。尽管多拷贝整合有时会引起基因沉默，
但多拷贝整合引起的累加效应也有可能增加外源基
因的表达水平。因此，转基因表达的差异可能受到
位置效应、多拷贝整合等多种因素的影响。
本试验首次发现 AtMBP11 全长启动子可有效
调节外源基因在花粉和花药中表达，说明该启动子
直接或间接参与调控拟南芥生殖生长，为后续研究
启动子与外源胁迫和甲基化的相关性提供了试验基
础。启动子的序列分析发现，AtMBP11 全长启动子
上的 ABRE 元件与 G-box 元件重叠，说明该启动子
参与了光信号和外源激素 ABA 的调节，至于其研
究机理有待进一步的试验验证。G-box 最早是从编
码 RbcS 基因的上游区鉴定出来的一个植物通用信
号诱导元件，它高度保守［17］，通常含有一个核心序
列 5-CACGTG-3［18］。当把 AtMBP11 启动子上 G-box
元件全部缺失的时候，GUS 基因的表达不仅丧失了
组织的专一性，而且 GUS 活性与所有功能元件全部
缺失时相似。因此，我们推断 AtMBP11 启动子中
G-box 作用至关重要，它不仅与基因的特异表达有关
而且与基因的高效表达的关系也十分密切。
4 结论
本研究分离甲基化相关基因 AtMBP11 启动子
序列，利用生物信息学与分子生物学手段分析其序
列特性及其在拟南芥种子发育和萌发过程中的表达
V1. AtMBP11 全长启动子序列；V2. AtMBP11 全长启动子序列缺失 ABRE 元件；V3. AtMBP11 全长启动序列缺失 GT1-motif 元件；
V4. AtMBP11 全长启动子序列缺失 ABRE 元件和 GT1-motif 元件
模式，结果表明，AtMBP11 启动子可有效调控其
下游基因在种子、花药和花粉中高效表达。通过对
AtMBP11 核心启动子缺失分析表明，G-box 与 ABRE
元件是 AtMBP11 启动子主要功能元件。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）