全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):65-68
螺旋藻中的藻蓝蛋白是一种重要的捕光色素
蛋白，在光合作用原初理论研究方面具有很重要的
作用，具有更重要的开发利用价值［1］。藻蓝蛋白
（Phycocyanin，PC）具有抗癌、抗氧化、治疗脑缺
血损伤、提高机体免疫力等多种生理功能，有关 PC
的研究已经成为天然海洋药物的研究热点［2］，PC 的
提取分离技术也成为时下人们所关注的问题之一。
传统的 PC 分离提纯技术一般通过超声、反复冻融、
酶解和高压均质等方法使细胞裂解获得 PC 粗提物，
然后将（NH4）2SO4 沉淀法与多种色谱层析法结合
使用［3］，此类方法存在步骤繁琐、蛋白质损失量较大、
难以规模化推广，且高于 50% 的生产成本用在纯化
的过程中等缺点［4］。近几年不断发展起来的新技术
如双水相萃取技术、反胶团萃取技术、膨胀床吸附
及其一些不同技术结合使用等为藻蓝蛋白的规模化
制备提供了新的方法。本文对上述传统方法及其新
技术进行了综述，比较了几种主要的提取纯化方法
的优缺点，以期为藻蓝蛋白的进步研究与应用提供
参考资料。
1 螺旋藻藻蓝蛋白的粗提取
藻蓝蛋白的粗提取过程中细胞破碎是关键，细
胞破碎方法的选择是非常重要的［5］。张以芳等［6］用
氯化钾溶菌酶法或冻融法破碎螺旋藻细胞壁，应用
氯化钾溶菌酶法破壁率高达 95% 以上，藻蓝蛋白得
率可达 13.1% ；冻融法破壁只适宜于处理少量样品，
大剂量螺旋藻样品很难快速冻融，提取率达 11.8%。
表明酶法破壁适应于大量藻蓝蛋白制备，冻融法只
适应于小量制备。李冰等［7］用磷酸盐缓冲液循环冻
融联合超声波破碎法，提取率达到 13.1%。金怡雯
等［8］通过响应曲面的方法，对螺旋藻藻蓝蛋白的萃
收稿日期 ：2015-04-09
基金项目 ：国家自然科学基金项目（50267014）
作者简介 ：付丽丽，女，硕士研究生，研究方向 ：实验生物物理 ；E-mail ：359654412@qq.com
螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化方法研究进展
付丽丽  那日  郭久峰  金晶
（内蒙古大学自治区离子束生物工程重点实验室，呼和浩特 010021）
摘 要 ： 藻蓝蛋白具有抗氧化、增强机体免疫力、抗癌、抗炎及保肝护肝等诸多生理活性，被广泛应用于食品、化妆品及
医药等邻域，其提取纯化技术备受关注。列举了近些年藻蓝蛋白的提取纯化技术，比较了一些主要的提取纯化方法的优缺点。
关键词 ： 螺旋藻 ；藻蓝蛋白 ；提取纯化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.011
Research Progress on the Extraction and Purification of Phycocyanin
from Spirulina
FU Li-li NA Ri GUO Jiu-feng JIN Jing
（College of Physical Science and Technology，Inner Mongolia University，Hohhot 010021）
Abstract: Phycocyanin has been widely used in food, cosmetics, and medicine due to its physiological properties such as anti-oxidant,
improving the body’s immunity, anti-cancer, anti-inflammatory and protecting hepatocyte. Its extraction and purification technology has attracted
wide attentions. This work lists several extraction and purification technologies of phycocyanin in recent years, and compares the merits and
drawbacks of the major methods.
Key words: spirulina ；phycocyanin ；extraction and purification
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.166
取条件进行优化，结果表明，萃取时间和萃取温度
的交互作用对藻蓝蛋白得率的影响最为显著 ；得到
的最佳萃取工艺条件为 ：质量浓度为 2.0 mg/mL、萃
取时间为 37.14 h、萃取温度为 25.61℃，在此萃取
条件下得到的藻蓝蛋白得率为 13.66%。邵明飞等［9］
采用响应曲面法对超声波破壁提取螺旋藻中藻蓝蛋
白的工艺条件进行优化，得到的最佳工艺条件为 ：
液料比为 21 mL/g，超声波功率为 640 W，超声时间
为 14 min，此条件下藻蓝蛋白的得率为 10.76%，与
模型预测值 10.77% 相近，对超声波提取法、冻融法、
恒温浸提法进行比较研究发现，超声波提取法用时
短、藻蓝蛋白得率高。
以上粗提取过程中主要采用了溶菌酶法，反复
冻融，超声波破碎法等方法，对其进行列表（表 1）
比较，可根据其实际情况选择适当的处理方法。
表 1 PC 粗提取细胞破碎处理方法比较
方法 得率 /% 特点
溶菌酶法 13.10 适应于大量藻蓝蛋白制备
反复冻融 11.80 只适应于小量制备
冻融结合超声破碎 13.10 较高提取率
优化超声波破碎 10.76-13.66 用时短，处理量较小，能耗高
2 螺旋藻藻蓝蛋白的纯化技术
2.1 传统方法纯化藻蓝蛋白
传统的分离技术纯化藻蓝蛋白如离心、硫酸铵
沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、羟基磷灰石
层析等［10］。林红卫等［11］ 在硅藻土 545 柱上分级
洗脱，进一步经 DEAE-纤维素柱纯化，其纯度达到
了 4.1。另有殷钢等［12］为发展新型海洋药物，采用
Sephacryl S-200 凝胶层析和羟基磷灰石柱层析对人
工养殖钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白进行分离和纯化，
得到了藻蓝蛋白纯品。随之韦萍［13］采用自制羟基
磷灰石二次上柱可得试剂级的藻蓝蛋白，一次上柱
后 PC 纯度为 2.80，二次上柱后纯度为 4.18。其次，
许宝青［14］采用 DEAE-SepharoseFastFlow 结合羟基磷
灰石柱层析法分离纯化人工养殖钝顶螺旋藻中的藻
蓝蛋白，经脱盐、冷冻干燥后得到具有经济价值的
藻蓝蛋白纯品纯度为 7.25。李冰等［7］把粗蛋白提取
液经过两次羟基磷灰石柱（HA）层析和凝胶层析对
其纯化，纯度达到 4.71。于光等［15］把固体硫酸铵
沉淀盐泽螺旋藻藻胆蛋白经羟基磷灰石柱分离纯化
具光敏效应的藻蓝蛋白纯度达 4.7。邵明飞等［16］在
磷酸盐缓冲体系下藻蓝蛋白粗提液经 1.25 mol/L 硫
酸铵盐析处理后离心脱气，只需采用一步疏水层析，
藻蓝蛋白的纯度可提高到 4.017，回收率为 19.38%。
邵明飞等［16］通过六部最佳盐析（25% 除杂，55%
沉淀）（5% 除杂，35% 沉淀）（23% 除杂，35% 沉淀）
操作后，藻蓝蛋白纯度为 3.61，回收率为 47.13%，
经过反复盐析（23% 除杂，35% 沉淀）后，藻蓝蛋
白最高纯度达到 3.92，回收率为 9.66%。这些方法
耗时、复杂，难以大规模制备藻蓝蛋白［17］。
2.2 新技术规模化制备藻蓝蛋白
2.2.1 反胶团萃取纯化藻蓝蛋白 反胶团是指非极
性溶剂中表面活性剂分子浓度超过临界胶束浓度引
发形成的表面活性剂的极性头朝内、非极性头朝外
的具有极性内核的多分子聚集体［18］。丁晧［19］等构
建了 CTAB/ 正辛烷 - 正戊醇反胶束体系，通过研
究此体系中水合物生成对其中的藻蓝蛋白的萃取作
用及纯化效果，获得反胶束水合萃取藻蓝蛋白的动
力学规律及温度、压力、CTAB 浓度和初始含水量
等对反胶束水合萃取藻蓝，研究表明，在初始温度
3℃，初始压力 4 MPa，CTAB 浓度 0.10 mol/L，初始
含水量 40 的条件下，水合萃取藻蓝蛋白的萃取率
可达 81.3%，表明该条件时的萃取效果比较好。反
胶束水合萃取完成了萃取、反萃取及纯化过程的有
效耦合，相对于加盐反萃取操作难度有所下降，但
此方法仍不成熟，有部分藻蓝蛋白流失。另外，刘
杨等［20］研究了 CTAB/ 正戊醇 - 正辛烷反胶团溶液
萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白的性能，结果表明，0.04
mol/L CTAB/ 正戊醇 - 正辛烷（体积比 1∶4）的反
胶团体系用于萃取 pH7.0，包含 0.1 mol/L KCl 的螺
旋藻细胞破碎液，藻蓝蛋白萃取率达 96.3%，分配
系数打 26.0 ；用 pH5.0，包含 2 mol/L KBr 的反萃液
反萃藻蓝蛋白，反萃取率可达 90.6%。
2.2.2 双水相萃取纯化藻蓝蛋白 双水相萃取原理
主要是在一定浓度下，两种水溶性不同的聚合物或
者一种聚合物和无机盐的混合溶液体系会自然分成
互不相容的两相，形成双水相体系，被分离物质进
2016,32(1) 67付丽丽等：螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化方法研究进展
入双水相体系后，在表面性质、电荷间作用和各种
作用力等因素的影响下，两相间的分配系数不同，
导致上下相的浓度不同而达到分离的目的［21］。刘
杨等［22］采用 PEG/ 硫酸钠双水相体系，经一次萃取
从钝顶螺旋藻细胞破碎液中富集分离藻蓝蛋白，结
果显示，萃取最适宜的条件为 12% PEG4000，15%
Na2SO4，1% KCl，藻蓝蛋白收率为 91.2%，分配系
数达到 8.01，分离因数达到 6.33。随后，王巍杰等［23］
对构成双水相体系中不同分子量 PEG 和酒石酸钾
钠浓度的影响进行了分析。 确定了双水相组成体系
为 16％的 PEG2000（W/W）和 25％的酒石酸钾钠
（W/W），pH 值为 6.0，在此体系中藻蓝蛋白主要分
布在上相，最高纯度 3.69，分配系数 20.7，回收率
94.56%。多次双水相萃取有利于藻蓝蛋白纯度提高，
3 次双水相萃取后，藻蓝蛋白纯度高达 4.15。另外，
于淑坤等［24］对聚乙二醇 - 硫酸铵双水相体系萃取
螺旋藻藻蓝蛋白进行了研究，结果表明，对于藻蓝
蛋白含量为 0.282 mg/mL 的螺旋藻细胞破碎液，10%
PEG2000 与 20% 的硫酸铵双水相体系萃取藻蓝蛋
白的效果最佳，经 2 次萃取，藻蓝蛋白总萃取率为
96.1，藻蓝蛋白纯度达到 1.2。其次，齐清华［25］采
用 14% MgSO4、6% PEG2000、0.5% KC1 的 双 水 相
体系萃取后收集上相，再采用 12% PEG、6% MgSO4
的双水相体系对藻蓝蛋白进行反萃取，藻蓝蛋白回
收率达 92.66%，藻蓝蛋白纯度由 1.42 提高到 2.64。
可知，双水相萃取法具有节省操作时间、简化操作
过程、降低能耗和成本及易于工艺放大等优点。
2.2.3 膨胀床吸附纯化藻蓝蛋白 膨胀床吸附色谱
技术是一种介于固定床吸附和流化床之间的一种新
型的吸附色谱技术，可以作为实现藻蓝蛋白规模化
分离纯化的较好选择［5］。郭静［26］通过自制的膨胀
床对螺旋藻藻蓝蛋白的粗提液进行分离富集，藻蓝
蛋白的纯度可由粗提液的 0.23 最高提高至 2.02，藻
蓝蛋白浓度从粗提液的 0.17 mg/mL 提高为 2.15 mg/
mL，膨胀床分离富集藻蓝蛋白的回收率为 59.45%。
然后，在 ADS-7 固定床上对膨胀床纯化样品进行
层析去除杂蛋白。在优化的条件下，获得的藻蓝蛋
白层析样品的藻蓝蛋白纯度为 2.20，藻蓝蛋白浓度
为 0.87 mg/mL，藻蓝蛋白回收率为 58.81%。整个
偶联分离纯化过程耗时 7.0 h，藻蓝蛋白总回收率为
34.96%。此外，Niu 等［17］将通过硫酸铵沉淀后的藻
蛋白粗提液通过装有 50 mL 苯基 -Sepharose 吸附剂
的膨胀床，用大体积上样，体积为 298-340 mL 的藻
蛋白粗提液，采用 0.5 mol/L 硫酸铵进行脱附，收集
流出液。结果表明，通过一步膨胀床吸附，藻蓝蛋
白的纯化因子从 0.69 提高到 3.0 左右，且分别得到
了 29.9-51.0 g 的藻蓝蛋白。
2.2.4 不同技术结合纯化藻蓝蛋白 刘清新等［27］
采用盐析和双水相萃取相结合的方法分离纯化螺旋
藻中藻蓝蛋白，盐析法采用饱和度 35%-75% 的硫
酸铵沉淀藻蓝蛋白，饱和度 10%-30% 的硫酸铵去
除螺旋藻杂蛋白 ；双水相萃取法采用 8％ PEG4000、
16% 柠檬酸钠和 4％氯化钾组成的双水相系统分离
纯化盐析后的藻蓝蛋白。结果表明经 6 步不同饱和
度硫酸铵盐析后的藻蓝蛋白纯度为 3.1，再经双水相
系统分离纯化可使藻蓝蛋白纯度达 4.0，此种方法可
大幅提高藻蓝蛋白的纯度，为大规模生产提供科学
依据。另外，螺旋藻中的藻蓝蛋白由于存在重金属
和微囊藻毒素污染风险，使其相关产品的安全性受
到考验。胡梁斌等［28］采用双水相萃取和等电点沉
淀对藻蓝蛋白进行分离纯化，最终获得的藻蓝蛋白
中重金属 Cd 的质量浓度从 2 μg/mL 减少到 0.002 3
μg/mL，藻毒素的质量浓度则都从 3.5 μg/mL 降到检
测限以下，其安全性可以得到保障。此外，廖晓霞等［3］
采用壳聚糖亲和沉淀 - 活性炭吸附 -DEAE Sephadex
A-25 柱层析三步法分离纯化藻蓝蛋白，可得到高纯
度藻蓝蛋白，纯度达 4.3，与传统方法相比，具有成
本低、耗时短、操作便捷等优点。
以上介绍了近几年适用于规模化制备 PC 的新
方法，这些方法中各有其优缺点（表 2），实际应用
时应考虑其具体情况，选择适当的方法。
3 结语
在藻蓝蛋白粗提取方面，人们大多采用反复冻
融和超声破碎法。纯化则采用两种以上的色谱技术
相结合的方法，但其步骤复杂、产率低不适合规模
化生产 ；双水相萃取、反胶团萃、膨胀床吸附等方
法适合规模化分离纯化，但也存在其相应的缺点。
因此，具有低成本易操作、高提取率高纯度、适合
于大规模生产等优点的分离纯化方法将具有广阔的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.168
前景。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）
表 2 PC 规模化分离纯化技术方法比较
方法 优势 不足
反胶团萃取 成本低，无毒性，操作简单，连续操作处理量大 很不成熟，有部分藻蓝蛋白流失
双水相萃取 易于放大和操作，节省时间，降低能耗和成本，分离过程条件温和 不易完全从聚合物中分离出 PC
膨胀床吸附 具有集成化优势，回收率高，简化操作，降低成本，缩短操作时间 技术不成熟，操作不确定性
盐析结合双水相萃取 可大幅提高藻蓝蛋白的纯度 操作步骤繁琐，耗时长
等电点结合双水相萃取 有效除掉藻毒素和重金属污染 , 可广泛应用于食品工业领域 蛋白质分子结构易发生变化
壳聚糖亲和沉淀－活性炭吸附－
DEAE Sephadex A － 25 柱层析
成本低，耗时短，操作简便，能耗小 高要求仪器操作