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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
植物病毒侵染植物体后，植物将启动转录后
基 因 沉 默 机 制（Post-transcriptional gene silencing，
PTGS）进行防御，随着病毒基因组的复制而沉默
掉病毒的某些功能基因。根据植物的这种防御机
制，可对植物病毒进行改造，使其携带植物的内源
性基因，随着 PTGS 的进行就可以将内源的同源基
因沉默，从而引起植物表型变化，进一步根据表型
变化来推测基因功能，这种利用病毒载体来使植物
内源基因沉默的方法被称为病毒诱导的基因沉默
收稿日期 ： 2013-09-18
基金项目 ：大学生创新实验项目（2012X77），吉林省科技厅项目（20110244）
作者简介 ：张召军，男，生物技术专业 ；E-mail ：zhangzhaojunk@qq.com
通讯作者 ：何秀霞，博士，副教授，硕士生导师，研究方向 ：分子生物学及生物检测 ；E-mail ：chinese_hxx@sohu.com
中国番茄黄化曲叶病毒利用根吸收法诱导基因沉默
（VIGS）的初步研究
张召军  王晓彬  王慧  刘林  张心阁  何秀霞
（长春理工大学生命科学技术学院，长春 130022）
摘 要 ： 以含硫黄素酶 Su 基因的中国番茄黄化曲叶病毒卫星 DNA 作为载体，通过冻融法将其转化到农杆菌中，利用根部
吸收法进行农杆菌侵染，对农杆菌介导的病毒诱导基因沉默体系进行了优化，探讨对病毒诱导基因沉默效率的影响。结果显示以
OD600 值为 1.5 的含质粒 pBinPLUS-2mβ-Su，pBinPLUS-1.7A 的农杆菌菌液 1∶1 混合进行根部吸收法侵染 22-25 d 的番茄幼苗，目
的基因 Su 沉默导致番茄幼苗出现光漂白现象，半定量 RT- PCR 检测目的基因 Su mRNA 被显著降解，该体系的建立有利于对植物
基因进行高通量功能分析。
关键词 ： 病毒诱导基因沉默 硫黄素酶 Su 基因 根吸收法
Study on Chinese Tomato Yellow Leaf Curl Virus-induced Gene
Silencing（VIGS）via Root Absorption
Zhang Zhaojun Wang Xiaobin Wang Hui Liu Lin Zhang Xinge He Xiuxia
（College of Life Science，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）
Abstract:  The tomato yellow leaf curl virus satellite DNA was used as vector which containing the Su gene, and transformed the plasmid
into Agrobacterium by freeze thawing method. Agrobacterium infected plants via root absorption, and virus-induced gene silencing system was
optimized, twexplore the influence to virus-induced gene silencing efficiency. The results showed infected 22-25 days tomato seedling via OD600
1.5 Agrobacterium-mediated root-absorption which containing plasmid pBinPLUS-2mβ-Su and pBinPLUS-1.7A, the silencing of Su gene resulted
in photo-blcached young leaves of tomato plants. Semi-quantitative RT-PCR analysis was employed to test the effect of Su gene silencing, which
showed that Su gene was degraed significantly. This gene-silencing system would benefit for the high-throughput analysis of plant gene.
Key words:  Virus-induced gene silencing Su gene Root absorption method
（virus-induced gene silencing，VlGS）［1-4］。 国 内 外
在 烟 草（Nicotiana tabacum）［5，6］、 番 茄（Solanum
lycopersicum）［7，8］、马铃薯（Solanum tuberosum）［9］、
辣椒（Capsicum annuum）［10，11］等植物幼苗中已成
功建立病毒诱导的基因沉默体系，但多采用传统的
注射法，该方法会伤害到植物本身而造成沉默效率
较低，不宜对幼苗进行操作，采取根部吸收法可以
避免上述缺点。但利用根吸收法诱导基因沉默的研
究报道还比较少［12，13］，为此展开相关研究。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期144
1 材料与方法
1.1 材料
番茄种子由市面上购买。大肠杆菌 DH5α 菌种，
农 杆 菌 EH101 菌 种 由 本 实 验 室 保 存 ；pBinPLUS-
2mβ-Su，pBinPLUS-1.7A 质粒由浙江大学周雪平教授
惠赠。PCR 检测病毒组分中的 1.7A 和 DNAmβ 及 Su
基因引物参考陶小荣论文［14］。
1.2 方法
1.2.1 质 粒 DNA 转 化 农 杆 菌 将 质 粒 pBinPLUS-
2mβ-Su，pBinPLUS-1.7A 利用冻融法分别转化农杆菌
EHA101 感受态。转化后涂含 50 mg/L 卡那霉素和
50 mg/L 利福平的培养基平板，37℃倒置过夜培养。
1.2.2 番茄幼苗的培养 番茄种子经 75% 酒精 1
min，10% 次氯酸钠 15 min 灭菌后，播种于 1/2MS
培养基上。10 d 后，将生成的无菌苗无土培养，转
到人工气候室中生长。
1.2.3 根部吸收法侵染番茄幼苗 挑取含 pBinPLUS-
2mβ-Su，pBinPLUS-1.7A质粒的农杆菌 EH101单菌落，
接种于 5 mL 含有 50 mg/L 卡那霉素和 50 mg/L 利福
平的 LB 液体培养基中，28℃过夜培养。按 1∶1 的
比例混匀，室温放置 2-3 h 后，选取农杆菌 OD600 值
依 次 为 0.5，0.75，1.0，1.25，1.5，1.75，2.0， 对
21 株番茄幼苗进行侵染效率分析，确定最佳侵染浓
度。为了使番茄在侵染期能更好地吸收农杆菌菌液，
先将要被侵染的番茄幼苗脱水 1-2 d。侵染时，将番
茄植株移入到装满农杆菌菌液 4 mL 的 EP 管中，暗
室培养 24 h，有利于农杆菌的侵染，后转入正常培养。
沉默症状出现后进行统计，确定最佳农杆菌侵染浓
度。以确定的最佳侵染浓度对生长 16-40 d 的番茄
幼苗进行农杆菌侵染，确定最佳侵染苗龄。
1.2.4 植株基因组 DNA 提取 在硫黄素酶（Su）基
因沉默植株症状表现后，1.5 mL 的离心管扣取植株
顶端的少许新叶，将 1 mL 枪头用酒精灯熔化并凝固
成圆头，充分研磨离心管中的叶片，利用 CTAB 法
提取基因组 DNA，溶于 20 μL 无菌离子水中。
1.2.5 PCR 检测基因组 DNA 中的病毒成分 PCR 筛
选中国番茄黄化曲叶病毒诱导的硫黄素酶（Su）基
因沉默植株中病毒组分中的 1.7A 的引物为 PA、PB。
PCR 扩增程序为 95℃，5 min ；95℃，45 s，52℃，
30 s，72℃，45 s，35 cycle ；72℃，10 min。对所提
取基因组 DNA 进行病毒组分中 DNAmβ 的检测所用
引物为 Beta01 和 Beta02，PCR 扩增程序中除 72℃，
90 s 外其余同 1.7A 扩增条件。两个 PCR 反应使用
同一体系。组分为 ：10 ×PCR buffer 2.5 μL ：ddH2O
19.3 μL ；Taq plus 0.2 μL ；引物 1（10 pmol/L）1 μL ；
引物 2（10 pmol/L）1 μL；dNTP 0.5 μL；模板质粒 0.5
μL ；终体积为 25 μL。
1.2.6 植株总 RNA 的提取与半定量 RT-PCR 检测
根据 Trizol 试剂盒提供的操作手册进行总 RNA 的
提取，提取完成后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。利
用 TaKaRa 反转录试剂盒进行反转录 ：MgCl2 2 μL ；
RNase Free dH2O 3.75 μL ；10×RT buffer 1 μL ；dNTP
Mixture（ 各 10 mmol/L）1 μL ；RNase Inhibitor 0.25
μL ；AMV Random Transcriptase 0.5 μL ；Oligo dT-
Adaptor Primer 0.5 μL ；试验样品 RNA（≤ 1 μg total
RNA）1 μL ；终 体 积 为 10 μL。 反 转 录 条 件 为 ：
30℃，10 min ；42℃，25 min ；99℃，5 min ；5℃，5
min ；all 1 cycle。以延长因子 -1-α（Elongation factor
l-alpha 1 gene，EF-1-α）作为半定量 RT-PCR 的内参。
以 Su 的引物对反转录合成的 cDNA 进行半定量 RT-
PCR，在 15、18、21、24、27 和 30 个 PCR 循环时分
别取出 8 μL PCR 反应产物。PCR 产物经 0.8% 琼脂
糖电泳检测后凝胶成像。
2 结果
2.1 农杆菌最佳接种浓度的测定
对 21 株幼苗进行不同浓度农杆菌侵染效率的分
析，结果（图 1）表明，农杆菌的 OD600 值在 1.5 时
的沉默效率最高，农杆菌的 OD600 在 1.0 以下时沉默
效率较低，在大于 1.75 左右时对植物细胞有一定的
毒害作用，导致番茄幼苗萎蔫或者坏死。
100
80
60
40
20
0.5 0.75 1.25
ߌᵶ㧼Ⲵ⎃ᓖOD٬
1.751.5 21
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⦷%

0
图 1 农杆菌浓度（OD 值）与沉默效率的关系
2014年第1期 145张召军等 ：中国番茄黄化曲叶病毒利用根吸收法诱导基因沉默（VIGS）的初步研究
2.2 番茄苗龄对VIGS效率的影响
选择生长 16-40 d 的番茄进行农杆菌侵染，沉
默症状（图 2）出现后进行统计，结果（图 3）表明
番茄幼苗在 22-25 d 时，用 OD 值在 1.5 附近的农杆
菌侵染时，沉默效率可达 84%。
片段大小分别为 1 300 bp、500 bp。初步表明病毒成
分已经整合到番茄基因组中，所检测含有两种病毒
组分的植株在外观上都有硫黄素酶（Su）基因沉默
的症状（植株黄化）表现（图 2）。
图 2 Su 基因沉默症状的番茄植株
100
80
60
40
20
1618 1921 ᒬ㤇㤇喴d 34372633 38402225
⮚㤴
ᒬ㤇
Ⲵ⊹
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⦷%

0
图 3 番茄苗龄与沉默效率的关系
2.3 番茄基因组DNA的提取结果
将样品直接放入 1.5 mL 的离心管中研磨，保证
研磨充分。结果（图 4）显示提取的 DNA 有降解，
但是不会影响后续试验。
M A B C D E F
M ：1 kb DNA ladder marker ；A-F ：基因组 DNA
图 4 接种 Su 番茄植株基因组 DNA.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
M ：1 kb DNA ladder marker ；1 ：阳性对照 ；2 ：阴性对照 ；3-24 ：接种 Su
植株的 PCR 鉴定
图 5 接种 Su 番茄植株基因组中的 DNAmβ 组分的 Beta
01、Beta 02 的 PCR 鉴定
M ：1 kb DNA ladder marker ；1 ：阳性对照 ；2 ：阴性对照 ；3-24 ：接种 Su
植株的 PCR 鉴定
图 6 接种 Su 番茄植株基因组中的 DNA-A 的 1.7A 片段的
P A、P B 的 PCR 鉴定
2.5 转化植株半定量RT-PCR检测
Trizol 法提取总 RNA，琼脂糖凝胶电泳观察结
果（图 7）显示，所提取的总 RNA 完整未降解，有
3 条电泳带，从上到下分别为 28S，18S 和 5S。
28S
18S
5S
图 7 总 RNA 提取结果
以 Su 的引物对反转录合成的 cDNA 进行半定量
RT-PCR（图 8），看到未接种植株的 Su 的表达量要
显著高于 Su 基因沉默植株的表达量，差异显著。
3 讨论
农杆菌最佳侵染浓度 OD600 为 1.5 左右，高于
常规农杆菌侵染菌液为 OD600=0.5-1，分析原因可
2.4 PCR检测基因组DNA中的病毒成分
以提取的番茄叶片 DNA 为模板，扩增中国番
茄黄化曲叶病毒诱导的硫黄素酶（Su）基因沉默植
株中病毒组分中的 DNAmβ（图 5）和 1.7A（图 6），
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期146
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（责任编辑 李楠）
A ：Su 引物对沉默植株及对照 ；B ：内参 EF-1-α 引物对沉默植株
及对照；1-6 : 15、18、21、24、27 和 30 个循环的 PCR 产物 ; M：
1 kb DNA ladder marker
图 8 Su 基因沉默的番茄植株的半定量 RT-PCR 检测
A：Su
B：EF-1-α
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6M
Suสഐ⊹唈ἽṚ ሩ➗
能的是由于植物不断生长，侵染的农杆菌菌液浓度
略高于常规的侵染浓度才能达到整体植物侵染的要
求［15］。处于 22-25 d 的番茄幼苗具有最佳感受农杆
菌的能力，农杆菌侵染要求植物细胞必须处于感受
状态（即选择合适的苗龄），如果植物苗龄过大，除
了番茄的细胞感受能力下降外，植物的节间变长，
延长了病毒沉默信号传导的途径，导致沉默的效率
下降。由此可见苗龄对沉默效率有重要的影响［16］。
传统的注射法是常用的病毒诱导基因沉默的农
杆菌侵染方法，但这种方法会伤害到植物本身而造
成沉默效率较低，不宜对幼苗进行操作。本试验采
取的根部吸收法是通过植物的根浸润在携带有番茄
黄化曲叶病毒卫星 DNA 载体的农杆菌重悬液中，利
用植物本身的传递将沉默信号传递到叶茎部，成功
地诱导了 Su 基因沉默，对植物本身没有伤害，可以
对浸润注射无法接种的更小幼苗进行接种，因此适
用的植物范围更广。例如，Ryu 等［17］利用 TRV 病
毒载体通过根吸收法成功的在本氏烟和其他重要的
经济作物如番茄、辣椒、烟草、矮牵牛等茄科及豆
科植物中诱导了八氢番茄红素脱氢酶 PDS 基因沉默。
为此根吸收法有助于快速大规模 cDNA 文库分析。
4 结论
通过根吸收法进行农杆菌侵染诱导番茄植株发
生 RNA 沉默，该体系的建立有利于对植物基因进行
高通量功能分析。
参 考 文 献
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silencing［J］.Curr Opin Plant Biol, 1999, 2（2）：109-113.
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