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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
促前胸腺激素（Prothoracicotropic hormone，简
称 PTTH）是由大脑神经分泌细胞产生，刺激前胸
腺分泌蜕皮酮的神经肽类激素，对昆虫的生长发育、
蜕皮、变态、滞育［1-3］等起到重要的调控作用。作
为第一个在无脊椎动物中发现的激素，PTTH 的研
究始于 1922 年，由波兰学者 Kopec 通过对舞毒蛾
Lymantria dispar 幼虫蜕皮前进行结扎、摘除脑的试
收稿日期 ：2014-03-27
基金项目 ：国家现代农业产业技术体系建设专项基金项目（CARS-04）
作者简介 ：周夏，女，硕士研究生，研究方向 ：昆虫生物化学与分子生物学 ；E-mail ：dnzhouxia@163.com
通讯作者 ：樊东，男，博士，教授，博士生导师，研究方向 ：昆虫生物化学与分子生物学 ；E-mail ：dnfd@163.com
苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的克隆与原核表达
周夏  郭博智  高艳玲  赵奎军  樊东
（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）
摘 要 ： 促前胸腺激素（Prothoracicotropic hormone，PTTH）是一类重要的昆虫激素，它对昆虫生长、蜕皮、变态、滞育具
有重要调控作用。以苜蓿夜蛾 5 龄幼虫为材料提取总 RNA，利用 RT-PCR 和 RACE 技术，扩增得到苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的
cDNA 序列，该序列含有 823 个碱基，包括 1 个 681 个碱基的开放阅读框，编码 1 个含 226 个氨基酸的蛋白，分子量约为 26.3 kD，
等电点为 8.51。序列分析表明，苜蓿夜蛾 PTTH 的氨基酸序列与其他昆虫，尤其是鳞翅目夜蛾科昆虫的 PTTH 高度同源。获得的基
因已登录 GenBank，登录号为 JF731347。利用原核表达载体 pET21b 在大肠杆菌中成功表达了苜蓿夜蛾 PTTH 基因，并用 Ni-NTA
亲和层析柱将带 His-tag 的目的蛋白进行纯化。
关键词 ： 苜蓿夜蛾 促前胸腺激素 基因序列克隆 原核表达
Molecular Cloning and Prokaryotic Expression of Prothoracicotropic
Hormone cDNA Sequence from Heliothis viriplaca
Zhou Xia Guo Bozhi Gao Yanling Zhao Kuijun Fan Dong
（College of Agriculture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）
Abstract: Prothoracicotropic hormone（PTTH）is a group of important insect hormones. They have vital effect on regulation of growth,
ecdysis, metamorphosis and diapause of insects. Total RNA was isolated from the fifth instar larvae of Heliothis viriplaca. The cDNA sequence
was cloned by RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends（RACE）. The cDNA sequence was 823 base pairs in length and contained
an open reading frame of 681 base pairs, encoding for a polypeptide of 226 amino acid residues, with a predicted molecular weight of 26.3 kD
and pI 8.51. Sequence analysis showed that the predicted amino acid shared extensive similarities with those from other insects, especially the
lepidopteran noctuid insects. The cDNA sequence has been deposited in GenBank with accession No. JF731347. The cDNA sequence was
successfully expressed by the recombinant prokaryotic expression vector pET21b in E. coli. The recombinant protein with His-tag was purified by
Ni-NTA affinity chromatography.
Key words: Heliothis viriplaca Prothoracicotropic hormone cDNA cloning Prokaryotic expression
验发现昆虫形态变化受脑控制，他将其命名为脑激
素［4］。1940 年 Wigglesworth 在 长 红 猎 椿 Rhodnius
prolixus 中发现脑激素是由脑神经分泌细胞产生的［5］。
随后 Williams 于 1947 年以惜古比天蚕的滞育蛹为
材料，证明这种脑激素具有促进前胸腺分泌蜕皮激
素诱导变态的作用，所以把脑激素改称为 PTTH［6］。
近年来对 PTTH 的研究不断深入，对家蚕神经肽促
2014年第10期 145周夏等：苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的克隆与原核表达
前 胸 腺 激 素 研 究 发 现， 家 蚕 PTTH 基 因 mRNA 的
发育表达变化可能与其调控蜕皮激素合成的功能有
关［7］。为了明确 PTTH 受体及其作用机制，Rewitz
等［8］发现果蝇前胸腺特异性表达的 Torso 基因编码
PTTH 受体［9］，而非之前人们猜测的 G-蛋白偶联受
体。2012 年王秋实等［10］从柞蚕中克隆得到血清素
受体 B（5HTRB），利用 RNA 干扰技术把 5HTRB 基
因的 dsRNA 注射进入虫体，导致柞蚕滞育的终止，
同时发现 PTTH 表达量增加，证明 5HTRB 可以抑制
PTTH 的合成，从而推测其可能是柞蚕的 PTTH 受体。
为了研究 PTTH 对滞育蛹的作用，Mizoguchi 等［11］
于 2013 年研究发现甘蓝夜蛾 Mamestra brassicae 非
滞育蛹化蛹后血淋巴中 PTTH 滴度维持在较高水平，
而滞育蛹化蛹后 PTTH 滴度降到很低水平 ；相反化
蛹后滞育蛹脑中 PTTH 表达量比在非滞育蛹脑中表
达量高。这说明滞育蛹的脑中 PTTH 的表达量较高，
但不释放到血淋巴中。在立即注射 PTTH 后滞育蛹
被诱导而化蛹，因此蛹滞育被证实是由于 PTTH 的
分泌终止造成的。
1990 年 Kawakami 等［12］用分子克隆的方法第
一次得到全长的家蚕 PTTH 分子，并证实具有活性
的家蚕 PTTH 是一个糖基化的同源二聚体，通过一
个分子间和三个分子内的二硫键构成［13］。目前已经
在烟芽夜蛾 Heliothis virescens AY172671［14］，棉铃虫
Helicoverpa armigera AY286543［3］，谷实夜蛾 Helico-
verpa zea AY172670［15］，烟实夜蛾 Helicoverpa assulta
AY780526，甜菜夜蛾 Spodoptera exigua AY780527［16］，
甘蓝夜蛾 AB748456［11］，家蚕 Bombyx mori NM_001-
043884，烟草天蛾 Manduca sexta AY007724［17］，惜古
比天蚕 AF288695［18］，柞蚕 U62535［19］，日本柞蚕
Antheraea yamamai AY461435 中成功克隆得到 PTTH
基因，这些基因的获得为 PTTH 的深入研究提供了
依据。
苜蓿夜蛾 Heliothis viriplaca 属鳞翅目，夜蛾科，
主要危害豆科植物，如大豆、苜蓿等。苜蓿夜蛾以
幼虫直接取食为害，其分布广泛，已成为大豆田中
的重要食叶性害虫。本研究克隆苜蓿夜蛾 PTTH，获
取基因 cDNA 全长序列，并对该基因在大肠杆菌中
的表达进行研究，旨在为进一步利用该基因从分子
水平防治苜蓿夜蛾奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试虫源 利用黑光灯在田间诱集苜蓿夜蛾
成虫，室内饲以 5% 蜂蜜水使其产卵，并用未接触
任何农药的新鲜豆叶做饲料喂养到 5 龄幼虫备用。
1.1.2 菌 株、 质 粒 及 主 要 试 剂 受 体 菌 DH5α、
BL21、表达载体 pET21b 由本研究室保存。RNA 提
取试剂盒 TRIzol®Reagent（购自 Invitrogen 公司）；反
转 录 酶 M-MLV Reverse Transcriptase、T4 DNA 连 接
酶、低熔点琼脂糖（购自 Fermentas（FBI）公司）；
克隆载体 pMD18-T、DNA 胶回收试剂盒、DL2000
DNA Marker、TaKaRa 5-Full RACE Kit（购自 TaKa-
Ra 公司）；蛋白 Marker 和 Ni-NTA 亲和层析柱购于
北京全式金公司。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的 提 取 及 cDNA 的 合 成 按 照
TRIzol®Reagent 试剂说明提取已进行饥饿处理 12 h
的苜蓿夜蛾 5 龄幼虫的总 RNA，进行纯度和完整
性鉴定后放入 -80℃冰箱中备用。以 dt-R0-Ri（表
1）为 cDNA 合成引物，利用反转录酶 M-MLV 合成
cDNA。最终产物保存于 -20℃冰箱中。
1.2.2 引物设计与合成 本研究所用引物及用途见
表 1，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
1.2.3 PCR 产物克隆、鉴定及序列测定 比较烟蚜
夜蛾（AY172671）以及棉铃虫（AY286543）两种昆
虫 PTTH 基因的 cDNA 序列，设计 1 对适用于克隆
苜蓿夜蛾 PTTH 基因 cDNA 序列的部分片段的引物 ：
PTTH 和 antiPTTH（表 1）。PCR 反应条件为 ：94℃
预 变 性 5 min ；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，
30 个循环 ；72℃延伸 10 min，PCR 产物经 1.0% 琼
脂糖凝胶电泳检测后，回收，与 pMD18-T vector 连接、
转化到 E.coli DH5α 培养、双酶切鉴定。连接正确的
重组子由哈尔滨博仕生物技术公司进行序列测定。
1.2.4 利用 RACE 技术克隆 cDNA 全长序列 根据
得到的基因片段设计 PTTH 3 端 cDNA 序列的引物
PTTH3 Ro 和 PTTH3 Ri（表 1）。用 PTTH3 Ro 与 3-
Ro 进行 Outer PCR，电泳检测后，用 PTTH3 Ri 和
3-Ri 对 Outer PCR 产物进行巢式 PCR 扩增，然后进
行 3RACE 产物电泳分离检测、克隆和测序，方法
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期146
同上。
5 RACE 反 应 按 照 TaKaRa 5 Full RACE Kit 说
明书，合成 cDNA 第一链，用 PTTH 5 Ro 和试剂盒
提供的 5-RACE Outer Primer 进行第一轮扩增，然后
以扩增产物为模板，用 PTTH 5 Ri 和 5-RACE Inner
Primer（表 1）进行巢式 PCR 扩增，最后 5 RACE
产物进行电泳分离检测、克隆和测序，方法同上。
对以上几个反应获得的序列片段进行拼接，获
得 PTTH 的全长序列，根据全长序列设计克隆基因
全长序列的引物 PTTHF 和 PTTHR（表 1），一次性
克隆全长序列。
1.2.5 序列分析 用 BioXM2.6 软件对获得的 cDNA
序 列 进 行 翻 译 ；利 用 ExPASy 网 站（http ：//us.
expasy.org/tools/dna.html） 蛋 白 分 析 软 件 推 导 氨 基
酸序列的分子质量、等电点和结构域 ；SignalP 4.1
Server 进 行 信 号 肽 的 预 测 ；CFSSP 软 件 进 行 二 级
结构的预测 ；SWISS-MODEL 服务器进行自动建模
（Automate Mode），预测该蛋白的三维结构 ；同源性
比较采用 NCBI 中的 BLAST 工具 ；进化树构建采用
ClustalX、MEGA4.1 软件。
1.2.6 苜蓿夜蛾 PTTH 基因原核表达及纯化 用引
物 PTTH EcoR I（含 EcoR I 酶切位点）和 PTTH Xho I
（含 Xho I 酶切位点）（引物序列见表 1）进行 PCR 扩
增，反应结束后产物电泳检测并回收。对回收产物
和表达载体 pET21b 分别进行双酶切，产物回收后使
用 T4 连接酶 16℃过夜连接，构建表达载体 pET21b-
PTTH，并转至 DH5α 感受态细胞中。蓝白斑筛选出
阳性克隆，摇菌、测序、提取质粒，用 EcoR I 和
Xho I 双酶切鉴定并测序验证，鉴定正确的重组质粒
转至 BL21 中。使用 IPTG 诱导表达，SDS-PAGE 凝
胶电泳检测，表达之后使用 Ni-NTA 亲和层析柱纯
化带 His-tag 的目的蛋白。
2 结果
2.1 苜蓿夜蛾PTTH的cDNA序列
利用 RT-PCR 和 RACE 获得了苜蓿夜蛾 PTTH
的 cDNA 全 长 序 列（ 图 1）。 序 列 大 小 为 823 个 碱
基，开放读码框编码 226 个氨基酸的多肽（图 2），
分子量为 26.3 kD，等电点为 8.51。核苷酸序列在
GenBank 登录，登录号为 JF731347。
表 1 本试验中所用引物
引物名称 引物序列（5-3） 引物用途
dt-R0-Ri ATC GAT GGT CGA CGC ATG CG G ATC CAA AGC TTG AAT TCG AGC TC（T）17 cDNA 第一条链的合成
PTTH GAA AGC TGT ACA GTC ATG cDNA 特异片段的扩增
antiPTTH GTA ACG GCT CTA TTC ACA
PTTH3 Ro GGC CGC TAA TTT GTG TGA TAG TAT GT cDNA3 末端的扩增
PTTH3 Ri TCA CTT CAA CTG GAA CCT GCG AAC C
3- Ro ATCGATGGTCGACGCATGCGGATCC
3- Ri GGATCCAAAGCTTGAATTCGAGCTCT
PTTH5 Ro CTC TTC AGG GTT CGC AGG T cDNA5 末端的扩增
PTTH5 Ri TTC GTT TGC GTG TCC TTT GGT CTT CTA GCA TGT A
5-RACEOuter CAT GGC TAC ATG CTG ACA GCC TA
5-RACEInner CGC GGA TCC ACA GCC TAC TGA TGA TCA GTC GAT G
PTTHF GAT AAC TCG GCC GCT AAT TTG 全长 cDNA 序列的克隆
PTTHR TGT GAA TAG AGC CGC CAA GGG CA
PTTH EcoRI CCG GAA TTC ATG AAA CAT TCT AAC GTA GAC G 原核表达
PTTH XhoI CCG CTC GAG TGT CTC AGT AGC GTA GTA ATC T
2000
bp
M 1
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker ；1 ：PTTH 基因 PCR 产物
图 1 苜蓿夜蛾 PTTH 全长 cDNA 序列的 PCR 扩增产物
2.2 PTTH基因编码蛋白质的氨基酸序列特征分析
利 用 Expasy molecular biology server 的 Scanpro-
site facility 对推导的苜蓿夜蛾促前胸腺激素氨基酸
2014年第10期 147周夏等：苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的克隆与原核表达
的结构域进行预测。推导得到的苜蓿夜蛾促前胸腺
激素氨基酸序列含有一个 N-位糖基化位点和一个 O-
位糖基化位点。SignalP4.0 进行信号肽分析时发现
PTTH 推导的氨基酸在 28 和 29 位之间存在一个信号
肽切割位点。含有 PTTH 特有的 7 个半胱氨酸残基。
通过 CFSSP 软件预测 PTTH 蛋白的二级结构，预测
结果（图 3）显示，β-折叠和 α-螺旋是其最主要的
二级结构元件，其次是无规则卷曲和 β-转角。预测
1 AGTC
5 ATGATAACTCGGCCGCTAATTTGTGTGATAGTATGTTTTGGATTCATCATTTTAATTCAATCACTAGTGCCGAAGGTGATGGCAAT
1 M I T R P L I C V I V C F G F I I L I Q S L V P K V M A M
91 GAAACATTCTAACGTAGACGAATACATGCTAGAAGACCAAAGGACACGCAAACGAAAAAACTATGTTGTAAGACTGGCTAGAGACAGCGA
30 K H S N V D E Y M L E D Q R T R K R K N Y V V R L A R D S E
181 AATATTAGGCAAGCCTGGTAATGTAGGAACAAATTACGATACGGACTCACTTCAACTGGAACCTGCGAACCCTGAAGAGTTGTCTGCCTT
60 I L G K P G N V G T N Y D T D S L Q L E P A N P E E L S A F
271 TATAGTTGATTACGCAAACATGATACGCAATGATGTTATTTTATTAGACAAGTCAGTTGAAACGAGGACCCGGAAAAGGGGTAACATCAA
90 I V D Y A N M I R N D V I L L D K S V E T R T R K R G N I K
361 AGTCGAGAAGTATAATAATCAAGCTTTGCCAGATCCTCCCTGCGCCTGTAAATTCAGCCCAACCAGAACGGATTTGGGTGAAAACGCTTA
120 V E K Y N N Q A L P D P P C A C K F S P T R T D L G E N A Y
451 CCCACGTTACGTAGAAACTAGAAATTGCAGCCAAGCGCGTCAACAGTCTTGTCGCCTGCCCTACGTTTGCAGAGAAAACTACTACAACAT
150 P R Y V E T R N C S Q A R Q Q S C R L P Y V C R E N Y Y N I
541 AACAATTATAAGAAGAAAGGAGTTTCAAAACCAGGCTACCCTAGACGATATACCACATGACCTTAAGTTCAGATGGATTGCTGAATATTA
180 T I I R R K E F Q N Q A T L D D I P H D L K F R W I A E Y Y
631 TCCCGTCAGCGTAGGGTGTGTCTGCACCAGAGATTACTACGCTACTGAGACATAAACATTCTGTACATGATATCGACTTTCTGGAAAGCA
210 P V S V G C V C T R D Y Y A T E T *
721 ACTCGAAAATGTCTTTCCATAAGTGAAATATGTGAATAGAGCCGCCAAGGGCAAATTTTAACCATTAAAAAATGCTGTGGATCTTGTAAA
811 AAAAAAAAAAAAA
起始密码子 ATG 和终止密码子 TAA 加粗表示 ；糖基化位点用双划线表示 ；水解酶位点以黑色阴影表示 ；信号肽用单下划线表示 ；7
个保守的半胱氨酸用加框表示
图 2 苜蓿夜蛾 PTTH 基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列
2260
竖线由长及短分别为 Helix、Sheet、Turn、Coil
图 3 苜蓿夜蛾 PTTH 蛋白的二级结构
C
N
图 4 PTTH 蛋白的三级结构
得到 PTTH 蛋白的三维结构（图 4）。 2.3 同源性分析
氨 基 酸 序 列 比 对 结 果 表 明， 苜 蓿 夜 蛾 PTTH
与 其 他 登 录 GenBank 的 昆 虫 PTTH 序 列 一 致 性 达
60% 以 上， 其 中 与 烟 芽 夜 蛾（AY172671）、 棉 铃
虫（AY286543）一致性最高，达 92%，与谷实夜
蛾（AY172670）、烟实夜蛾（AY780526）、甜菜夜蛾
（AY780527）、甘蓝夜蛾（AB748456）的一致性分别
为 91%、91%、75% 和 73%（图 5）；聚类分析表明
苜蓿夜蛾 PTTH 与夜蛾科昆虫 PTTH 亲缘性相对较
近，与非夜蛾科的鳞翅目昆虫的亲缘关系相对较远。
苜蓿夜蛾与烟蚜夜蛾同源性最高，其在分类学上属
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期148
于同一个属 Heliothis ；而谷实夜蛾、棉铃虫和烟实
夜蛾所在属 Helicoverpa 与苜蓿夜蛾所在属 Heliothis
是近缘属，所以苜蓿夜蛾 PTTH 与这 3 个昆虫 PTTH
的同源性相对较高（图 6）。
21
Helicoverpa armigera AY286543 1 KRKNYVVRLARDSEILGKPGNVG-TNYDTDSFQLEPANPDELSAFIVDYANMIRNDVILL
Helicoverpa assulta AY780526 1 KRKNYVVRLARDSEILGKPGNVG-TNYDTDSFQLEPANPDELSAFIVDYANMIRNDVILL
Helicoverpa zea AY172670 1 KRKNYVVRLARDSEILGKPGNVG-TNYDTDSFQLEPANPDELSAFIVDYANMIRNDVILL
Heliothis virescens AY172671 1 KRKNYVVRLARDSEILDKPGNVG-TNYDTDSFQVEPANPEELSAFIVDYANMIRNDVILL
Heliothis viriplaca JF731347 1 KRKNYVVRLARDSEILGKPGNVG-TNYDTDSLQLEPANPEELSAFIVDYANMIRNDVILL
Spodoptera exigua AY628763 1 KRKNYVVRLARDGEILGNSGNLG-TNYDTDSFQPDPTNPEELSAFIVDYANMIRNDVILL
Mamestra brassicae AB748456 1 KRKNYVVRLARDSEILGNSANLA-TNYDTDSIQPDPANPEELSAFIVDYANMIRNDVVLL
Bombyx mori NM-001043884 1 KSHNYMMKRARN-DVLGDKENVRPNPYYTEPFDPD-TSPEELSALIVDYANMIRNDVILL
Manduca sexta AY007724 1 KKQNYLLHRNKN-SFR-DKDNFG-LMYKTEPFEPD-ANPEELSAFIVDYANMIRNDVILL
Hyalophora cecropia AF288695 1 KRHNYVLQKPRNNDMLRNKNNYD-LMYNMESFDLD-SNPEEFSNLLMDYDNMKKNDVILL
Antheraea yamamai AY461435 1 KKHNYMFQRDRNNDILRNKNN-G-LMYDMESLEID-SIPEDYSNLVMDYANMKKNDVFLL
Antheraea pernyi U62535 1 KKHNYMFQRDRNNDILRNKNN-G-LMYDMESLEID-SSPEDYSNLVMDYANMKKNDVFLL
consensus 1 *..**.............*.......*...........*...*....**.**..***.**
3
Helicoverpa armigera AY286543 60 DKSVETRTRKRGNIKVEKYNNQALPDPPCACKFSPNRTDLGENTYPRYIETRNCSQARQQ
Helicoverpa assulta AY780526 60 DKSVETRTRKRGNIKVEKYNNQALPDPPCACKFSPNRTDLGENTYPRYIETRNCSQARQQ
Helicoverpa zea AY172670 60 DKSVETRTRKRGNIKVEKYNNQALPDPPCACKFSPNRTDLGENTYPRYIETRNCSQARQQ
Heliothis virescens AY172671 60 DKSVETRTRKRGNIKVEKYNNQALPDPPCACKSSPNRTDLGENTYPRYVETRNCSQARQQ
Heliothis viriplaca JF731347 60 DKSVETRTRKRGNIKVEKYNNQALPDPPCACKFSPTRTDLGENAYPRYVETRNCSQARQQ
Spodoptera exigua AY628763 60 DKSVETRTRKRGNIQVKKYNNQALPDPPCTCNFSRAIEDFGENTYPRFVETGNCSQARQL
Mamestra brassicae AB748456 60 DKSVETRTRKRGNIKVGKHHNQAIPDPSCACNPNKTFQNWDENTFPQRVDIYTCS---KQ
Bombyx mori NM-001043884 59 DNSVETRTRKRGNIQVEN---QAIPDPPCTCKYKKEIEDLGENSVPRFIETRNCNKTQQP
Manduca sexta AY007724 57 DNSVETRTRKRGNIKVEEY-NQAIPDPPCSCEYKKGFINLGENVFPSNIETINCSTNQQQ
Hyalophora cecropia AF288695 59 DNSIETRTRKRGDIRREKH-NQAIQDPPCTCGYTQTLLDFGKNAFPRHVVTRNCSDLQQS
Antheraea yamamai AY461435 58 DNSIETRTRKRGNIKR-----QNIPDPPCSCEYTNETVDFGENAFPRHVESRNCSELRQS
Antheraea pernyi U62535 58 DNSIETRTRKRGNIKR-----QNIPDPPCSCEYTNETVDFGENAFPRHVESRNCSELRQS
consensus 61 *.*.********.*.......*...**.*.*...........*..*.......*......
4 5 6 7
Helicoverpa armigera AY286543 120 SCRPPYVCRENYYNITIIRRKEFQNQATLEDIPHDLKFRWVAENYPVSVGCVCTRDYYAT
Helicoverpa assulta AY780526 120 SCRPPYVCRENYYNITIIRRKEFQNQATLEDIPHDLKFRWVAENYPVSVGCVCTRDYYAT
Helicoverpa zea AY172670 120 SCRPPYVCRENYYNITIIRRKEFQNQATLEDIPHDLEFRWVAENYPVSVGCVCTRDYYAT
Heliothis virescens AY172671 120 SCRLPYVCRENYYNITIIRRKEFQNQATLDDMPHDLKFRWIAEYYPVSVGCVCTRDYYAT
Heliothis viriplaca JF731347 120 SCRLPYVCRENYYNITIIRRKEFQNQATLDDIPHDLKFRWIAEYYPVSVGCVCTRDYYAT
Spodoptera exigua AY628763 120 ACHRPYVCRENYYNLTVLKRREYQHQISSIDLPSDLKFRWIAEYRPVSVGCVCTRDYYDI
Mamestra brassicae AB748456 117 SCPWPYQCMENIYNLTVIKKKEVPHQYSQVILPAELQRKWVGEYRPISVGCVCARDYYGT
Bombyx mori NM-001043884 116 TCRPPYICKESLYSITILKRRETKSQES-LEIPNELKYRWVAESHPVSVACLCTRDYQLR
Manduca sexta AY007724 116 SCPPPYICKESIYEIKILRKRKSMAEKS-LARPTDLEIGWVAESLPISVGCICTRDYVI-
Hyalophora cecropia AF288695 118 -CLFPYVCKETLYDVNILKRRESATQIS-EEVPRELKFRWIGEKWQISVGCMCTRDYRNT
Antheraea yamamai AY461435 113 SCLFPYVCKETLYDISVLKRRQSTTQPS-EKVPNELKFRWIAEKWQISVGCVCTRDYRDT
Antheraea pernyi U62535 113 SCLFPYVCKETLYDISVLKRRQSTTQPS-EKVPNELKFRWIAEKWQISVGCVCTRDYRDT
consensus 121 .*. **.*.*..*................*..*......*..*.....**.*..*..***
Helicoverpa armigera AY286543 180 EK-----------------
Helicoverpa assulta AY780526 180 EK-----------------
Helicoverpa zea AY172670 180 EK-----------------
Heliothis virescens AY172671 180 EK-----------------
Heliothis viriplaca JF731347 180 ET-----------------
Spodoptera exigua AY628763 180 EN-----------------
Mamestra brassicae AB748456 177 AN-----------------
Bombyx mori NM-001043884 175 YNNN---------------
Manduca sexta AY007724 --- -------------------
Hyalophora cecropia AF288695 176 TEDYQPRLLTKIVQQRDLS
Antheraea yamamai AY461435 172 INQD---------------
Antheraea pernyi U62535 172 INQD---------------
consensus 181 .
黑色、灰色及白色背景颜色表示不同的氨基酸相似度 ；7 个保守的半胱氨酸用数字 1-7 标明
图 5 不同昆虫 PTTH 氨基酸序列的多重比对
2.4 PTTH基因的原核表达分析
原 核 表 达 结 果（ 图 7） 表 明， 含 非 重 组 载 体
pET21b 的 BL21 经诱导后未检测到目的条带，而含
目的基因的重组载体 pET21b-PTTH 的 BL21 经 IPTG
诱导后，在 26.3 kD 左右出现特异性蛋白表达条带，
与预测的蛋白质分子量接近。利用 Ni-NTA 亲和层
析柱纯化蛋白，从图 7 中 5、6 泳道可以看出，用咪
唑缓冲液可以把目的蛋白洗脱出来，证明获得较高
纯度的重组蛋白。
3 讨论
本试验克隆得到一条苜蓿夜蛾促前胸腺激素的
cDNA 序列，通过与其他昆虫 PTTH 基因进行同源性
2014年第10期 149周夏等：苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的克隆与原核表达
比较，可以明显看出苜蓿夜蛾 PTTH 基因与鳞翅目
4 个夜蛾科昆虫烟蚜夜蛾、棉铃虫、烟实夜蛾和谷
实夜蛾的同源性较高，而与家蚕、柞蚕、惜古比天
蛾和日本柞蚕同源性较低。事实上，苜蓿夜蛾与烟
芽夜蛾在分类学上属于同一个属 Heliothis，所以同
源性最高 ；而苜蓿夜蛾所在属 Heliothis 与谷实夜蛾、
棉铃虫和烟实夜蛾所在属 Helicoverpa 是近缘属，所
以苜蓿夜蛾 PTTH 与这 3 个昆虫 PTTH 的同源性相
对较高 ；苜蓿夜蛾与甜菜夜蛾、甘蓝夜蛾虽然同属
夜蛾科，但所在属是非近缘属，所以同源性相对较低；
同理苜蓿夜蛾与其他鳞翅目非夜蛾科昆虫 PTTH 同
源性更低。
构建的原核表达载体 pET21b-PTTH 在 37℃诱
导表达，经 SDS-PAGE 分离，在大肠杆菌中高效表
达出融合蛋白，但为包涵体蛋白。该表达系统能否
表达出可溶性蛋白可通过进一步的条件优化进行探
讨或者利用其他真核表达系统进行研究。表达蛋白
的获得为下一步制备单克隆抗体及其生理功能研究
奠定基础。
Xu 等［16］在分析甜菜夜蛾 PTTH mRNA 不同时
期表达量发现，mRNA 在幼虫期有一定的表达，并
且在龄末升高 ；在化蛹初期有高表达，蛹中期维持
在一定的表达水平，蛹末期则不断增加，羽化前达
到较高的表达水平 ；甜菜夜蛾幼虫期和蛹期的 PTTH
含量变化和蜕皮变态的周期是完全一致的，显示出
PTTH 在甜菜夜蛾行使其生物学功能很可能也是通
过刺激前胸腺合成和分泌蜕皮激素来完成的。本研
究后续工作将围绕 PTTH 调节机制展开，明确不同
发育阶段、不同时间、不同光周期对苜蓿夜蛾 PTTH
及蜕皮激素表达量的变化，进而研究两者之间的关
系。同时可通过 RNAi 技术手段研究苜蓿夜蛾 PTTH
的合成与释放，设计相应的药物分子控制害虫的生
长发育，通过分子生物学手段以达到高效、绿色控
制苜蓿夜蛾的目的。
4 结论
获得苜蓿夜蛾 PTTH cDNA 全长，序列含有 823
个碱基，包括一个 681 个碱基的开放阅读框，编码
一个含 226 个氨基酸的蛋白，分子量约为 26.3 kD，
等电点为 8.51。GenBank 登录号 JF731347。同源序
列比对发现，苜蓿夜蛾 PTTH 氨基酸序列与其他昆
虫高度同源。构建了原核表达载体 pET21b-PTTH，
在大肠杆菌（BL21）中成功表达并获得了纯化的目
的蛋白。
参 考 文 献
［1］ Denlinger DL. Hormonal control of diapause［M］//Kerkut GA,
Antheraea pemyi PTTH U62535
Hyalophora cecropia PTTH AF288695
Bombyx mori PTTH NM_001043884
Manduca sexta PTTH AY007724
Mamestra brassicae PTTH AB748456
Spodoptera exigua PTTH AY628763
Heliothis viriplaca PTTH JF731347
Heliothis virescens PTTH AY172671
Helicoverpa zea PTTH AY172670
Helicoverpa assulta PTTH AY780526
Helicoverpa armigera PTTH AY28654363
100
100
100
100
100
54
68
70
0.05
Antheraea yamamai PTTH AY461435
各 PTTH 基因来源及 GenBank 登录号与图 2 相同
图 6 利用邻接法构建的鳞翅目不同种类昆虫的 PTTH 基因系统进化树
40
kD
M 1 2 3 4 5 6
PTTH30
25
14
M ：标准蛋白质 ；1，2 ：含非重组载体 pET21b 的 BL21 ；3，4 ：含目的基因
的重组载体的 BL21 ；5，6 ：纯化后的蛋白
图 7 苜蓿夜蛾 PTTH SDS-PAGE 电泳结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期150
Gilbert LI（Eds）. Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry
and Pharmacology, 1985, 8 ：353-412.
［2］Gilbert LI, Rybczynski R, Warren JT. Control and biochemical
nature of the ecdysteroidogenic pathway［J］. Annual Review of
Entomology, 2002, 47（1）：883-916.
［3］Wei ZJ, Zhang QR, Kang L, et al. Molecular characterization and
expression of prothoracicotropic hormone during development and
pupal diapause in the cotton bollworm, Helicoverpa armigera［J］.
Journal of Insect Physiology, 2005, 51（6）：691-700.
［4］Kopeć S. Studies on the necessity of the brain for the inception of
insect metamorphosis［J］. The Biological Bulletin, 1922, 42（6）：
323-342.
［5］Bickmeyer U, Rössler W, Wiegand H. Calcium channel currents in
cultured pars intercerebralis neurosecretory cells of adult Locusta
migratoria［J］. Journal of Experimental Biology, 1994, 197（1）：
393-398.
［6］Williams CM. Physiology of insect diapause. II. Interaction between
the pupal brain and prothoracic glands in the metamorphosis of the
giant silkworm, Platysamia cecropia［J］. Biological Bulletin, 1947
（2）：89-98.
［7］于淼 , 陈复生 , 魏兆军 . 家蚕神经肽促前胸腺激素基因 mRNA
的发育表达［J］. 安徽农业科学 , 2012, 38（10）：5518-5520.
［8］ Rewitz KF, Yamanaka N, Gilbert LI, et al. The insect neuropeptide
PTTH activates receptor tyrosine kinase torso to initiate metamorph-
osis［J］. Science, 2009, 326（5958）：1403-1405.
［9］Nagata S, Namiki T, Ko R, et al. A novel type of receptor cDNA
from the prothoracic glands of the silkworm, Bombyx mori［J］.
Bioscience, Biotechnology, Biochemistry, 2006, 70（2）：554-558.
［10］Wang Q, Mohamed AAM, Takeda M. Serotonin receptor B may Lock
the Gate of PTTH Release/Synthesis in the Chinese Silk Moth, Ant-
heraea pernyi ；A Diapause Initiation/Maintenance Mechanism?
［J］. PloS One, 2013, 8（11）：e79381.
［11］ Mizoguchi A, Ohsumi S, Kobayashi K, et al. Prothoracicotropic
hormone acts as a neuroendocrine switch between pupal diapause
and adult development［J］. PloS One, 2013, 8（4）：e60824.
［12］Kawakami A, Kataoka H, Oka T, et al. Molecular cloning of the
Bombyx mori prothoracicotropic hormone［J］. Science, 1990, 247
（4948）：1333-1335.
［13］ Shizaki H, Suzuki A. The brain secretory peptides that control
moulting and metamorphosis of the silk-moth［J］. Biology, 1994,
38（2）：301-310.
［14］ Xu WH, Denlinger DL. Molecular characterization of prothoracico-
tropic hormone and diapause hormone in Heliothis virescens during
diapause, and a new role for diapause hormone［J］. Insect mole-
cular biology, 2003, 12（5）：509-516.
［15］Xu WH, Rinehart JP, Denlinger DL. Structural characterization
and expression analysis of prothoracicotropic hormone in the corn
earworm, Helicoverpa zea［J］. Peptides, 2003, 24（9）：1319-
1325.
［16］ Xu J, Su JY, Shen JL, et al. Molecular characterization and develop-
mental expression of the gene encoding the prothoracicotropic hor-
mone in the beet armyworm, Spodoptera exigua［J］. Science in
China Series C ：Life Sciences, 2007, 50（4）：466-472.
［17］ Shionoya M, Matsubayashi H, Asahina M, et al. Molecular cloning
of the prothoracicotropic hormone from the tobacco hornworm
Manduca sexta［J］. Insect Biochemistry and Molecular Biology,
2003, 33（8）：795-801.
［18］ Sehnal F, Hansen I, Scheller K. The cDNA-structure of the
prothoracicotropic hormone（PTTH）of the silkmoth Hyalophora
cecropia［J］. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2002,
32（2）：233-237.
［19］ Sauman I, Reppert SM. Molecular characterization of prothoracicot-
ropic hormone（PTTH）from the giant silkmoth Antheraea pernyi：
Developmental appearance of PTTH-expressing cells and relatio-
nship to circadian clock cells in central brain［J］. Developmental
Biology, 1996, 178（2）：418-429.

（责任编辑 马鑫）