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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
日本蟾蜍聚集素 cDNA 的克隆与序列分析
袁进强  徐跃  杨仙玉  诸葛慧  张姝芳
（浙江农林大学林业与生物技术学院，临安 311300）
摘 要 ： 为研究蟾酥、蟾衣、蟾皮中多肽类有效成分，通过菌落 PCR 对日本蟾蜍（Bufo japonicus formosus）皮肤 cDNA 质粒
文库进行了筛选，获得了聚集素（clusterin，CLU）全长 cDNA 序列（GenBank 登录号为 JX035891）并对其进行了生物信息学分析。
日本蟾蜍 clu cDNA 全长为 1 616 bp，包括 1 332 bp 的开放阅读框（open reading frame，ORF）、5 端 30 bp 及 3 端 254 bp 的非翻译
区（untranslated region，UTR）。根据 cDNA 序列推导的日本蟾蜍 CLU 前体蛋白由 443 个氨基酸残基组成，其中含 20 个氨基酸残基
组成的信号肽，6 个糖基化位点，10 个可形成二硫键的半胱氨酸残基和 2 个卷曲螺旋区域。氨基酸序列同源性分析显示，日本蟾
蜍 CLU 与非洲爪蟾（Xenopus laevis）的同源性为 65%，与其他 7 种动物的同源性则介于 41%-48% 之间。
关键词 ： 日本蟾蜍 聚集素 基因克隆 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Clusterin cDNA of
Bufo japonicus formosus
Yuan Jinqiang Xu Yue Yang Xianyu Zhuge Hui Zhang Shufang
（School of Forestry and Biotechnology，Zhejiang Agriculture and Forestry University，Lin’an 311300）
Abstract:  To study the polypeptide effective components included in Venenum Bufonis, the plasmid cDNA library of adult Japanese
toad Bufo japonicus formosus skin was screened. As the result, the clusterin cDNA was obtained（GenBank accession number ：JX035891）.
The transcript is 1 616 bp in length containing 30 bp 5, 254 bp 3 untranslated region（UTR）and an open reading frame（ORF）of 1 332
bp encoding a polypeptide of 443 amino acids. There is a signal peptide consisted of 20 amino acid residues, six N-glycosylation sites, ten
cysteine residues for disulfide bond and two coiled-coil domains in the putative gene product. The homologous analysis indicates the similarity
of B. japonicus formosus with Xenopus laevis was 65%, and 41%-48% with other species. The functional characteristics of CLU of B. japonicus
formosus seem to be similar as that of human.
Key words:  Bufo japonicus formosus Clusterin Gene cloning Sequence analysis
聚集素（clusterin，CLU）也称载脂蛋白 J，前
列腺抑制性睾酮信号 -2 或硫酸化糖蛋白 -2，因其
具有聚集细胞的功能而被命名为聚集素［1］。它在
人体所有组织中都有表达［2］，参与细胞聚集［1］、
脂 质 运 输［3］、 细 胞 凋 亡［4］、 蛋 白 清 理［5］ 和 补 体
调 节［6］ 等 多 种 生 理 过 程。 在 人 类 多 种 恶 性 肿 瘤
中 clu 基因表达上调，并且与肿瘤发生和转移有密
切联系［2］。因此，成为近年来肿瘤治疗的新靶点
之一［7-9］。
收稿日期 ：2012-06-13
基金项目 ：国家自然科学基金项目 (31071181)，2011 年度浙江省科技创新活动计划项目 (2011R412042)
作者简介 ：袁进强，男，硕士研究生，研究方向 ：野生动物资源保护与利用 ; E-mail: kk154home@163.com
通讯作者 ：杨仙玉，女，教授，研究方向 ：野生动物资源保护与利用 ; E-mail: xianyu_yang@hotmail.com
鉴于蟾酥、蟾衣、蟾皮等中药材广泛应用于临
床抗肿瘤治疗［10-12］，本研究室开展以日本蟾蜍（Bufo
japonicus formosus）皮肤 cDNA 质粒文库为模板，通
过菌落 PCR 筛选具有完整开放阅读框（open reading
frame，ORF）的全长 cDNA 的工作。本研究筛选到
日本蟾蜍 clu 全长 cDNA 序列，并运用多种软件对其
编码的蛋白质进行生物信息学分析，构建系统进化
树，旨在为进一步研究日本蟾蜍 CLU 蛋白生物学功
能及其药物研发奠定基础。
2013年第1期 157袁进强等 ：日本蟾蜍聚集素 cDNA 的克隆与序列分析
1 材料与方法
1.1 材料
日本蟾蜍皮肤 cDNA 质粒文库通过材料转让
协议。日本产业技术总合研究所（AIST，Tsukuba，
Japan）授权浙江农林大学使用（作者杨仙玉在日本
AIST 博士后工作期间制备）。该文库使用的载体为
pSD64TR，上下游克隆位点分别为 EcoR I 和 Xho I，
载体上、下游引物为 SP6（5-ATTTAGGTGACACTA-
TAGAA-3）和 S.D.A.（5-TTATGTAGCTTAGAGACT-
C-3），cDNA 的长度介于 500-2 000 bp 之间。
大肠埃希菌（E.coli）感受态细胞 DH5α、PCR
反应试剂盒、2×PCR Master Mix 等购自天根生化科
技有限公司，DNA Ladder、质粒小量抽提试剂盒购
自碧云天生物技术研究所。引物合成与 DNA 测序委
托上海生工生物技术有限公司或上海桑尼生物科技
有限公司。
1.2 方法
1.2.1 日本蟾蜍皮肤 cDNA 质粒文库转化 将 cDNA
质粒文库 0.2 μL 电击转化到 E. coli DH5α 感受态细
胞中（40 μL），然后迅速加入 37℃预热的 160 μL LB
培养液，37℃恒温振荡复苏 45 min，取 2 μL 转化
液均匀涂布于 LB 平板（含 Amp 100 μg/mL），并在
37℃恒温培养 12-15 h。
1.2.2 全长 cDNA 筛选 从平板上随机挑取单菌落
接种于 10 μL 的 LB 液体培养基中，以此菌液为模板
实施菌落 PCR。使用的引物是载体上游引物 SP6 和
自行设计的含 ploy（T）的 cDNA 下游引物（5-AGA-
TCTCTCGAGTTTTTTTTTTTT-3）。反应体系如下 ：菌
液 0.5 μL，2×PCR Master Mix 5 μL，SP6 和 ploy（T）
引物（2 pmol/μL）各 1 μL，补加灭菌超纯水至 10
μL，在反应体系中补加矿物油 10 μL。反应条件为 ：
94℃ 5 min ； 94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 120 s，30
循环 ； 72℃ 8 min，4℃保存。PCR 结束后，取 5 μL
PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析，将扩增出介
于 500-2 000 bp 之间的 PCR 产物的菌落确定为阳性。
1.2.3 质粒回收、DNA 测序与序列分析 将通过菌
落 PCR 确定为阳性克隆的菌液 0.2 μL 接种于 3.5 mL
LB 培养液中（含 Amp 100 μg/mL），37℃恒温振荡培
养 12-15 h，然后使用试剂盒进行质粒回收并对其进
行 EcoR I 和 Xho I 双酶切鉴定，进一步确定阳性克
隆及质粒浓度。首先委托公司将阳性克隆质粒使用
载体上游引物（SP6）对 cDNA 进行正向测序。测序
结果利用 DNAstar 查找 cDNA 的开放阅读框（open
reading frame，ORF），推导氨基酸序列，对具有合
理开放阅读框的克隆继续委托公司使用载体下游引
物（S.D.A.）进行反向测序。
1.2.4 序 列 分 析 利 用 DNAstar 寻 找 ORF， 推 导
其编码蛋白的氨基酸序列并分析其理化性质，运用
SMART（http ：//smart.embl-heidelberg.de/）预测其结
构功能域，运用 CBS 的 SignalP 4.0（http ：//www.cbs.
dtu.dk/services/SignalP/） 预 测 信 号 肽， 运 用 CBS 的
NetNGlyc（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）
预 测 Asn-X-Ser/Thr 糖 基 化 位 点， 运 用 METAL
DETECTOR V2.0（http ：//cassandra.dsi.unifi.it/）预测
二硫键位点，运用 NPS 的 GOR4（http ：//npsa-pbil.
ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）
预测二级结构，运用 ExPASy 的 COIL（http ：//www.
ch.embnet.org/software/COILS_form.html）预测卷曲螺
旋结构，运用 ClustalX 2.0 和 MEGA 4.1 软件进行同
源性分析，构建系统进化树。
2 结果
2.1 cDNA的筛选
将日本蟾蜍皮肤 cDNA 质粒文库转化 E.coli 感受
态细胞 DH5α 获得的菌落，以 SP6 和 ploy（T）为引
物，实施菌落 PCR。PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电
泳分析显示，有一菌落 PCR 产物大小在 1 600 bp 左
右（图 1-A）。将此菌液进行扩大培养、质粒回收及
其 EcoR I 和 Xho I 双酶切和 1% 琼脂糖凝胶电泳，结
果显示该质粒含有 1 600 bp 左右的 cDNA（图 1-B）。
将此质粒委托 DNA 测序公司进行了正、反双向测序。
2.2 序列分析
2.2.1 测序结果分析及其编码蛋白的理化性质 对测
序结果校对并分析确定已克隆的 cDNA 其全长 1 616
bp，具有 1 332 bp 的完整 ORF、5 端 30 bp 和 3 端
254 bp 的非编码区（untranslated region，UTR），编
码由 443 个氨基酸残基组成的蛋白质。根据推导的
氨基酸序列在 GenBank blast 同源性分析表明，与其
他物种的聚集素具有同源性，故将该 cDNA 克隆定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期158
为日本蟾蜍 clu 全长 cDNA（图 2）（GenBank 登录号
为 JX035891）。日本蟾蜍 clu 的 ORF 推导的氨基酸
序列中，正电荷氨基酸残基（K，R）为 55 个，负
电荷氨基酸残基（D，E）为 69 个，疏水性氨基酸（A，
I，L，F，W，V）为 141 个，极性氨基酸残基（N、C、Q、
S、Y）为 123 个，分子量约为 50.627 kD，pI 理论值
为 5.13。
2.2.2 结构预测 SMART 预测日本蟾蜍 CLU 蛋白
由两条多肽链组成，这两条多肽链分别与构成聚集
素的 Cla、Clb 家族同源 ；SignalP4.0 预测该前体蛋
白含有 20 个氨基酸残基的信号肽（图 2），信号肽
裂解位点在 20 和 21 氨基酸残基之间，故推测克隆
的日本蟾蜍 clu cDNA 编码分泌蛋白。NetNGlyc 预
M ：DNA Ladder ；1 ：菌落 PCR 产物 ；2 ：重组
质粒 EcoR Ⅰ和 Xho I 双酶切产物
图 1 pSD64TR-CLU 菌落 PCR 产物（A）和重组质粒
EcoR Ⅰ和 Xho I 双酶切（B）产物的琼脂糖凝胶电泳
图 2 日本蟾蜍 CLU 的 cDNA 序列和其推到的氨基酸序列
2000
1500
1600
bp bp
M 1
2000
1500 1600
bp bp
M 2
A B
单下划线部分为信号肽序列 ；方框部分为 N- 糖基化位点 ；双划线部分为二硫键位点 ；* 为终止密码子
90
20
180
50
270
80
360
110
450
140
540
170
630
200
720
230
810
260
900
290
990
320
1080
350
1170
380
1260
410
1350
440
1440
443
1530
1616

2013年第1期 159袁进强等 ：日本蟾蜍聚集素 cDNA 的克隆与序列分析
测 蛋 白 中 Asn-X-Ser/Thr 糖 基 化 位 点， 发 现 存 在 6
个 天 冬 酰 胺 糖 基 化 位 点，Asp-99、Asp-141、Asp-
273、Asp-350、Asp-370 和 Asp-415（表 1）。METAL
DETECTOR 预测蛋白二硫键位点，发现存在可形
成二硫键的 10 个半胱氨酸残基，Cys-98、Cys-109、
Cys-112、Cys-117、Cys-125、Cys-281、Cys-291、
Cys-298、Cys-301 和 Cys-309（图 2）。GOR4 和 COIL
预测蛋白二级结构表明，日本蟾蜍 CLU 在其两端各
形成一个卷曲螺旋（48-97 aa 和 336-391 aa）（图 3）。
ens，NP_001822）7 种动物的同源性在 41%-48% 之
间。在 ClustalX 软件中对蟾蜍与 8 个物种的 CLU 蛋
白氨基酸序列进行比对（图 4），发现各物种均含有
信号肽序列，但其氨基酸组成和数量有所不同 ；可
形成二硫键 10 个半胱氨酸残基在不同物种之间完全
保守 ；与人 CLU 序列比对，发现在 C 端卷曲螺旋中
的 357 位为 Val，其他物种为 Leu，358 位的 Leu 物
种之间完全保守，除斑马鱼的 361 位上为 Phe 外，
其他物种都为 Leu ；预测 N-糖基化位点中 Asp-99、
Asp-141、Asp-350 和 Asp-370 与其他物种完全保守，
而 Asp-273 和 Asp-415 不存在保守性，表明 CLU 存
在种属差异。
通过 MEGA 4.1 软件邻接法构建氨基酸序列系
统进化树（图 5），发现日本蟾蜍与同属两栖类的非
洲爪蟾处于一个分支内，与鱼类汇于一个分支。两
种鸟类动物与爬行动物汇于一支。哺乳类最低等的
鸭嘴兽与其他哺乳动物汇于一支，但与胎生哺乳动
物人和鼠存在一定的差异。整个进化树表明 CLU 的
进化史遵循传统动物进化规律。
3 讨论
本 试 验 成 功 克 隆 到 日 本 蟾 蜍 聚 集 素 的 全 长
cDNA，并对该 cDNA 和其编码蛋白的氨基酸序列进
行了生物信息学分析。SignalP 分析该前体蛋白存在
信号肽，暗示日本蟾蜍 clu cDNA 编码蛋白为分泌蛋
白。结构预测显示日本蟾蜍 CLU 成熟蛋白是由两条
多肽链组成［9，13，14］，含有两个卷曲螺旋结构域（48-
97 aa 和 336-391 aa），与人 CLU 相似。在其 C 端卷
曲螺旋中 Val-3578、Leu-358 和 Leu-361 有 3 个疏水
性氨基酸残基，其中后两个氨基酸不同物种间比较
保守，Val-357 在人类则是 Leu-357。此外，日本蟾
蜍 CLU 成熟蛋白中有 10 个半胱氨酸残基可形成 5
对二硫键，存在 6 个潜在的糖基化位点，这些特征
在包括人的其他 8 种动物的 CLU 中完全保守［16-18］。
已有研究表明，人类分泌型 CLU 具有抑制线粒
体介导的细胞凋亡、保护细胞的功能［19，20］，但其作
用机制还不十分清楚。目前，在 RNA 水平上抑制分
泌型 CLU 表达，或使用寡核苷酸药物 OGX-011 干
扰分泌型 CLU 表达均能增强化学药物对肿瘤细胞的
杀伤力和降低肿瘤细胞的耐药性，显示出良好的临
位点 相关序列 可能值 支持率 N-糖基化结果 *
99 NDTV 0.6096 （8/9） +
141 NRSS 0.6821 （9/9） ++
273 NLTD 0.7542 （9/9） +++
350 NATS 0.7307 （9/9） ++
370 NLTQ 0.6266 （8/9） +
415 NISI 0.6149 （8/9） +
图 3 NCOILS 分析日本蟾蜍 CLU 蛋白的卷曲螺旋
2.2.3 氨基酸序列同源性分析和系统进化树构建
日本蟾蜍 CLU 蛋白氨基酸序列在 NCBI 中同源性分
析发现，与非洲爪蟾（Xenopus laevis，NP_001080-
775.1）的同源性最高，达到 65%，与珠鸡（Numida
meleagris，AAW21812.1）、斑马鱼（Danio rerio，AA-
Q56181.1）、安乐蜥（Anolis carolinensis，XP_003229-
606.1）、鸭嘴兽（Ornithorhynchus anatin-us，XP_00-
1515556.2）、鹌鹑（Coturnix coturnix，CA-A33823.1）、
小鼠（Mus musculus，NP_038520.2）、人（Homo sapi-
表 1 日本蟾蜍 CLU 中 N-糖基化位点预测
* ：糖基化的期望 ；+ ：可能值> 0.5 且支持率为 8/9 ；++ ：0.5 <可能值< 0.75
且支持率为 9/9 ；+++ ：0.75 <可能值且支持率为 9/9
500
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
100 200 300 400 450350250150
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期160
单划线部分为信号肽 ； 双划线部分为二硫键位点 ；方框部分为 α 螺旋富集区
图 4 日本蟾蜍与其他物种的 CLU 蛋白氨基酸序列比对
床效果［7］。因此，抑制分泌型 CLU 对肿瘤细胞的保
护可能成为治疗肿瘤的新途径，CLU 可能成为肿瘤
治疗的新靶点。
4 结论
首次克隆到日本蟾蜍 clu 基因的全长 cDNA，该
基因编码的蛋白具有与人类同源蛋白相似的结构特
2013年第1期 161袁进强等 ：日本蟾蜍聚集素 cDNA 的克隆与序列分析
征。日本蟾蜍 CLU 与其他 8 个物种 CLU 的氨基酸
序列具有相似性。
参 考 文 献
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图 5 基于日本蟾蜍与其他 8 种动物 CLU 氨基酸序列
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（责任编辑 李楠）
ሿ啐Mus musculus
ӪHomo sapiens
呝౤ޭOrnithorhynchus anatinus
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⨐呑Numida meleagris
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