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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第11期
猪嵴病毒是一种单股正链无囊膜 RNA 病毒，属
于微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae），嵴病毒属，
具有 30 nm 直径的球形衣壳，基因组大小在 8 000
bp 左右，其基因组由 5 非编码区（5 untranslated
region，5 UTR）、3 非编码区（3 untranslated region，3
UTR）、Poly（A）尾巴和编码一个聚合蛋白的大的
开放阅读框（open reading frame，ORF）组成［1］，聚
收稿日期 ：2013-05-23
作者简介 ：王恩丽，女，硕士研究生，研究方向 ：动物免疫与抗病 ；E-mail ：enleathy@163.com
通讯作者 ：马小军，男，副教授，硕士生导师，研究方向 ：动物免疫与抗病、动物中毒与营养代谢病 ；E-mail ：maxj712@163.com
猪嵴病毒 441 株 3D 基因的克隆及序列分析
王恩丽1  兰喜2  刘伟2  杨彬2  柳纪省2  马小军1
（1. 甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070 ；2. 中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室
草食动物疫病重点开放实验室，兰州 730046）
摘 要 ： 根据 GenBank 中登录的猪嵴病毒（porcine kobuvirus，PKV）核苷酸序列设计引物，利用 RT-PCR 技术及 3 RACE
法扩增猪嵴病毒 441 株（swKoV CH441 株）3D 基因。成功扩增了 swKoV CH441 株的 3D 基因，3 非编码区（3 untranslated region，
3 UTR）及 Poly（A），扩增的基因片段长度分别为 1 064、1 046 和 592 bp，包括 3A、3B、3C、3D 基因序列，3 UTR 序列和一个
至少含有 29 个 Poly（A）的尾巴。序列分析结果表明，swKoV CH441 株 3D 基因全长 1 407 bp，编码 468 个氨基酸，分子质量约为
53 369.29 D，理论等电点为 6.12 ；3 UTR 位于终止密码子 TGA 之后，长 166 bp ；swKoV CH441 株与其他猪嵴病毒 3D 基因核苷酸
序列相似性在 92.2%-93.4%，氨基酸一致性为 97.9%-99.4%。遗传进化分析表明，swKoV CH441 株与国内株亲缘关系较近，与匈
牙利株亲缘关系较远。
关键词 ： swKoV CH441 株 RT-PCR 3RACE 3D 基因 序列分析
Molecular Cloning and Analysis of the 3D Region of
Porcine Kobuvirus 441
Wang Enli1 Lan Xi2 Liu Wei2 Yang Bin2 Liu Jixing2 Ma Xiaojun1
（1. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070 ；2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology/
Key Laboratory of Grazing Animal Diseases，Lanzhou Veterinary Research Institute，Chinese Academy of
Agricultural Sciences，Lanzhou 730046）
Abstract:  The special primers of porcine kobuvirus（PKV）were designed according to the sequence logged in GenBank. The 3D gene
was amplified by RT-PCR and 3 RACE. The sequence analysis showed that the amplified specific sequences were 1 064 bp, 1 046 bp and 592
bp in length respectively, including 3A，3B，3C，3D region, 3untranslated region（3 UTR）and at least a 29-poly（A）tail. The 3D region
was 1 407 bp in length, encoding 468 amino acid（aa）with a molecular weight of 53 369.29 D, pI of 6.12. The 3 UTR was 166 bp in length
after the terminator codon TGA. The aligning analysis showed that the 3D gene of swKoV CH441 shared high nucleotide acid and amino acid
identity with the other porcine kobuvirus strains sharing 92.2% to 93.4% and 97.9% to 99.4%, respectively. In the phylogenetic tree, swKoV
CH441 was closer with Chinese strains but further with Hungarian strains.
Key words:  swKoV CH441 RT-PCR 3RACE 3D gene Sequence analysis
合蛋白由 3 个结构蛋白（VP0、VP3、VP1）和 7 个
非 结 构 蛋 白（2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D） 组
成［2］。其中，微小核糖核酸病毒科 3D 蛋白是病毒
编码的 RNA 聚合酶，在病毒聚合酶复合物中发挥重
要作用，而且 3D 基因相对保守，国内已根据 3D 基
因建立了 RT-PCR 检测嵴病毒的方法并进行流行病
学调查［3-5］。猪嵴病毒最先由 Reuter 等［6］从匈牙利
2013年第11期 149王恩丽等 ：猪嵴病毒 441 株 3D 基因的克隆及序列分析
某猪场健康猪群的粪便样品中检测到，此后，先后
有多个亚洲国家［7-10］、巴西和荷兰［11］发现此病毒
并报道了该病毒的感染状况，表明在健康猪群和表
现腹泻症状的猪群的粪便或血清样品中均检测出较
高的阳性率。根据 Wang 等［5］在上海周边进行的流
行病学调查，猪嵴病毒的阳性率为 32.4%-46.7% ；
根据胡军勇等［4］进行的湖北省流行病学初步调查，
猪嵴病毒的阳性率为 57.45%，其中腹泻猪的嵴病毒
阳性率为 82.5%。由此可见，猪嵴病毒在国内外都
流行很广。目前对猪嵴病毒的致病机制、感染周期、
流行规律等方面了解非常有限，相关的研究报道也
比较少。本研究对猪嵴病毒 3D 基因进行核苷酸测
序和遗传进化分析，旨在从分子水平上明确我国甘
肃地区猪嵴病毒的分子结构特点，为深入研究其基
因组的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
swKoV CH441 株由采集的甘肃省武威市某猪场
猪粪便分离而来，其序列资料引自 GenBank。RN-
easy Mini Kit 试 剂 盒 购 自 QIAGEN 公 司 ；SMARTTM
RACE cDNA Amplification Kit User Manual 试 剂 盒 购
自 Clontech 公司 ；pGEM-T vector 购自 Promega 公司 ；
One Step RNA PCR Kit（AMV）试剂盒，大肠杆菌
JM109，限制性内切酶 Not Ⅰ，DL2000 Marker，DL-
5000 Marker，均购自宝生物工程有限公司（TaKaRa）；
DNA 凝胶回收试剂盒，质粒 DNA 小量试剂盒均购
自爱思进生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据 GenBank 发表的基因
序列 S-1-HUN（登录号：EU787450）设计引物（表 1），
由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。
表 1 引物名称、位置及序列
引物 位置 序列（5-3）
P1 5 686-5 704 CAGGGCTTGACCATTGAAG
6 728-6 749 ACAGCTGGTTGTTTCTTGACAG
P2 6 715-6 732 TTTGGTGCCTTCCCTGTC
7 739-7 760 GTGACGTCATAGATGGTGGAGT
GSP 7 647-7 664 ACCCATCCATCCGTCATT
1.2.2 总 RNA 的提取 采集的猪粪便，加入 PBS
（pH7.2）制成 30% 悬液，反复冻融 3 次，10 000 r/min
离心 10 min，吸取上清液，按 RNeasy Mini Kit 试剂
盒说明书操作，获得猪嵴病毒总 RNA。
1.2.3 基因的扩增 P1、P2 片段扩增采用 50 μL 反
应体系：23 μL One Step RNA PCR Kit（AMV），包括：
5 μL 10× One Step RNA PCR Buffer，10 μL MgCl2
（25 mmol/L），5 μL dNTP Mixture（10 mmol/L），1 μL
RNase Inhibitor（40 U/μL），1 μL AMV RTase XL（5
U/μL），1 μL AMV-Optimized Taq（5 U/μL）；上下游
引 物 各 1 μL ；RNA 5 μL ；RNase Free dH2O 21 μL。
反应程序 ：50℃反转录 50 min ；94℃预变性 2 min ；
94℃变性 30 s，52℃退火 40 s，72℃延伸 1.5 min，
循环 35 次 ；72℃延伸 10 min。3 端扩增按试剂盒说
明操作。PCR 产物经 10 g/L 凝胶电泳鉴定正确后按
照 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒说明书要求进行凝
胶回收。
1.2.4 基因克隆 将回收的目的条带产物与 pGEM-T
载体相连接，转化 JM109 感受态细胞，加入 X-gal
和 IPTG 后涂布含氨苄青霉素（100 μg/mL）的平板，
挑取白色菌落，接种含氨苄青霉素的 LB 培养液，
37℃，220 r/min 振摇过夜。
1.2.5 测序及序列分析 AxyPrep 质粒 DNA 小量试
剂盒提取质粒 DNA，进行质粒 PCR 鉴定及酶切鉴
定，将初步鉴定正确的质粒送生工生物工程（上海）
股份有限公司进行通用引物测序。用 Lasergene7.1 软
件包中的 SeqMan 对测序获得的两段序列进行剪切拼
接，经 MegAlign 软件分析 swKoV CH441 株 3D 基因
和 GenBank 中登录的猪嵴病毒 3D 基因进行核苷酸
相似性比较和遗传进化分析，用 Lasergene7.1 软件
包中的 Protean 软件及法国里昂 CNRS 的 SOPMA 软
件（http ：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?
page=npsa_sopma.html）对 3D 基因编码产物的氨基
酸组成及其理化性质进行分析预测［12］。
2 结果
2.1 swKoV CH441株3D及3端cDNA的体外扩增
以提取的总 RNA 为模板，通过 RT-PCR 技术，
扩增出大小分别为 1 064、1 046 和 592 bp 的特异性
目的条带，与预计大小相符，而且条带亮度较强，
说明扩增产物的量较大。并且无杂带，说明特异性
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期150
良好（图 1）。 病毒的相似性较低，分别为 70.5% 和 74.3%（图 3）。
从系统发育树（图 4）上可以看出，嵴病毒在遗传
进化上分为 3 大支，其中 swKoV CH441 株与猪源嵴
病毒亲缘关系较近，与 Aichi 病毒和牛嵴病毒亲缘
关系较远。
表 2 GenBank 中登录的 3D 基因序列
编号 序列名称 登录号 来源国家
1 S-1-HUN EU787450 匈牙利
2 CH/HNXX JX401523 中国
3 CH/HZ JX827598 中国
4 SH-W-CHN JN630514 中国
5 Y-1-CHI GU292559 中国
6 WUH1 JQ692069 中国
7 XX KC204684 中国
8 WB-1-HUN JX177612 匈牙利
9 K-30-HUN GQ249161 匈牙利
10 Aichi Virus AB010145 日本
11 Bovine kobuvirus NC004421 日本
2000
bp
M 1
1000
750
500
250
100
2000
bp
M 2
1000
750
500
250
100
2000
bp
3 M
1000
750
500
250
100
1 ：P1 片段 RT-PCR 产物 ；2 ：P2 片段 RT-PCR 产物 ；3 ：3 端 RT-PCR 产物 ；
M ：DL2000 DNA Marker
图 1 swKoV CH441 株 P1、P2 及 3 端基因目的片段的扩增
2.2 酶切鉴定
对 3 个片段分别挑取蓝白筛选后的白色菌落提
取质粒后用 Not Ⅰ进行酶切鉴定，分别得到与预期
大小一致的目的基因片段，表明目的片段已经连接
到 pGEM-T 克隆载体上（图 2）。
5000
bp
M 1
4000
3000
2000
1000
750
500
250
100
5000
bp
2 M
3000
1000
500
250
100
5000
bp
3 M
3000
1000
500
250
100
1 ：P1 段酶切产物 ；2 ：P2 段酶切产物 ；3 ：3 端酶切产物 ；
M ：DL5000 DNA Marker
图 2 swKoV CH441 株 P1、P2 及 3 端基因克隆阳性质粒
酶切鉴定
2.3 测序结果
所扩增 swKoV CH441 株目的基因序列分别为
1 064、1 046 和 592 bp，包括 3A-3D 基因，3 UTR
和 Poly（A）结构。其中 3D 基因 1 407 bp，3 UTR
为 166 bp，Poly（A）尾巴序列至少含有 29 个 A。
2.4 3D基因核苷酸序列分析与遗传进化分析
利 用 Lasergene7.1 软 件 包 中 的 MegAlign 软 件
将扩增的 swKoV CH441 株 3D 基因序列与 GenBank
登录的序列（表 2）进行比对，结果表明，swKoV
CH441 株 3D 基因与猪嵴病毒 3D 基因核苷酸相似性
较高，在 92.2%-93.4% 之间，与 Aichi 病毒和牛嵴
图 3 3D 基因核苷酸一致性比较
2.5 3D基因编码产物的理化性质分析
蛋白质的基本性质包括其相对分子质量、氨基
酸组成和等电点等。用 Protean 软件对 3D 基因编码
产物的理化性质进行预测，结果显示，3D 基因 CDs
编码 468 个氨基酸（图 5），其中含量最多的氨基酸
是亮氨酸（Leu），含量最低的是色氨酸（Trp），所
占比例分别为 8.76% 和 1.71%（图 6）；推测该编码
产物在 pH7.0 环境下其电荷量为 -7.00，理论等电点
为 6.12 ；其理论分子质量约为 53 369.29 D。
2.6 NGB编码产物的二级结构预测
使 用 SOPMA 软 件 对 swKoV CH441 株 3D 基 因
进行蛋白质二级结构预测，预测包含的结构元件有 α-
98.994.092.092.192.393.191.693.593.4 70.9 74.6
93.293.292.893.092.393.791.97.36.9 70.1 74.6
91.131.532.331.432.431.832.731.331.631.2 38.4
97.136.438.739.238.238.138.638.437.737.0 70.1
109876543
Percent Identity%
21 11 12
6.57.78.98.17.49.17.27.21.2 70.8 74.7
93.88.69.48.87.99.07.28.16.4 71.2 74.4
92.892.07.89.26.68.27.77.77.7 69.9 73.9
91.691.392.69.78.28.87.37.78.4 69.6 74.4
92.591.891.591.08.38.48.38.48.3 70.2 73.8
93.092.693.792.392.38.26.77.07.3 70.2 74.2
91.591.792.491.892.292.38.78.29.0 70.0 73.7
98.294.592.892.792.293.492.393.27.0
1
3
12
11
10
9
D
iv
er
ge
nc
e
8
7
6
5
4
2 70.5 74.3
S-1-HUN.seq
swKoV CH441.seq
CH HNXX-4.seq
CH HZ.seq
SH-W-CHN.seq
Y-1-CHI.seq
WUH1.seq
XX.seq
WB-1-HUN.seq
K-30-HUN.seq
Aichi Virus.seq
Bovine kobuvirus.seq
2013年第11期 151王恩丽等 ：猪嵴病毒 441 株 3D 基因的克隆及序列分析
螺旋，β-转角，延伸链和无规则卷曲，所占比例分
别为 39.96%、4.49%、12.39% 和 43.16%；由此推断，
α-螺旋是 swKoV CH441 株 3D 基因中最大量的蛋白
质二级结构，β-转角，延伸链和无规则卷曲散布于
其整个蛋白质中。
3 讨论
嵴病毒属目前有两个公认的种 ：人爱知病毒
（Aichi virus，AiV） 和 牛 嵴 病 毒（Bovine kobuvirus，
BKV）。猪嵴病毒被认为是目前新发现的一个候选种，
该病毒首先于 2007 年在匈牙利被发现，主要引起猪
的腹泻。我国也在同期发现并报道了该病毒，但对
18
19.6
16 14 12
Nucleotide Substitutions100×10 8 6 4 2 0
S-1-HUN.seq
swKoV CH441.seq
CH HNXX-4.seq
CH HZ.seq
SH-W-CHN.seq
porcine kobuvirus
Y-1-CHI.seq
WUH1.seq
XX.seq
WB-1-HUN.seq
K-30-HUN.seq
Aichi Virus.seq
Bovine kobuvirus.seq
图 4 3D 基因核苷酸序列系统发育树
90
180
270
360
450
540
630
720
810
900
990
1080
1170
1260
1350
1407
图 5 swKoV CH441 株 3D 基因序列及编码的氨基酸序列
图 6 swKoV CH441 株 3D 基因 CDs 序列的氨基酸组成
Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr
0
2
4
6
8
10
ਜ਼䟿
%
≘ส䞨⿽㊫
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期152
该病毒在我国不同地区的流行状况和基因型尚不清
楚。目前，国外对微小核糖核酸病毒科的脊髓灰质
炎病毒 RNA 复制酶的蛋白空间结构和生物化学特征
进行了研究［13］，但关于嵴病毒的研究则较少。因此，
本 研 究 通 过 RT-PCR 技 术 结 合 3 RACE 法， 得 到
了 swKoV CH441 株基因组 3D 基因序列并对其进行
生物信息学分析。核苷酸相似性分析表明，swKoV
CH441 株 与 其 他 猪 源 嵴 病 毒 3D 基 因 核 苷 酸 序 列
相 似 性 在 92.2%-93.4%， 氨 基 酸 一 致 性 为 97.9%-
99.4% ；氨基酸序列的一致性明显高于核苷酸序列的
一致性，说明核苷酸的突变为沉默突变，这对作为
RNA 依赖的 RNA 聚合酶发挥其正常复制功能极为
重要。遗传进化分析表明，swKoV CH441 株与国内
株亲缘关系较近，与匈牙利株亲缘关系较远，与人
爱知病毒及牛嵴病毒处于不同分支，为不同种群。
此外，本研究分离的 swKoV CH441 株与国内猪嵴病
毒处于同一分支，亲缘关系较近，与匈牙利株处于
不同分支，亲缘关系相对较远，表明猪嵴病毒的进
化因地区不同可能存在着一定的差异。陈如敬等［14］
通过对猪嵴病毒的研究，提出了猪嵴病毒在欧亚两
地可能存在完全独立的进化的观点，本研究也得出
了相类似的结论。猪嵴病毒在表现腹泻症状的猪群
的粪便或血清样品中均有较高的阳性率，在我国部
分地区阳性率达 82.5%，是引起猪腹泻的重要病原
之一。本研究克隆猪嵴病毒 441 株的 3D 基因，对
进一步弄清不同地区猪嵴病毒的基因组差异和该病
毒的复制机制具有重要意义。
4 结论
本试验采用 RT-PCR 技术及 3 RACE 法成功克
隆了猪嵴病毒 441 株 3A-3D 基因序列，3 非编码区
及 Poly（A）结构。对 3D 基因进行序列分析，其序
列全长 1 407 bp，编码 468 个氨基酸，其中含量最
多的氨基酸是亮氨酸，其主要的二级结构单元为 α-
螺旋。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）