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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
螺旋-环-螺 旋（Helix-Loop-Helix，HLH） 转 录
因子家族是真核生物中非常重要的特异性转录因子
家族，该家族广泛存在于从酵母到人类的所有真核
生物中，其成员在调节基因表达，调控细胞周期，
决定细胞分化中起了重要作用［1，2］。大多数的 HLH
蛋 白 属 于 碱 性 / 螺旋-环-螺 旋（basic/Helix-Loop-
收稿日期 ： 2014-04-30
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30770427），“973”课题（2009CB825505）
作者简介 ：苏琢磊，男，硕士研究生，研究方向 ：分子遗传与结构生物学 ；E-mail ：suzhuolei@gmail.com
通讯作者 ：季朝能，男，博士，教授，研究方向 ：分子遗传与结构生物学 ；E-mail ：chnji@fudan.edu.cn
人转录因子 hASH4 的表达纯化及其 DNA 结合活性
苏琢磊 楼田甜 王远东 季朝能
（复旦大学生命科学学院 遗传学研究所，上海 200433）
摘 要 ： hASH4 蛋白所属的 HLH 转录因子家族在调节基因表达，调控细胞周期，决定细胞分化中起了重要作用。有研究
表明 hASH4 蛋白可能与皮肤的分化发育有着密切的关系，但具体机制不明。成功构建了 pET28b-hASH4 表达质粒，并在大肠杆
菌 BL21（DE3）中诱导表达。经过对温度、时间、IPTG 浓度等表达条件的优化，确定在 37℃下 1 mmol/L IPTG 诱导表达 4 h 可
达到最佳表达效果，并通过亲和层析和弱阳离子交换层析纯化蛋白，得到了电泳纯的目的蛋白。通过非放射性凝胶滞留试验发现
hASH4 蛋白单体只具有非特异性的 DNA 结合活性，而不具有特异性的 DNA 结合活性，推进其在体内的转录因子功能可能需先形
成异源二聚体或多聚体才能进一步特异性结合 DNA 进而作用于下游基因。研究结果为 hASH4 蛋白的功能和作用方式提供了线索，
并为其进一步的结晶条件筛选、晶体结构解析和功能研究奠定基础。
关键词 ： 螺旋-环-螺旋 碱性 / 螺旋-环-螺旋 hASH4 DNA 结合 特异性结合 非特异性结合
Expression，Purification and DNA Binding Activity of Human
Transcription Factor hASH4
Su Zhuolei Lou Tiantian Wang Yuandong Ji Chaoneng
（Institute of Genetics，School of Life Science，Fudan University，Shanghai 200433）
Abstract: hASH4 is a member of Helix-Loop-Helix（HLH）proteins which are an important group of transcription factors that exert
such a determinative influence on a variety of cell proliferation, determination and differentiation from yeast to human. hASH4 has been reported
closely related to skin differentiation and development, but the exact mechanism is unknown. In this study, the expression plasmid of pET28b-
his- hASH4 was restructured and successfully expressed in BL21（DE3）. After the optimization of temperature, time, IPTG concentration of
expression, we ascertain that 1mmol/L IPTG expressed 4 hours at 37℃ can get the best expression. and we got the electrophoretic purity of the
target protein by Ni-NTA affinity chromatography and ion cation exchange chromatography. The non-radioactive EMSA experiment between
DNA and protein showed that the hASH4 protein only has the non-sepcific DNA binding activity without specific DNA binding activity. The
play of transcription factors by hASH4 in the body may be need to form a heterodimer or multimer to further specific binding to DNA and act on
the downstream genes. This study provided clues for the really function in vivo of hASH4 and laid the foundation for the further crystallization
conditions screening, structural analysis and functional studies.
Key words: HLH bHLH hASH4 DNA-binding Specific binding Non-specific binding
Helix，bHLH）家族成员，即有与 HLH 结构域相邻的
一个特殊碱性区，该碱性区多数可以与下游靶基因
DNA 的特异性序列包括 E 框基序（CANNTG）或 N
框基序（CACNAG）结合从而发挥转录激活或抑制
作用，HLH 结构域则主要负责介导蛋白的同源或异
源二聚化，有利于 DNA 结合和转录调节［3-5］。
2014年第6期 219苏琢磊等 ：人转录因子 hASH4 的表达纯化及其 DNA 结合活性
hASH4（Human achaete-scute homolog 4） 基 因
是 Jonsson 等［6］最新克隆得到的一段基因，其位于
人染色体 12q24.1 位置，编码 173 个氨基酸，其蛋
白结构含有 bHLH（碱性 / 螺旋-环-螺旋）这一特殊
结构域，是 HLH 转录因子家族的成员 achaete-scute
同系物的一员。在当前的研究报道中，hASH4 蛋白
的表达主要发现于人皮肤中，在其他器官如脑等只
有十分微量的表达，而且在胎儿皮肤中蛋白的表达
量是成人皮肤的 7 倍，固有研究认为 hASH4 蛋白与
皮肤的分化发育有着密切的关系，但相对于 HLH 蛋
白家族在神经细胞发育中所起的作用的研究，其在
皮肤发育中的研究还十分缺乏，并没有严谨的证据
证明其如何调控或者影响着皮肤细胞的分化［6］。在
已有的 HLH 家族蛋白功能研究报道中，我们发现很
多 HLH 蛋白都在各自的表达区域起到非常重要的发
育分化调控作用，且很多跟肿瘤的形成有密切关系，
并有希望能作为肿瘤的治疗靶点，如 hASH1、Id4
等［7-9］。而且对 ASH 家族的其他蛋白功能的研究也
十分匮乏，hASH2 和 hASH3 跟 hASH4 有相似的情况，
均有可能在皮肤的发育分化中起到一定的作用［10］。
本研究希望通过对 hASH4 的 bHLH 结构域进行体外
克隆表达纯化，探究其是否具有特异 DNA 结合框，
为其在体内可能的转录因子功能和作用机理提供线
索，并为 hASH4 蛋白进一步的结晶条件筛选、晶体
结构解析和功能研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
人 工 合 成 基 因 hASH4 ；用 于 表 达 的 质 粒
pET28b、E.coli Top10 感受态细胞及表达菌株 BL21
（DE3）为本实验室保存 ；各种限制性内切酶购自
New England 公司；质粒抽提试剂盒购自 Axygen 公司；
其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 hASH4 基 因 的 人 工 合 成 和 酶 切 鉴 定 依 据
GenBank 中的 hASH4 基因序列，将 hASH4 基因中的
稀有密码子改造为大肠杆菌偏爱密码子。人工合成
hASH4 基因，在合成基因的上下游分别设计 Nhe Ⅰ
和 Xho Ⅰ 酶 切 位 点， 构 建 重 组 表 达 载 体 pET28b-
hASH4，转化至大肠杆菌 E.coli Top 10 感受态细胞中，
在含 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 固体培养基上 37℃培
养约 14 h。挑取单克隆，菌落 PCR 鉴定正确后，提
交 Invitrogen 公司测序。
1.2.2 hASH4 蛋白的表达及诱导条件优化 转化
鉴定正确的重组质粒于表达菌株 BL21（DE3）中，
37℃培养 12-14 h，挑取单菌落，转接于 100 mL 的
含 50 μg/mL 卡那霉素和 34 μg/mL 的氯霉素的 LB 液
体培养基中，37℃ 200 r/min 培养 3 h 后，将其转接
到含 50 μg/mL 卡那霉素和 34 μg/mL 的氯霉素的新
鲜 LB 培养基中培养（37℃，200 r/min）至 OD600 值
为 0.6-0.8，加入 1.0 mmol/L IPTG 对比在诱导温度为
18℃（12 h）、25℃（8 h）、37℃（4 h）下的诱导情
况，确定最佳的诱导表达条件。
1.2.3 hASH4 蛋白的纯化
（1）使用亲和层析柱（HisTrapTM HP）纯化目的
蛋白，其操作步骤如下：离心收集的菌体经缓冲液（50
mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，1 mol/L NaCl，10% 甘油，
pH8.0）重悬浮，经压力破菌仪（循环 2 次）破菌，
高速离心（15 000 r/min，25 min），收集上清液，加
入到平衡后的 HisTrap 柱，用缓冲液洗涤至无蛋白
流出后，使用含有 50 mmol/L 咪唑的洗涤缓冲液（50
mmol/L 咪唑，50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，1 mol/L
NaCl，10% 甘油，pH8.0）洗脱非特异性吸附的杂蛋白，
再用含 250 mmol/L 咪唑的洗脱缓冲液（250 mmol/L
咪唑，50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，1 mol/L NaCl，
10% 甘油，pH8.0）梯度洗脱目的蛋白。
（2）使用离子交换层析（HiTrapTM CM FF）进
一步纯化目的蛋白，其操作步骤如下 ：用 20 倍体积
的 Tris 缓 冲 液（10 mmol/L Tris，5% 甘 油，pH8.0）
稀释从 HisTrap 柱上洗脱的目的蛋白，平衡弱阳离
子交换柱，将稀释的溶液加入柱中，用缓冲液洗涤
至无蛋白流出后，使用含有 1 mol/L NaCl 的缓冲液
（10 mmol/L Tris，5% 甘油，1 mol/L NaCl，pH8.0）梯
度洗脱目的蛋白。对纯化得到的目的蛋白进行 SDS-
PAGE 分析并透析超滤保存。
1.2.4 hASH4 与 DNA 结合活性的研究
（1）通过分子筛试验确认纯化所得蛋白的存
在形式 ：收集离子交换层析的纯化产物，经过超滤
浓缩至体积小于 5 mL，通过微量注射器将蛋白纯
化产物加入到平衡后的分子筛，使用分子筛缓冲液
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期220
（10 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，5% 甘油，pH8.0）
持续流过洗柱。根据实验室之前标定的分子筛分子
量范围，按时收取对称的流出峰主峰。根据流出峰
所在位置和流出峰为单峰或双峰判断蛋白存在形式。
（2）筛选是否有特异性 DNA 结合域 ：离心收
集 37℃下 1.0 mmol/L IPTG 诱导表达 4 h 的菌体，使
用不含 NaCl 和甘油的缓冲液悬浮，并压力破菌、高
速离心收集上清液后，上样到平衡后的 HisTrap 柱，
用含有高浓度的 NaCl 和甘油的缓冲液进行洗脱，收
集洗脱液，进行 DNA 电泳，割胶回收一些较小片段
的 DNA，使用 PCR 酶进行酶切，并连接到 T 载体上，
挑选阳性克隆，提交 Invitrogen 公司进行测序，鉴定
所得 DNA 片段是否含有一些特异性结合位点。
（3）鉴定蛋白与 poly（dA）·poly（dT）和 poly
（dG）·poly（dC）序列的结合活性 ：提交 Invitrogen
公 司 合 成 单 链 poly（dA）、poly（dT）、poly（dG）、
poly（dC） 序 列， 各 有 22 个 碱 基， 在 Tris 缓 冲 液
体 系 中，poly（dA） 与 poly（dT）、poly（dG） 与
poly（dC）在 94℃条件下变性 5 min，52℃退火连接
10 min，复性成双链 poly（dA）·poly（dT）和 poly
（dG）·poly（dC）DNA 片段。在缓冲体系终浓度为
50 mmol/L Tris，150 mmol/L KCl 下混合 DNA 与蛋白，
25℃温育 30 min 通过 2 倍 DNA 电泳胶低电压 30 V（防
止过热导致蛋白变性）电泳检测蛋白与 DNA 是否具
有结合活性。
（4）合成含有已知的 HLH 结构域蛋白的 DNA
特异性结合框 E-box（CANNTG）和 N-box（CACNAG）
的所有可能的序列片段，并在 DNA 两端各加上 8 个
AT 碱基（保证具有超过 20 个碱基对，方便进行下
一步的凝胶滞留试验），外加对照组 poly（dG）·poly
（dC）片段，并如前面步骤复性成双链 DNA，所有
序列如表 1 所示。
所有合成的 DNA 与蛋白在缓冲体系终浓度为
50 mmol/L Tris，150 mmol/L KCl 条件下按不同比例
混合、25℃温育 30 min，各加入 6× 溴酚蓝凝胶载
样缓冲液，然后上样到 8% 非变性丙烯酰胺凝胶，
在 1×TBE 染色液中稳压 100 V 4℃低温电泳，大
约 90 min 后结束，收板，银染显色。根据是否出现
DNA 滞留片段判断蛋白的 DNA 结合活性。
2 结果
2.1 hASH4的人工合成及重组质粒的鉴定
生物信息学分析所得的 hASH4 的 bHLH 结构域
氨基酸序列为 ：
表 1 试验中用到的双链 DNA 序列
编号 片段序列（5-3）
a AAAAAAAACAAATGAAAAAAAA
b AAAAAAAACAATTGAAAAAAAA
c AAAAAAAACAAGTGAAAAAAAA
d AAAAAAAACAACTGAAAAAAAA
e AAAAAAAACATATGAAAAAAAA
f AAAAAAAACATGTGAAAAAAAA
g AAAAAAAACATCTGAAAAAAAA
h AAAAAAAACAGCTGAAAAAAAA
i AAAAAAAACACCTGAAAAAAAA
j AAAAAAAACACGTGAAAAAAAA
k AAAAAAAACACAAGAAAAAAAA
l AAAAAAAACACTAGAAAAAAAA
m AAAAAAAACACGAGAAAAAAAA
n AAAAAAAACACCAGAAAAAAAA
o GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
a-j ：E-box（CANNTG）序列 ；k-n ：N-box（CACNAG）序列 ；o ：poly（dG）·
poly（dC）序列
CBTJD IFMJY MPPQ IFMJY
(1-%4"&1" -3,3/&3&3237 3$7/&(:"3-3%)-1 3&-"%,3-4 ,7&5-3""*%:*,
)-2&--&32
按大肠杆菌的密码子优化并加上 Nhe I 和 Xho I
酶切位点的基因序列为 ：
5-GCTAGCACCATGGGCCCGCTGGATAGCGCATTTGAACCGGCG-
TTCCTGCGTAAACGCAACGAACGTGAACGCCAGCGTGTGCGCTG-
CGTTAATGAAGGTTATGCCCGTCTGCGCGATCATCTGCCGCGTGA-
ACTGGCGGATAAACGCCTGTCTAAAGTGGAAACCCTGCGTGCGG-
CCATTGATTACATCAAACACCTGCAGGAACTGCTGGAACGCCAG-
TAACTCGAG-3
利用人工合成方法合成 hASH4 基因，将 hASH4
基因连接到 pET28b 质粒中，转入 E.coli Top10 感受
态细胞中，挑选单菌落进行菌落 PCR 鉴定，阳性
克隆送至 Invitrogen 公司测序，测序结果与设计的
hASH4 序列完全一致。
2.2 hASH4蛋白的诱导表达条件优化
用 SDS-PAGE 分析对比 1.0 mmol/L IPTG 条件下，
在诱导温度为 18℃（12 h）、25℃（8 h）、37℃（4 h）
中的诱导情况如图 1 所示。在 37℃（4 h）诱导条件
下，目的融合蛋白的可溶性表达量最高。目的融合
2014年第6期 221苏琢磊等 ：人转录因子 hASH4 的表达纯化及其 DNA 结合活性
蛋白分子量约为 9.1 kD，与图中片段大小相符。 标准分子筛图（图 4），可以看出 hASH4 蛋白流出峰
所在的缓冲液体积略大于溶菌酶，说明纯化所得的
蛋白分子量小于溶菌酶，且因为融合蛋白的单体分
子量为 9.1 kD，所以该蛋白是以单体形式存在。由
于在纯化过程中没有加入 DTT、β-巯基乙醇等试剂
来抑制二硫键的作用影响二聚体的形成，说明该蛋
白在体内也较难有同源二聚体的形成。这为下一步
的 DNA 结合活性研究提供了一定的线索。
94.0
kD 1 2 3 4 5 6 7
66.2
45.0
35.0
26.0
20.0
14.4 ਟⓦᙗⴞⲴ㳻ⲭ
1 ：Marker ；2 ：16℃全菌蛋白 ；3 ：16℃上清蛋白 ；4 ：25℃全菌蛋
白 ；5 ：25℃上清蛋白 ；6 ：37℃全菌蛋白 ；7 ：37℃上清蛋白
图 1 不同温度诱导 hASH4 蛋白表达的 SDS-PAGE 凝胶电
泳图
2.3 hASH4蛋白的纯化
由于融合蛋白 pET28b- hASH4 含有 His 标签，
可使用 Ni-NTA 亲和柱纯化表达产物，且融合蛋白
PI 值为 9.73，所以选用弱阳性离子交换柱进行进一
步纯化，所得融合蛋白经过 SDS-PAGE 分析图（图 2）
中可见得到一条约为 10 kD 左右的蛋白条带，这与
预期的蛋白分子量（9.1 kD）基本符合，且蛋白纯度
较高，基本无杂带出现，并将所得蛋白用缓冲液透析，
超滤至 10 mg/mL，分装并 -80℃保存。
94.0
kD 1 2 3 4 5 6
66.2
45.0
35.0
26.0
20.0
14.4
1 ：全菌蛋白 ；2 ：上清蛋白 ；3 ：HisTrapTM HP 柱 50mmol/L 咪唑洗
脱蛋白 ；4 ：Marker ；5 ：HisTrapTM HP 柱 250 mmol/L 咪唑洗脱蛋白 ；
6 ：HiTrapTM CM FF 柱 1mol/L NaCl 梯度洗脱蛋白
图 2 纯化过程所得蛋白的 SDS-PAGE 凝胶电泳图
2.4 hASH4蛋白存在形式的研究
通过分子筛试验确认蛋白是否有二聚体形成，
从分子筛流程图（图 3）中可以看出，蛋白流出峰
只有一个，说明蛋白只以一种形式（只有一种分子
大小）存在，对照实验室保存的溶菌酶（14 kD）的
60
100
-100
0
-200
200
300
400
500
600
mAu
UV
70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 mL
Cond pH
pressure Temp Conc
图 3 目的融合蛋白过分子筛流程图
60
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
mAu
70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 mL
UV Cond pH
pressure Temp Conc
图 4 溶菌酶（14 kD）的标准分子筛图
2.5 部分与蛋白结合的DNA序列比对
经过将纯化时洗脱的 DNA 进行克隆表达测序，
得到一些小片段 DNA 的序列为 ：
（1）5-TGTGCGAGCCAGCTCAAACTTTTTAACC
TTTTTGTTTCAATTATGATCCAGGTACATTTCTGTGA
TGTTGTCTGGGTGTTATTTTAAGGCCGCAGGTACCC
CATAACCTTACAAGATCTGTGGTTTTACTAAAGGAC
ACCCTATGAAAACCTCTA-3。
（2）5-TAGACCTCGCCAATACTGTTCAGCAGG
ATGTGTCGCTGGCCCTGTTTAATTTCCTGGAGCATTT
CCCGTTCTCTTCTGTGCTGTCATTCATTGCAATGGCG
ATGGTCATCGTCTTCTA-3。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期222
（3）5-TAGACCTCGCCAATACTGTTCAGCAGG
ATGTGTCGCTGGCCCTGTTTAATTTCCTGGAGCATTT
CCCGTTCTCTTCTGTGCTGTCATTCATTGCAATGGCG
ATGGTCATCGTCTTCTA-3。
（4）5-TTTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAG
TTTTTCTAAGAATTAATTCATGAGCGGATACATATT
TGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTC
CGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGT
AAGCGTTAATATTTTGTTAAAAT-3。
（5）5-TCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTC
ATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCC
TTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGA
GTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAA
AGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACC
GTCTATCAGGGCGA-3。
（6）5-TGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTA
ACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGC
TTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAA
CAGGCAGACATA-3。
（7）5-TAGGAGCAGGAAACTGATGTACTGTTG
ATTGGCGGCGGCATTATGAGCGCCACGTTGGGGAC
CTATTTACGCGAGCTGGAGCCTGAATGGTCGATGAC
CATGGTGGAGCGCCTGGAGGGTGTCGCGCAGGAGA
GTTCGAACGGCTGGAA-3。
如测序结果所示，经过比对，只有 4 号片段中
含有 E-box（CANNTG）结合框，其没有重复性高的
DNA 片段出现，所以猜测单体 hASH4 不一定具有特
异性的 DNA 结合活性。所以下一步试验直接合成最
特异性的片段 poly（dA）·poly（dT）和 poly（dG）·poly
（dC），如果蛋白与这两种 DNA 依然有结合，说明其
具有一定的非特异性的结合活性。poly（dA）·poly（dT）
和 poly（dG）·poly（dC）在试验方法 1.2.4 所述的
体系下与蛋白反应，通过 DNA 凝胶电泳结果如图 5
所示，poly（dA）·poly（dT）序列和 poly（dG）·poly（dC）
序列与蛋白均有一定的结合活性，且 poly（dG）·poly
（dC）序列与蛋白的结合活性稍微强一些，所以猜测
hASH4 蛋白具有非特异性的 DNA 结合活性，而特异
性则需要进一步验证。
从已有研究得知 hASH4 蛋白所属的 bHLH 转录
因子家族的 A 组子家族，最常见的 DNA 结合框为
1 2 3 4
1 ：对照组无蛋白 ；2 ：poly（dA）·poly（dT）片段与 hASH4 蛋白互作 ；3 ：
poly（dG）·poly（dC）片段与 hASH4 蛋白互作 ；4 ：Marker
图 5 蛋白与特异 DNA 互作的凝胶电泳图
CAGCTG 其次为 CACCTG。在下一轮试验设计中，
第一步采用 poly（dG）·poly（dC）片段 o 号、带有
N-box 的 k 号片段、带有最常见的 CAGCTG 框的 h
号片段与蛋白互作。在对比 DNA 与蛋白比为 1∶1、
1∶3、1∶6 的不同组别非变性丙烯酰胺凝胶电泳结
果（图 6），发现在较高蛋白比 6∶1 时 3 个片段均
出现相同的 DNA 片段滞后现象，在 3∶1 组中也有
非常微量的滞后条带，说明蛋白与 3 种片段存在相
同的结合活性，且蛋白与 DNA 结合不是按照 1∶1
的比例进行结合，如果为特异性结合，则一个蛋白
能结合一个 DNA 双链，说明蛋白与 3 种片段均为非
特异性结合。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
┎ਾⲴ
DNA⡷⇥
1：o 号片段；2-4：o 号片段分别 1∶1、1∶3、1∶6 与蛋白互作；5：h 号片段；6-8：
h 号片段分别 1∶1、1∶3、1∶6 与蛋白互作 ；9 ：k 号片段 ；10-12 ：k 号片
段分别 1∶1、1∶3、1∶6 与蛋白互作
图 6 双链 DNA 与 hASH4 蛋白互作的非变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳图
第 2 步试验，减少 DNA 量加大蛋白比（1∶6、
1∶9、1∶12），并使用含有 A 组子家族中最大可能
的 2 个 DNA 特 异 结 合 框 CAGCTG 与 CACCTG 的 h
号片段和 i 号片段以及对照的 poly（dG）·poly（dC）
与蛋白互作，从图 7 中可以看出，3 种 DNA 片段与
蛋白均有结合存在，且结合活性没有明显不同。
第 3 步 试 验， 使 用 所 有 合 成 的 含 有 E-box
2014年第6期 223苏琢磊等 ：人转录因子 hASH4 的表达纯化及其 DNA 结合活性
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1：o 号片段；2-4：o 号片段分别 1∶6、1∶9、1∶12 与蛋白互作；5：h 号片段；
6-8 ：h 号片段分别 1∶6、1∶9、1∶12 与蛋白互作 ；9 ：i 号片段 ；10-12 ：
i 号片段分别 1∶6、1∶9、1∶12 与蛋白互作
图 7 双链 DNA 与 hASH4 蛋白互作的非变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳图
（CANNTG）以及 N-box（CACNAG）DNA 片段，在
与蛋白比为 1∶15 的比例反应，并通过非变性聚丙
烯酰胺凝胶电泳，从图 8 发现所有泳道均有 DNA 滞
后片段出现，其滞后片段相同，证明所有片段与蛋
白都具有相同的结合活性。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 151413
1-15 ：a-o 号片段 1 ：15 与蛋白互作 ；1-10 ：E-box 框 DNA 片段 a-j 号 ；11 ：
poly（dG）·poly（dC）片段 o 号 ；12-15 ：N-box 框 DNA 片段 k-n 号
图 8 双链 DNA 与 hASH4 蛋白互作的非变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳图
在前 3 步试验中，由于在非放射性凝胶滞留试
验中高浓度蛋白有可能表现出“粘性”，继而显现
出非特异性结合 DNA 的性质，所以采用实验室保
存的 BSA 溶菌酶蛋白以相同蛋白浓度并 DNA 蛋白
比（1∶12、1∶15）作为对照组。从图 9 中可以看
出，BSA 对照组（1 号、2 号条带）中并没有滞后的
DNA 片段出现，说明试验中 DNA 滞后的现象的确
是跟 hASH4 蛋白结合引起的。结合前面的凝胶滞留
试验结果，研究认为 hASH4 蛋白单体并不存在有特
异性的 DNA 结合活性，只具有非特异性结合活性。
3 讨论
本研究中先期试验得到的与 hASH4 蛋白结合的
1 2 3 4 5 6 7 8
1 ：o 号片段 1 ：12 与 BSA 蛋白互作 ；2 ：o 号片段 1∶15 与 BSA 蛋白互作 ；
3-8 ：o、h、i、a、k、m 号片段 1∶15 与 hASH4 蛋白互作
图 9 双链 DNA 与 BSA 蛋白和 hASH4 蛋白互作的非变性
聚丙烯酰胺凝胶电泳图
DNA 片段测序结果显示并没有存在已知的 HLH 转
录因子家族所有特异性结合框，且发现蛋白与 poly
（dG）·poly（dC）和 poly（dA）·poly（dT）这种非
常特异的 DNA 都具有结合，固猜测其并没有特异性
结合 DNA 现象存在。所以在进一步的试验设计中就
采用较为简单的 DNA 凝胶电泳和非放射性凝胶滞留
试验来定性证明这一猜测。如果发现其存在着特异
性的 DNA 结合活性，则需要放射性的 EMSA 试验来
定性和定量证明蛋白特异性 DNA 结合活性的强弱，
虽然也有研究直接通过非放射性的凝胶滞留试验验
证蛋白的特异性的 DNA 结合活性，但我们认为该试
验方法并不严谨，可能只能定性地说明蛋白具有特
异性结合活性，但并不能定量的证明［11，12］。
从试验结果中发现 hASH4 虽然属于 HLH 转录
因子家族 A 子家族，却不具有特异性的 DNA 结合活
性，且通过分子筛试验证明 hASH4 蛋白在体外以单
体形式存在，不形成同源二聚体，这证明该蛋白在
体内一般也不会形成同源二聚体。所以猜测 hASH4
蛋白可能需先形成异源二聚体或多聚体才能进一步
特异性结合 DNA 而作用于下游基因并发挥转录因子
的功能，这种现象在 HLH 转录因子家族中普遍存
在，如 Max［13］、E47［14］蛋白家族等。要证明这个
猜测则需要在进一步研究进行验证。由于 hASH4 蛋
白于幼儿皮肤中大量表达存在，其功能应该与皮肤
发育有关，进一步的研究可以尝试找到已知的在皮
肤分化发育中起到重要作用特别是也在幼儿皮肤大
量表达的 HLH 转录因子或其他结构域转录因子，与
hASH4 蛋白相互作用研究是否存在共同作用，若存
在共同作用，则进一步证明其复合物是否具有特异
性的 DNA 结合活性。若无法找到也在皮肤中大量表
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期224
达的蛋白，则可以通过与已知的一些重要的 HLH 转
录因子相互作用，已有研究表明存在部分 HLH 转录
因子在多个器官可以与不同的 HLH 转录因子蛋白结
合形成异源二聚体而发挥功能作用，若找到可以与
hASH4 蛋白相互作用的蛋白，可能会给其在体内所
起的功能和作用机制提供线索。
本研究采用的是原核表达系统对 hASH4 蛋白
进行表达纯化，所得蛋白的翻译后修饰状态可能与
细胞内存在一定的不同，从而影响其与 DNA 的结
合。在已有的对该家族同组别蛋白的研究中，多数
均采用原核表达系统，例如 MyoD、Max、E 蛋白、
PHO 等蛋白家族［1，13-18］，通过原核表达报道了完整
的蛋白晶体以及蛋白和 DNA 结合的晶体。本研究中
hASH4 蛋白能非特异性的结合 DNA 说明原核表达的
hASH4 蛋白具有预测性的 DNA 结合活性，只是这种
非特异性结合 DNA 的性质是否真正代表细胞内该蛋
白的特性还有待进一步的研究和确认。
通过原核表达得到的真核生物转录因子蛋白单
体的低溶解度和不稳定性导致其晶体结构的不易获
取，所以对 HLH 蛋白晶体结构解析的研究大多集中
于蛋白与 DNA 复合结构或蛋白二聚体与 DNA 的复
合结构，PDB 数据库上对 HLH 蛋白单体的结构数
据较少，大部分为复合结构数据［1，13，15-18］。因此在
对 HLH 转录因子蛋白结构和功能的研究中，其单体
与 DNA 是否存在特异性结合活性是第一步需要得到
验证的，本研究所采用的方法较为简单快捷，可以
较好地在 HLH 转录因子家族的结构功能研究中得到
推广。
4 结论
本研究成功构建了 hASH4 的表达纯化系统，通
过 pET28b- hASH4 重组表达质粒在大肠杆菌 BL21
（DE3）菌株中，原核表达得到可溶性融合蛋白，及
电泳纯化目的蛋白。hASH4 蛋白单体不存在特异性
的 DNA 结合活性，只存在非特异性结合活性。
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（责任编辑 李楠）