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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
脂肪酶（甘油三酯水解酶，EC 3.1.1.3）是由动
植物及微生物产生的能在水 - 油界面催化甘油三酯
水解的酶，而且在非水相介质中可催化酯合成反应。
其中，微生物脂肪酶由于其稳定性、选择性及底物
特异性在商业应用方面显示出巨大的潜能［1，2］，所
以有效筛选产脂肪酶微生物具有重要意义。
收稿日期 ：2012-10-29
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（21062004） ，贵州省优秀科技教育人才省长专项基金项目［黔省专合字（2010）10 号］ ，国家自然科
学基金项目（31160002，C010101）
作者简介 ：王欢，女，硕士研究生，研究方向 ：发酵工程 ；E-mail: huan9955@163.com
通讯作者 ：何腊平，副教授，博士，研究方向 ：发酵工程，生物催化与生物转化 ；E-mail: helaping@163.com
微生物筛选的关键问题是如何构建高效筛选模
型，而在筛选合适的生物催化剂之前要测定其活力
大小。目前关于脂肪酶活力的测定，常用的实用方
法主要有 ：测其水解酶活力的方法，如平板法［3］、
橄榄油乳化法［4，5］、对硝基苯酚法［6-8］ 等 ；测其
酯合成酶活力的，如对硝基苯酚法测脂肪酶酯合
脂肪酶活力测定方法及其在筛选产脂肪酶
微生物中的应用
王欢1，2  何腊平3，4  周换景1，2  张义明1  李翠芹2  陶菡1，2
（1. 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵阳 550025 ；2. 贵州大学化学与化工学院，贵阳 550025 ；3. 贵州大学生命科学学院，
贵阳 550025 ；4. 贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵阳 550025）
摘 要 ： 比较了罗丹明平板法、橄榄油乳化法、对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活和对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活 4 种
常用的脂肪酶活力测定方法。结果表明，罗丹明平板法只适合脂肪酶活力的定性和初步定量判断，后 3 种方法适合于脂肪酶活力
的定量检测，但只有对硝基苯酚法有较好的重现性。而且，脂肪酶水解酶活力和其合成活力无对应关系，所以在筛选产脂肪酶微
生物时要选择合适的脂肪酶活力测定方法。也即，筛选产水解酶活的菌株应选择水解酶活测定方法，否则，选择酯合成酶活力测
定方法。基于这一原则筛选到了预期产脂肪酶微生物。
关键词 ： 脂肪酶 水解酶活力 酯合成酶活力 测定方法 筛选
Determination Methods for Lipase Activity and Its Application in the
Screening of Microbial Lipase
Wang Huan1，2 He Laping3，4 Zhou Huanjing1，2 Zhang Yiming1 Li Cuiqin2 Tao Han1，2
（1. Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy，Guiyang 550025 ；2. School of Chemistry and Chemical
Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025 ；3. College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025 ；4. Key Laboratory of
Agricultural and Animal Products Store & Processing of Guizhou Province，Guiyang 550025）
Abstract:  Four common lipase activity determination methods including Rhodamine B plate, olive oil emulsification, ρ-NPP for lipase
hydrolytic activity and ρ-NPP for lipase synthetic activity were compared. The result showed that the Rhodamine B plate method was suitable for
the qualitative and preliminary quantitative estimate of lipase activity and the other three methods were suitable for the quantitative determination
of lipase activity but only the ρ-NPP method has a good reproducibility. Moreover, there is no relationship between the hydrolytic activity and
synthetic activity of lipase. So lipase activity determination method should be chosen in screening the lipase-produced microbial. Namely,
hydrolytic activity determination methods should be chosen in screening the hydrolytic lipase-produced microbial, otherwise, ester synthetase
activity assay should be used. Based on the principle, desired lipase-produced microbial were screened.
Key words:  Lipase Hydrolytic activity Synthetic activity Determination methods Screening
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期204
成酶活力［9］等。因为测定方法的选择是否合适直
接关系到有效筛选到产脂肪酶的微生物的可能性，
所以本研究旨在探讨筛选产脂肪酶微生物的最佳
方法。
基于此，本研究就目前常用的罗丹明平板法，
橄榄油乳化法，对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活以
及对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活几种脂肪酶活
力测定方法进行了比较试验，并对其在筛选产脂肪
酶微生物中的相应应用进行了探讨，以期更好地服
务于实践应用。
1 材料与方法
1.1 材料
Novozyme 435（诺维信脂肪酶）由 Novo Nordisk，
Bagsvard，Denmark 赠送。脂肪酶 lipase AY 由 Amano
酶制剂公司赠送，脂肪酶 PPL（Pocine Pancreas Li-
pas）由 Sigma-Aldrich Chemical Co. 购买。本试验所用
微生物来自于贵州大学贵州省农畜产品贮藏与加工
重点实验室和贵州大学贵州省发酵工程与生物制药
重点实验室保藏菌种。对硝基苯酚（ρ-NP）和 4-硝
基苯基棕榈酸酯（ρ-NPP）标样自百灵威科技有限公
司购买。其他试剂均为分析纯或者商业用途。
1.2 方法
1.2.1 脂肪酶活力测定法 罗丹明平板法判断原理：
罗丹明 B 能与脂肪酶水解的各种可能的底物（单、
二油酸甘油酯，油酸，油酸钠）结合为聚合体，该
聚合体受紫外光激活，产生橘黄色荧光［10］。依据有
无橘黄色、颜色深浅和水解圈大小来判断是否产脂
肪酶和对所产脂肪酶活力大小进行初步判断。
罗丹明平板法参考文献［3］。橄榄油乳化法参
考文献［4，5］。对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活力
法参考文献［6-8］。对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成
酶活力法参考文献［9］。
1.2.2 产高水解脂肪酶活力的微生物筛选中的脂肪
酶活力测定方法
1.2.2.1 粗酶液及粗酶粉的制备 种子培养基（%）：
牛 肉 膏 0.3， 蛋 白 胨 0.5， 葡 萄 糖 0.5，NaCl 0.5，
pH8.5，15 mL/250 mL 三角瓶。发酵产酶培养基（%）：
豆饼粉 2.0，玉米浆 2.0，可溶性淀粉 1.0，K2HPO4 0.5，
NaNO3 0.5，pH7.0，50 mL/250 mL 三角瓶。
挑取一环新鲜的斜面种子，接入液体种子培养
基中，37℃、150 r/min 条件下培养 24 h。然后取 2
mL 液体种子于发酵产酶培养基中，37℃、150 r/min
条件下摇瓶培养 72 h。将发酵液于 4℃，8 000 r/min
离心，上清液测酶活，沉淀经缓冲液洗涤后离心收
集经冷冻干燥即为粗酶粉。
1.2.2.2 酶活测定 对实验室保藏的产脂肪酶菌种
进行酶活测定，定性测定采用平板法，定量测定采
用橄榄油乳化法和对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活。
1.2.3 产高酯合成酶活力的微生物筛选中的脂肪
酶活力测定方法 粗酶液及粗酶粉的制备方法同
1.2.2.1。酶活测定 ：产水解脂肪酶活力高的菌株，
需进行水解酶活力测定。筛选一般要进行初筛和复
筛。初筛要注重数量，要有简单明了的判断方法，
罗丹明平板法正符合要求 ；复筛要注重质量，要进
行酶活力大小的测定，则需选用相应的定量测定方
法。对实验室保藏的产脂肪酶菌种进行酶活测定，
定性测定采用平板法，定量测定采用对硝基苯酚法
测脂肪酶酯合成酶活。
2 结果
2.1 罗丹明平板法
将几株微生物接入罗丹明 B 培养平板中，于
365 nm 紫外灯下观察。结果如图 1 所示，有些菌落
有橘黄色光，有些无，表明产橘黄色光的菌落产脂
肪酶，否则不产脂肪酶或产脂肪酶活力可忽略。
图 1 罗丹明 B 培养平板变色圈
由于罗丹明平板法简便易行，适用于初筛时对
所筛选的微生物是否产脂肪酶做定性和初步定量判
2013年第1期 205王欢等 ：脂肪酶活力测定方法及其在筛选产脂肪酶微生物中的应用
断，将用于后续筛选。
2.2 橄榄油乳化法
2.2.1 橄榄油乳化法与 pH 对应关系 用橄榄油乳
化法测定不同 pH 值的脂肪酶活力，脂肪酶相对活
力与 pH 对应关系如图 2 所示。结果表明，采用橄
榄油乳化法测定脂肪酶活力，pH 有较大影响，且不
同脂肪酶的最适 pH 不同。
2.2.2 橄榄油乳化法测定精密度 采用橄榄油乳化
法测定脂肪酶酶活力，结果见表 1。
6.5 7.0 7.5 8.0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
16
76
䞦⍫
U/g

pH
6.5 7.0 7.5 8.0
90
100
110
120
130
140
150
N
ov
oz
ym
4
35
䞦⍫
U/g

pH
6.5 7.0 7.5 8.0
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
PP
L䞦
⍫ 
U
/g

pH
6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 8.2
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Li
pa
se
A
Y
䞦⍫
U/g

pH
图 2 橄榄油乳化法与 pH 对应关系
表 1 橄榄油乳化法测得脂肪酶酶活及相对标准偏差
脂肪酶
酶活（U/g）
平均值（U/g） 相对标准偏差（%）
1 2 3
Lipase AY 9733.33 10300.00 10600.00 10277.78 3.2486
Novozym 435 21.33 20.00 20.67 20.67 3.2258
PPL 1240.00 1320.00 1380.00 1313.33 5.3480
CICC 1676 28.80 28.20 30.60 29.20 3.2489
由表 1 可知，橄榄油乳化法所测结果变化较大，
精确性和稳定性差。从误差来源分析，其指示剂终
点变色范围大、不明显造成该方法稳定性差［11］。
2.3 对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活
对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活标准曲线（图
3）显示，对硝基苯酚含量（x）为 0-100 μmol/L 时
与吸光度（y）值呈现良好线性关系，回归方程为 ：
y=0.17678x+0.00983，相关系数 R2=0.99938。该图的
试验数据标准差≤ 0.37%。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期206
采用对硝基苯酚法测定脂肪酶水解酶活力，结
果见表 2。由表 2 可知，当酶活数值比较大时，精
确度和稳定性比较高，但总体均优于橄榄油乳化法。
2.4 对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活
对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活标准曲线
（图 4）显示，对硝基苯酚含量（x）为 -2 mmol/L
2.5 脂肪酶活力测定方法在产水解脂肪酶活力的
微生物筛选的应用结果
2.5.1 初筛中的罗丹明平板法检测结果 从实验室
保藏菌种中，利用罗丹明平板法筛选出了 50 株产
脂肪酶微生物（其中部分是前期试验筛选出来保藏
的），将具有变色圈的菌种挑出进行下一步试验。
2.5.2 复筛中的对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活检
0 20 40 60 80 100
2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18 ੨ݹᓖ

੨ݹ
ᓖ
ሩ⺍ส㤟䞊䟿μmol/L
ᤏਸᴢ㓯
图 3 对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活标准曲线
时与吸光度（y）值呈现良好线性关系，回归方程
为 ：y=6.12562x+0.01334，相关系数 R2=0.99970。该
图的试验数据标准差≤ 0.42%。
采用对硝基苯酚法测定脂肪酶酯合成酶活力，
结果（表 3）显示，当酶活的数值过大或过小时均
影响测定的稳定性。
脂肪酶
酶活（U/g）
平均值（U/g） 相对标准偏差（%）
1 2 3
Lipase AY 5760.30 5786.28 5776.62 5774.40 0.2274
Novozym 435 2335.38 2337.00 2337.81 2336.70 0.0529
PPL 147.00 144.00 150.00 147.00 2.0408
CICC 1676 75.00 78.00 75.00 76.00 2.2790
表 2 对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活及相对标准偏差
表 3 对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活及相对标准偏差
脂肪酶
酶活（U/g）
平均值（U/g） 相对标准偏差（%）
1 2 3
Lipase AY 0.04 0.06 0.04 0.05 24.7436
Novozym 435 5.46 5.48 5.38 5.44 0.9727
PPL 0.54 0.56 0.56 0.55 2.0868
CICC 1676 1.38 1.40 1.42 1.40 1.4286
图 4 对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活标准曲线
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
0
2
4
6
8
10
12
14 ੨ݹᓖ
ᤏਸᴢ㓯
੨ݹ
ᓖ
ሩ⺍ส㤟䞊䟿mmol/L
测结果 由于对硝基苯酚法比橄榄油乳化法测定脂
肪酶水解酶活相对偏差要小，所以在复筛中选择对
硝基苯酚法测定脂肪酶水解酶活。
粗酶粉采用对硝基苯酚法测脂肪酶水解酶活。
测定结果（表 4）表明，酶活高的菌株较少，其中
酶活最高的菌株可达 3.921 U/mL。上述结果说明可
以通过罗丹明平板法初筛和对硝基苯酚法测脂肪酶
2013年第1期 207王欢等 ：脂肪酶活力测定方法及其在筛选产脂肪酶微生物中的应用
水解酶活法筛选到水解酶活较高的产脂肪酶菌株。 酶活时数据相差较大，其中对硝基苯酚法稳定性较
好，尤其在测定有较大酶活的脂肪酶时。因此，在
测定脂肪酶活力前，确定合适的稀释倍数尤为重要。
所测出酶活与脂肪酶所催化的反应有对应关系，
Lipase AY 主要催化甘油三酯的水解，Novozym 435
主要催化酯合成反应，故 Lipase AY 的水解酶活最高，
而 Novozym 435 的酯合成酶活最高。
3.3 水解酶活力及合成酶活力相关性比较
表 3 与表 1、表 2 比较可知，脂肪酶的酯合成
酶活力与水解酶活力一般并不一致，与文献［12，13］
的报道一致。由此得出结论，如果目的是筛选脂肪
酶水解酶活力高的菌株，就要用脂肪酶水解酶活测
定方法进行测定 ；反之，就要用脂肪酶酯合成酶活
测定方法进行测定。
今后的脂肪酶筛选可基于这一思路进行，对于
这种选择测定方法的可行性再进行验证。
4 结论
（1）平板法快速、简单，适用于产脂肪酶菌株
的筛选，但是精确度不足，并且需要的时间周期比
较长。
（2）橄榄油乳化法方法简便、测定速度较快，
但是重现性较差，可用于粗略的估计酶活大小。
（3）与橄榄油乳化法相比，对硝基苯酚法测水
解酶活灵敏度有所提高，方法稳定、重现性好，有
利于检测活力低的脂肪酶，是构建脂肪酶高通量模
型的较好选择。
（4）对硝基苯酚法测合成酶活方法能比较好的
衡量脂肪酶的合成能力，是筛选具有合成能力的脂
肪酶的比较好的方法。
（5）脂肪酶的水解酶活和合成酶活力往往不一
致，所以实际应用时应选用相应的测定方法。本研
究也基于这一原则，分别成功地筛选到了脂肪酶水
解酶活较高的菌株和脂肪酶合成酶活较高的菌株。
参 考 文 献
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Enzyme and Microbial Technology，2001，28（2-3）：145-154.
［2］ Kretza E，Papaneophytou CP，Papi RM，et al. Lipase activity
表 4 对硝基苯酚法测定水解酶活
酶活范围（U/mL） 菌种数量（株） 菌种数量（%）
0-0.5 18 36
0.5-1 14 28
1-2 13 26
2-3 2 4
3-4 3 6
2.6 脂肪酶活力测定方法在产高酯合成脂肪酶活
力的微生物筛选的应用结果
初筛中的罗丹明平板法检测结果 同 2.5.1。复
筛中粗酶粉采用对硝基苯酚法测脂肪酶酯合成酶活，
测定结果如表 5 所示，其中酶活最高的菌株为 3.296
U/g。上述结果说明可以通过罗丹明平板法初筛和对
硝基苯酚法测脂肪酶合成酶活法筛选到酯合成酶活
较高的产脂肪酶菌株。
表 5 对硝基苯酚法测定合成酶活
酶活范围（U/mL） 菌种数量（株） 菌种数量（%）
0-0.5 32 64
0.5-1 15 30
1-2 1 2
2-3 0 0
3-4 2 4
3 讨论
对上述测定方法进行比较，由于罗丹明平板法
只适合于对脂肪酶做定性和初步定量判断，在这里
比较上述后面 3 个定量检测方法。
3.1 精密度比较
总体来讲，对硝基苯酚法要比橄榄油乳化法相
对标准偏差要小，重现性好。但是对于酶活较小的
菌种，相对标准偏差较大，所以选择正确的酶活测
定方法很重要。
3.2 酶活力大小比较
3 种方法测得几种脂肪酶的酶活及相对标准偏
差显示（橄榄油乳化法测定酶活时采用每种脂肪酶
的最适 pH 值），3 种测定方法在测定同一种脂肪酶
时，测定结果在数值上有一定的差异，不能互相代
替。橄榄油乳化法和对硝基苯酚法测定脂肪酶水解
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期208
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（责任编辑 马鑫）