全 文 ：·综述与专论· 2012年第5期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 : 2011-09-26
作者简介 : 陈伟峰 , 硕士 , 研究方向 : 微生物学检验 ; E-mail: cwfgo@yahoo.cn
蛋白编码基因在细菌分类学中的应用
陈伟峰 洪舒音 赵秀玲
（奉化出入境检验检疫局，宁波 315500）
摘 要： 为弥补 16S rDNA在细菌分类应用中的不足，人们应用了一些编码重要蛋白的看家基因作为系统分类的分子标记。
蛋白编码基因具有分辨能力强、准确度高、与基因组一致性好等优点，在近缘菌株的鉴别中效果突出，与其他分类标记结合使用
则能够取得更加出色的成效。同时，介绍蛋白编码基因在细菌分类和相关技术中的应用情况，并对这一工具的发展前景作展望。
关键词： 蛋白编码基因 分类分子标记 近缘菌株鉴别
Application of Protein-coding Genes in Bacterial Taxonomy
Chen Weifeng Hong Shuyin Zhao Xiuling
（Fenghua Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Ningbo 315500）
Abstract: As complementation to 16S rDNA, some housekeeping genes encoding important proteins are chosen as molecular markers in
systematic bacterial taxonomy. Protein-coding genes have significant effect in the identification of closely related strains because of advantages
such as strong ability to distinguish, high accuracy and good consistency to genome, and can achieve even better results when combined with
other classification markers. In this paper, the application of protein-coding genes in bacterial classification and relevant technologies were
introduced, and the future prospects for the development of this tool were prospected.
Key words: Protein-coding gene Taxonomy marker Identification of closely related strains
根据现代微生物分类学的观点，细菌的“种”
指的是一群在遗传上相近、具有很多共同特征的菌
株［1］。细菌分类研究需要有合适的工具来衡量基因
组之间的相近程度。DNA 杂交技术是其中最权威的
方法，也是目前细菌物种定义的金标准。但 DNA 杂
交工作量大，耗时长，影响因素多，重复性较差，
不适合作为日常的分析工具。因而研究人员又寻求
使用特定的 DNA 序列分析来研究基因组间的关系。
随着测序技术的快速发展，序列分析方法以其快速、
廉价、技术要求低和重复性好等优势在分类研究中
得到日益广泛的应用。
16S rRNA 基因（16S rDNA）是这些序列标记中
最典型的代表，也是现代微生物分类学的基石之一。
但在应用中也发现 16S rDNA 存在近缘菌株分辨力
差、与基因组相关程度低等不足。一些编码重要蛋
白的看家基因，如 gyrB（促旋酶 B 亚基基因）、rpoB
（RNA 聚合酶 β 亚基基因）等，由于具有更好的分
辨能力和准确性，特别适用于相近分类单元间的鉴
别，已经在一些细菌类群中取得了较好的应用效果。
本文介绍了这类蛋白编码基因的特点和应用现状，
并对相关技术和发展前景作了探讨。
1 细菌分类分子标记的一般要求
国际微生物分类学权威机构和期刊 《Interna-
tional Journal of Systematic and Evolutionary Micro-
biology》下属负责细菌物种定义复评审的特设委员会
在 2002 年召开会议，对近 20 年来原核生物物种分
类和新种定义的新技术作了概括，会议决议鼓励和
引导研究人员在原核生物系统分类研究中使用各种
分子生物学方法，但要求所使用的方法必须与 DNA
杂交方法有很好的一致性［2］。
在此要求基础上，研究人员对用于细菌分类研
究的分子标记进行了一系列探讨和试验［3, 4］，概括
2012年第5期 43陈伟峰等 ：蛋白编码基因在细菌分类学中的应用
起来，这类分子标记需要满足以下基本要求 ：（1）
普遍存在于各种细菌且垂直同源，以保证不同细菌
之间能够相互比较 ；（2）在基因组中是唯一的，最
好是单拷贝序列，不存在相似序列 ；（3）长度适中，
既包含足够的序列信息又容易扩增测序，一般认为
长度在 900 bp-2 250 bp 之间比较合适 ；（4）该序列
能够在可接受的精度内反映出全基因组之间的关系；
（5）不存在水平转移 ；（6）包含相对的保守区和可
变区，便于设计引物和探针。其中关于序列长度的
要求可适度放宽。长度小于 900 bp 的序列由于包含
信息较少，很难准确反映基因组间的关系，不适合
作为系统分类的标记，但一些快速变异的短序列在
近缘菌株的鉴别中也有很好的效果。而序列长度超
过 2 250 bp 的基因可以选取部分片段用于分析，比
如 gyrB、rpoB 等基因片段序列已经广泛用作细菌分
类分子标记。根据这些要求，Zeigler 选取了 32 个看
家基因和 16S rDNA 作为分类标记，对来自 16 个属
的 44 株细菌的基因组进行了研究，分析了这些标记
与基因组之间的相关性［3］。Adékambiz 等［4］则通过
设置一系列条件，筛选出 ychF/rpoB/secY 这一最优
系统分类标记组合。
2 16S rDNA分子标记的应用及遇到的困难
目前广泛用于细菌分类研究的分子标记主要是
小亚单位核糖体 RNAs 基因（SSU rRNAs 基因），普
遍分布于细菌基因组中，含量丰富，易分离鉴别。
其中最具代表性的就是 16S rDNA。16S rDNA 由保守
区和可变区组成，在细菌中高度保守，是细菌系统
分类学中最常用的“分子钟”。根据 16S rDNA 的保
守区设计多套引物可成功扩增该序列［5］，使得 16S
rDNA 数据库迅速扩大起来，并成为细菌系统分类的
重要依据。其应用极大地促进了人们对原核生物丰
度、分布和功能的认识。
16S rDNA 在应用中也遇到了一些困难。16S
rDNA 的稳定性是其被选为遗传标记的重要原因。然
而，这个特点也决定了其进化速率较低，无法分辨
近缘菌株之间的进化关系，一般只能分析到属的水
平。其次，16S rDNA 的序列组成存在种内异质性
是一个重要误差来源。Clayton 等［6］对 GenBank 数
据库中的 16S rDNA 全长序列进行分析发现，在拥
有两个以上序列数据的细菌物种中，48% 物种的种
内序列差异大于 1%。16S rDNA 序列分析基于其中
某个序列或者这些序列的平均值。这种现象使得相
近菌株的归属变得模糊甚至混淆，如在嗜盐古菌目
（Halobacteriales）中，16S rDNA 的种内序列异质性
（>5%）甚至可以影响属的划分［7］。另外，16S rDNA
与基因组间的相关程度较低。在 Zeigler［3］的模型中，
16S rDNA 序列与细菌基因组序列之间的相关系数仅
为 0.536，远低于其他 32 个看家基因的分析结果。
这些原因使得以 16S rDNA 在实际应用中受到很多限
制，无法精确地描述微生物群落，特别是近缘菌株
之间的关系。
3 蛋白编码基因分子标记
3.1 蛋白编码基因作为细菌分类分子标记的优势
为弥补 16s rDNA 的不足，近年来，人们开始
尝试使用一些重要且分布广泛的蛋白编码基因作为
遗传标记进行分类研究，如 rpoB、gyrA（促旋酶 A
亚基基因）和 gyrB 等。这些基因与 16S rDNA 类似，
具有保守区和可变区，且一般都是看家基因，不易
出现水平转移。相比 16S rDNA，这些蛋白编码基因
有以下优势 ：（1）蛋白编码基因进化速率快，分辨
能力强。在核苷酸序列水平上，由于蛋白编码基因
允许密码子的第一位和第三位发生同义突变，使得
其序列的变异更加丰富。16S rDNA 的碱基变换速率
约为每 5 000 万年变化 1%，而蛋白编码基因的进化
速率则要快很多，约为每100万年变化0.7%-0.8%［8］。
不同细菌的蛋白编码基因序列差异比较显著，能有
效区分近缘菌株之间的进化关系。（2）蛋白编码基
因一般为单拷贝基因，不存在由种内序列异质性引
起的偏差，而且特别适用于定量分析。（3）蛋白编
码基因与基因组之间相关度高。Zeigler［3］的模型表
明，选取的 32 个看家基因与基因组的相关系数均高
于 16S rDNA，其中 recN（DNA 修复蛋白 RecN 基因）、
dnaX（DNA 聚合酶Ⅲ的 τ 亚基基因）等 8 个基因与
基因组的相关系数更是大于 0.9，能够比较真实地反
映细菌基因组之间的进化关系。（4）蛋白编码基因
也可转换为氨基酸序列进行分析。在解释较高分类
层次上的系统发育关系时，如界或门的相互关系，
可以将基因序列翻译成氨基酸序列进行比较，以剔
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期44
除密码子替代饱和的问题。
表 1 列举了常用蛋白编码基因分子标记在细菌
分类和鉴定中的应用。
3.2 多种分子标记结合使用
应当看到，单一的某种分子标记，无论是 SSU
rDNA 还是各种蛋白编码基因都无法解决所有微生物
的分类问题。在实际应用中应当将各种分子标记的
功能特点结合起来。到目前为止，在属和更高的层
次上，16S rDNA 依然是最有效的分析工具［2］。可以
先通过 16S rDNA 序列分析将目标缩小到属或更小的
分类单元中，再有针对性地选取蛋白编码基因或其
他分子标记进行细节分析。不仅如此，各种蛋白编
码基因也可以结合起来使用。事实上，各种蛋白编
码基因描绘的进化树之间往往存在一定差异，每一
类基因都会有容易区分的类群和不容易区分的类群。
在实际应用中，需要合理设计，综合考虑各种基因
的有效适用范围，适当选取基因标记。前述“特设
委员会”也将这种多位点序列分型方法（multilocus
sequence typing，MLST）列为细菌鉴别的依据之一，
要求一个可靠的系统发育分析应当得到至少 5 个看
家基因的支持［2］。另外，Zeigler［3］的模型分析也表
明多种基因标记结合模型与全基因组之间具有很好
的相关性。例如，recN/thdF 和 recN/thdF/rpoA 这两
组基因组合模型与基因组的相关系数分别高达 0.986
和 0.989。
以分枝杆菌属（Mycobacterium）为例说明多种
分子标记结合的系统进化分析。Devulder 等［41］利
用 16S rDNA 和 hsp65、rpoB 和 sod 序列对分枝杆菌
属的 96 个模式种做了系统进化分析。16S rDNA 分
析能很好地展示该属的系统进化框架，清晰地将所
有菌株划分为快速生长类群和缓慢生长类群。但是
不少邻近菌株之间无法有效区分，且只有 35% 的
节点 bootstrap 值大于 50%，可信度不够高。他们将
上述 4 个标记的序列“串联”成一个“合并序列”，
以这个合并序列构建的进化树能够清晰地区分出几
乎每一个种（除结核分枝杆菌类群（M. tuberculosis
complex）的 6 个种）。再结合 Niemann 等［42］用 gyrB
对结核分枝杆菌类群内的详细结构的分析结果，就
能够通过序列分析将所有的种区分开。Devulder 等
将 16S rDNA、hsp65、rpoB、sod 和 gyrB 的分析结果
综合在一起，形成完整的系统进化树，每个节点至
少有两个基因的数据作支持，bootstrap 值大于 50%
的节点增加到 60.5%，结果具有较高的可信度。
表 1 常用蛋白编码基因分子标记及应用举例
蛋白编码基因 产物 细菌分类应用举例
gyrA 促旋酶 A 亚基 芽孢杆菌属［9, 10］，克雷伯氏菌属［11］
gyrB 促旋酶 B 亚基 弧菌属［12］，枯草芽孢杆菌类群［13］，肠杆菌科［14］，慢生长类分枝杆菌［15］，气单胞菌属［16］
rpoA RNA 聚合酶 α 亚基 肺炎链球菌及相近菌株［17］，乳杆菌属［18］
rpoB RNA 聚合酶 β 亚基 葡萄球菌属［19］，芽孢杆菌属［20］，放线菌属和北里孢菌属［21］，假单胞菌属［22］，弧菌属［23］，变形杆
菌属、摩根氏菌和普罗威登斯菌属［24］，棒杆菌属［25］
rpoD RNA 聚合酶 σ 亚基 假单胞菌属［26］，伯克霍尔德氏菌属［27］，弗兰克氏菌［28］
recA DNA 修复蛋白 RecA 丙酸杆菌属［29］，苍白杆菌属和布鲁杆菌属［30］，弧菌科［31］
recN DNA 修复蛋白 RecN 拟无枝酸菌属［32］，明串珠菌科［33］，地芽孢杆菌［34］
hsp65 热休克蛋白 Hsp65 分枝杆菌属［35］，诺卡氏菌属［36］
hsp70（dnaK） 热休克蛋白 Hsp70 根瘤菌属［37］
sod 超氧化物歧化酶 梭菌属［38］
tuf 延伸因子（EF-Tu） 乳杆菌属和双歧杆菌属［39］，链球菌属［40］
4 蛋白编码基因分子标记在相关技术中的
应用
16S rDNA 分子标记对微生物分类、遗传和生
态等各方面的研究起了极大的促进作用，围绕 16S
rDNA 而发明的各种分子生物学技术日新月异。原
则上，这些技术通过适当的改进都可以应用于蛋白
2012年第5期 45陈伟峰等 ：蛋白编码基因在细菌分类学中的应用
编码基因。在技术的移植中应当充分发挥蛋白编码
基因的高分辨力和准确性，解决基因含量低、引物
和探针设计较为复杂等问题。例如，16S rDNA 在
细胞中含量高而稳定，能够直接通过荧光原位杂交
（fluorescent in situ hybridization，FISH）观察细胞的
分布和生长发育。蛋白编码基因含量则很低，无法
直接应用荧光原位杂交技术。但通过改进方法，使
用灵敏度更高的催化报告累积—荧光原位杂交技
术（catalyzed reporter deposition - fluorescence in situ
hybridization，CARD-FISH），就能够将原位杂交检
测技术用于蛋白编码基因［43］。这里介绍两个能够较
好发挥蛋白编码基因优势的应用技术。
4.1 DGGE/TGGE电泳技术
变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel elec-
trophoresis，DGGE）是 DNA 指纹分析法中的一种，
最先是用于分析遗传突变的。1993 年，Muyzer 等［44］
首次用来研究自然环境微生物群落的多样性与群落
结构之后，该分析法就越来越广泛地用于微生物
分子生态学研究。温度梯度凝胶电泳（temperature
gradient gel electrophoresis，TGGE）是在 DGGE 的基
础之上发展起来的。DGGE/TGGE 技术在普通聚丙
烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）
梯度或是温度梯度，能够把同样长度但序列不同的
DNA 片段区分开来。一个特定的 DNA 片段有其特
有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解
链行为。在电泳过程中，变性剂浓度逐渐增加或温
度逐渐升高，当达到解链区域的最低解链条件时，
该区域的一段连续的碱基对发生解链，DNA 片段的
构象发生变化，导致迁移率的急剧下降。不同序列
的双链 DNA 片段其解链区域及解链条件不一样，因
而能够在 DGGE/TGGE 电泳中表现为不同的条带。
DGGE/TGGE 技术中最常用的分子标记是 16S
rDNA。16S rDNA PCR-DGGE/TGGE 被广泛用于微生
物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为
研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
例如，Luca 等［45］用 16S rDNA PCR-DGGE 方法监测
在意大利香肠自然发酵过程中微生物群落结构的变
化。由于 16S rDNA 种内序列异质性的广泛存在，所
以在 DGGE/TGGE 电泳图中，一种细菌的 16S rDNA
往往会表现为一组条带。因而在复杂样品的研究中，
很难在 DGGE/TGGE 图谱中辨别出各条带的归属。
而蛋白编码基因一般为单拷贝，不存在种内异质性，
因而一种细菌的某个蛋白编码基因在 DGGE/TGGE
图谱中只表现为一个条带，而且条带的浓度可以直
观地反映出该种细菌的含量。这些优点促使蛋白编
码基因在 DGGE/TGGE 技术中得以大量应用［46-48］。
例如，Mota 等［48］利用 rpoB-PCR-DGGE 对不同土壤
样品中的类芽孢杆菌属（Paenibacillus）进行了研究
和比较。在他们的研究中，首先 PCR 扩增 27 株类
芽孢杆菌模式菌株的 rpoB 片段，进行测序和 DGGE
电泳获得标准序列和图谱。提取不同土样中的总
DNA，分别扩增 rpoB 片段进行 DGGE 电泳，并与模
式菌株的标准条带比较，从条带的数量和亮度可以
判断出各样品中类芽孢杆菌的分布情况。
4.2 基因芯片技术
基因芯片是一种高通量检测技术，可以在面积
较小的载体上实现对多种目标基因的同时检测。基
因芯片又称为微点阵或微阵列，基本构件是 DNA 片
段或寡核苷酸组成的芯片或微点阵。该芯片把大量
寡核苷酸或 DNA 片段精确排列在固相载体上（硅片、
玻璃片、聚丙稀或尼龙膜等），用不同的荧光染料标
记作为探针，探针混合后与芯片上的 DNA 片段或寡
核苷酸进行杂交，再用不同波长荧光扫描芯片，经
过软件处理，得出每个点在不同波长的荧光强度值
及其比值，同时在计算机上给出直观的显色图［49］。
基因芯片检测需要合适的序列作为靶分子，
SSU rRNAs 基因是一类很重要的靶分子。由于 rRNA
基因高度保守，序列差异小，在测试近缘菌株时容
易出现交叉反应，很难完全区分目标。蛋白编码基
因进化速率比 rRNA 要快得多，区分能力更强，因
而适合作为基因芯片靶分子，且不容易出现交叉反
应。例如，对分枝杆菌的检测。Troesch 等［50］采用
16S rDNA 序列构建的探针阵列不能区别相近的分枝
杆菌菌种 ；李洪敏等［51］用 rpoB 为靶分子的基因芯
片技术快速鉴定分枝杆菌，鉴定能够达到种的水平，
基本未出现交叉反应。
基因微阵列检测方法的敏感性与 PCR 检测方法
接近，错误较少，特别是可以同时分析几种细菌，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期46
明确是否双重感染。将蛋白编码基因的高分辨力与
基因芯片的高通量优势相结合，具有广阔的应用
前景。
5 展望
同时也应当看到，蛋白编码基因作为遗传分子
标记，与 16S rDNA 相比也存在一些不足。蛋白编码
基因长期的进化过程中形成的密码子替代在增加了
变异性的同时，也使细菌通用的引物或探针的设计
变得困难。常见的一些引物往往只适用于一个属或
类群内的菌株。另外，蛋白编码基因的拷贝数不及
16S rDNA，使得一些灵敏度不够高的检测方法无法
直接移植到蛋白编码基因中应用。而且，尽管已经
建立了一些蛋白编码基因的序列数据库，但与 16S
rDNA 序列数据量相比还差很多。因此，16S rDNA
和蛋白编码基因各有优缺点。16S rDNA 适于描述较
远系统发育关系（属以上相互关系），蛋白编码基因
更适于属内近缘关系的研究。
蛋白编码基因已经被列为原核生物分类和新种
定义的工具之一［2］。要充分发挥蛋白编码基因在微
生物学研究中的作用，首先是要将 16S rDNA 相关分
子生物学技术经过适当的改进，有选择地应用于蛋
白编码基因。二是需要获得尽可能多的各种蛋白编
码基因序列，建立基因序列库，收集各属或各类群
的通用引物和探针、常用分析片段等常规数据。三
是用多基因分析方法形成一系列具有较高可信度的
系统进化标准数据，作为一个权威的分类依据。做
好这些工作，蛋白编码基因也能够像 16S rDNA 那样，
建立起庞大的数据库和通用分析手段，便于不同的
研究者之间的交流和比较，获得更加广泛的应用和
认可。
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（责任编辑 狄艳红）