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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期
苹果锈果类病毒属（Apscaviroid）属于马铃薯纺
锤形块茎类病毒科（Pospiviroidae），根据国际病毒
分类委员会（International Committee on Taxonomy of
Viruses，ICTV）第九次分类报告，该属包括苹果锈
果类病毒（Apple scar skin viroid，ASSVd）、苹果凹类
病毒（Apple dimple fruit viroid，ADFVd）、柑橘曲叶
类病毒（Citrus bent leaf viroid，CBLVd）、澳洲葡萄
类病毒（Australian grapevine viroid，AGVd）、柑橘矮
化类病毒（Citrus dwarfing viroid，CDVd ；又名柑橘
类病毒 III，Citrus viroid III，CiVd III）、柑橘类病毒
V（Citrus viroid V，CVd-V）、柑橘类病毒 VI（Citrus
viroid VI，CVd-VI）、葡萄黄点类病毒 1（Grapevine
yellow speckle viroid 1，GYSVd-1）、葡萄黄点类病毒 2
（Grapevine yellow speckle viroid 2，GYSVd-2）及梨疱
收稿日期 ：2012-08-01
基金项目 ：国家质检总局科技计划项目（2010IK278），质检公益性行业科研专项资助项目（201010256，20111035，201210214）
作者简介 ：张永江，男，博士，副研究员，研究方向 ：植物检疫 ；E-mail ：zhangyjpvi@yeah.net
苹果锈果类病毒属属级寡核苷酸芯片筛查方法的建立
张永江1  辛言言1  朱水芳1  李世访2
（1. 中国检验检疫科学研究院，北京 100029 ；2. 中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193）
摘 要 ： 苹果锈果类病毒属是重要的植物类病毒属，目前尚无有效的筛查方法。通过对该属类病毒的核苷酸序列进行分析
筛选，设计了 35 条用于该属类病毒筛查的属级特异性探针并制备了寡核苷酸芯片。应用苹果锈果类病毒及柑橘矮化类病毒标准样
品对该芯片进行验证，结果表明所建立的属级芯片可以获得有效的杂交信号，其灵敏度与 RT-PCR 电泳法相当。该芯片可用于苹
果锈果类病毒属类病毒的筛查，为该属类病毒的检疫与防控提供技术支撑。
关键词 ： 苹果锈果类病毒属 属级探针 寡核苷酸芯片
Establishment of the Screening Oligonucleotide Microarray of
Apscaviroid in Genus Level
Zhang Yongjiang1 Xin Yanyan1 Zhu Shuifang1 Li Shifang2
（1. Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029 ；2. Institute of Plant Protection，CAAS，Beijing 100193）
Abstract:  Apscaviroid is a significant plant viroid genus and has not screening method available at present. For the establishment of the
screening oligonucleotide microarray of Apscaviroid in genus level, thirty-five genus specific probes from the sequences of Apscaviroid viroid were
designed. Microarray was constructed based on these probes and identificated with Apple scar skin viroid and Citrus dwarfing viroid standard
samples. Results showed a high specificity for detection of Apscaviroid viroid and the same detection sensitivity with RT-PCR. The microarray
can be used to screen and provide technical support of quarantine and control for Apscaviroid viroid.
Key words:  Apscaviroid Genus level probe Oligonucleotide microarray
状溃疡类病毒（Pear blister canker viroid，PBCVd）等
10 种类病毒［1］。该属的类病毒可侵染苹果、梨、桃子、
柑橘及葡萄等多种重要的果树。苹果锈果类病毒侵
染苹果可引起锈果病导致果实变扁、花脸、畸形和
裂果，是苹果生产中毁灭性的病害之一［2，3］；葡萄
黄点类病毒则导致葡萄病株叶片黄色斑点或形状不
规则的黄色班块，造成葡萄大量减产［4］；柑橘类病
毒导致树势减弱，产量降低［5］；梨疱状溃疡类病毒
危害梨树，导致其产量和品质下降，严重时可引起
果树急剧衰退，提早枯死而绝收，给果树生产带来
很大的影响［6］。该属类病毒可通过种子、嫁接、生
产工具及介体等多种途径传播，而且其寄主在我国
广泛种植，因此一旦建立初侵染源，很容易在果园
中扩散传播，病情逐年加重并成为全株永久性病害，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期152
必须清除病株才能控制病害的蔓延 ；该病毒会使果
实商品价值大大降低，不但严重影响果农收入，同
时也制约了我国水果产业的健康发展。为有效防止
该属类病毒的传播扩散，除了加强种苗监管及田间
管理措施外，有效的检测筛查技术也是必要的手段。
目前已有指示植物法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、
核酸斑点杂交法及 RT-PCR 等多种技术用于该属类
病毒的检测。在国内，马先锋等［5］采用指示植物法
及 RT-PCR 技术对湖南省柑橘类样品中的柑橘类病
毒 III 进行了检测 ；赵英等［7］采用斑点杂交法成功
检测到新疆库尔勒香梨上的苹果锈果类病毒，还采
用常规 RT-PCR、原位 RT-PCR 及斑点杂交技术在国
内首次成功的从苹果树中检测到了苹果凹类病毒［8］；
吴玉鹏等［9］首次采用 RT-PCR 技术对新疆库尔勒地
区香梨泡状溃疡类病毒进行了检测，结果表明该技
术可用于果树无毒苗的生产及种质资源的交流。国
际上，Sipahioglu 等［10］建立了苹果锈果类病毒的常
规 RT-PCR 检测技术并应用于土耳其部分商业果园
中该病毒的分布调查，在 263 份苹果样品中检测到
121 份呈阳性 ；Rizza 等［11］采用 SYBR Green I 实时
RT-PCR 技术成功检测了意大利枳苗中的柑桔类病
毒 III ；Hassen 等［6］ 首次采用 RT-PCR 技术从突尼
斯果树中检测到梨疱状溃疡类病毒。另外还有 RT-
PCR-ELISA 用于苹果锈果类病毒、苹果凹类病毒及
梨疱状溃疡类病毒的检测［12］；多重 PCR 技术用于
柑桔曲叶类病毒及柑橘矮化类病毒［13，14］，澳洲葡萄
类病毒、葡萄黄点类病毒 1 及葡萄黄点类病毒 2［15］，
苹果锈果类病毒、苹果凹类病毒及梨疱状溃疡类病
毒［16，17］的检测。上述检测方法在苹果锈果类病毒
属类病毒的检测中起到了重要的作用，然而这些方
法通量低，一次只能检测样品中的一种或几种类病
毒 ；而且属于特异性检测，无法对变异大且变异位
点多的类病毒进行检测 ；特别是对于该属内可能出
现的新种，缺乏有效的筛查能力，所以在检疫中容
易造成类病毒漏检进而造成传播扩散，导致巨大的
经济损失和不良的社会影响。
为了弥补上述技术的缺陷，国内外研究人员开
展了广谱性高通量筛查技术的研究，结果表明，从
病原物较高的分类水平上进行筛查，可以有效提高
新发病原微生物的筛查效果 ；同时可以结合芯片的
高通量特点，从而大大提高筛查的效率。如 Zhang
等［18］在 2010 年建立的植物病毒属级寡核苷酸芯片
可以有效筛查到植物样品中未知的新病毒。报道的
结果表明了这种属级水平芯片技术的实用性，但目
前还没有关于苹果锈果类病毒属筛查芯片的报道，
本研究希望通过开展该项研究来建立该类病毒属属
级水平上的筛查芯片体系。
1 材料与方法
1.1 材料
苹果锈果类病毒及柑橘矮化类病毒阳性材料分
别来自中国农业科学院植物保护研究所分子植物病
理研究室及湖南农业大学国家柑橘改良中心长沙分
中心。
核酸提取试剂 Trizol 及 9N 随机引物为 Invitrogen
产品；ExTaq DNA 聚合酶、M-MLV 反转录酶、dNTP、
RNasin 为 大 连 TaKaRa 公 司 产 品 ；CbcScript 酶 为
AMBION 公司产品 ；RNA 及 DNA 纯化试剂盒购自
MN 公司。
1.2 方法
1.2.1 RT-PCR 体系 用于扩增柑橘矮化类病毒的
引物及扩增程序参照马先锋等［5］的方法 ；用于扩增
苹果锈果类病毒的引物及扩增程序参照苏前富等［19］
的方法。
总 RNA 提取 ：使用 Trizol 试剂，按说明书进行。
反转录 ：体系 20 μL，DEPC-H2O 10 μL、dNTP
1 μL、下游引物 2 μL、RNA 模板 1 μL ；70℃反应 5
min， 冰 上 放 置 5 min ；加 入 M-MLV 酶 5×buffer 4
μL、M-MLV 酶 1 μL、RNA 酶抑制剂 1 μL，42℃反
应 1 h。
PCR 扩增 ：在 0.2 mL 的反应管中加入 cDNA 产
物 2 μL、上游引物 0.5 μL、下游引物 0.5 μL、dNTP
0.5 μL、Taq 酶 0.5 μL、PCR 缓 冲 液 2 μL 及 DEPC-
H2O 14 μL，然后按照 PCR 反应程序进行扩增，产物
进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2 芯片体系
1.2.2.1 探针设计 从美国国立生物技术信息中心
（NCBI）及国际病毒学分类委员会（ICTV）数据库
下载核酸序列 ；去除 90% 以上长度与其他序列有
95% 相似度的核酸序列 ；以 5 个碱基作为间隔，连
2013年第2期 153张永江等 ：苹果锈果类病毒属属级寡核苷酸芯片筛查方法的建立
续提取所有 40 mer 的核酸序列 ；以 40% ≤ G+C 含
量≤ 60%、单个碱基含量≤ 50%、连续重复碱基数
目≤ 4，且无＞ 6 个碱基的发卡结构为标准对核酸
序列进行筛选，并在 NCBI 数据库中进行同源性比
较以保证所获得探针的特异性。
1.2.2.2 样 品 标 记 在 0.2 mL PCR 管 中 加 入 PCR
产 物 5 μL、9N 随 机 引 物 2 μL、DEPC-H2O 12 μL，
95℃变性 3 min，冰浴 5 min。然后向反应管中加入
10×Klenow 酶缓冲液 2.5 μL、dNTP 2 μL、cy3-dCTP
0.5 μL、Klenow 酶 1 μL。37℃反应 1.5 h，70℃变性
5 min，冰浴 5 min。
1.2.2.3 芯片杂交 包括 2.4 μL SSC（终浓度 3×）、
0.32 μL SDS（终浓度 0.2%）、4 μL 甲酰胺（终浓度
25%）、1.6 μL Denhardt’s（终浓度 5×）和标记样品
7.68 μL。95℃变性 3 min，冰浴 5 min，瞬时离心。
将杂交液加到芯片上，盖好盖玻片，42℃水浴杂交
过夜。
1.2.2.4 芯片洗涤 杂交结束后，将芯片转移到盛
有 42℃洗液 I（2×SSC，0.2% SDS）和 II（0.2×SSC）
的清洗盒中清洗 ；然后 2 000 r/min 离心 1 min，除去
芯片表面的液体。
1.2.2.5 芯片分析 在扫描仪中用 532 nm 通道扫描
分析，探针的信号值为探针前景值的中位值减去背
景值的中位值。信噪比（Signal to Noise Ratio，SNR）
为图像对应点内所有信号值的中位值与背景值中位
值的比值。样品中若至少一条探针的信号值≥ 600
且信噪比≥ 3，判为阳性（为苹果锈果类病毒属类
病毒侵染）；探针的信号值＜ 600 且信噪比＜ 2，判
为阴性（不为苹果锈果类病毒属类病毒侵染）；其余
情况判为可疑，需重复验证。
1.2.3 芯片探针有效性验证 为了验证所设计探针
的有效性，即探针是否能够与荧光标记产物杂交。
如能杂交，其杂交的信号值是否能够满足分析的要
求，分别取苹果锈果类病毒及柑橘矮化类病毒的
RNA 作为模板，按照 1.2.1 的方法进行扩增，将扩
增产物按照 1.2.2 的方法进行标记、杂交及检测，最
后通过所获得的数据来分析探针的有效性。
1.2.4 芯片与 RT-PCR 灵敏度比较试验 将苹果锈
果类病毒的总 RNA 进行 10 倍梯度稀释后用作模板，
分别按照 1.2.1 和 1.2.2 的方法进行芯片与 RT-PCR
检测，通过两种方法能够检测到的总 RNA 最低稀释
倍数来比较两者的灵敏度。
2 结果
2.1 芯片制备
采用生物信息学方法分析苹果锈果类病毒属
类病毒的核苷酸序列，根据设定的探针设计原则，
设 计 了 35 条 40 mer 的 属 级 特 异 性 寡 核 苷 酸 探 针
（具体探针序列已申请国家专利，专利申请号为 ：
201210193394.8），探针 5 端用氨基修饰。将寡核苷
酸探针通过芯片点样仪点制到醛基基片上，矩阵为
10×12（图 1），包括 4 个部分 ：Hex 为芯片固定阳
性质控，PC 为杂交阳性质控，NC 为杂交阴性质控，
其他位点为检测探针 ；芯片使用的固相载体为醛基
玻片。
图 1 芯片矩阵示意图
2.2 芯片探针有效性验证
应用苹果锈果类病毒及柑橘矮化类病毒的样品
对芯片探针进行验证，芯片杂交结果如图 2 及图 3
所示。图 2 中 1、4、5、6、9 及图 3 中 2、3 的信号
值均 >600，信噪比均 >3（表 1），达到进行结果判
定的标准，说明本研究建立的芯片杂交体系能够在
样品检测中获得有效的探针信号点，从而对样品中
是否含有该属类病毒进行判断。
2.3 芯片灵敏度检测结果
苹果锈果类病毒总 RNA 按 10、102 及 103 梯度
稀释后进行 cDNA 合成、Klenow 酶标记和杂交，反
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期154
应结束后对芯片进行洗涤扫描。结果如图 4 所示，
随着稀释梯度的增大，探针信号强度越来越小，103
稀释梯度已不具有可见信号点，因此该芯片的灵敏
度阈值大约是 102。具体阳性探针信号值及信噪比如
图 2 苹果锈果类病毒样品验证结果 图 3 柑橘类病毒 III 样品验证结果
表 1 芯片探针有效性验证结果
图 4 芯片灵敏度结果
10 102 103
表 2 芯片灵敏度结果
稀释梯度
10 102
探针编号 1 4 5 6 9 6
探针信号值 1152 3155 2692 1058 991 723
信噪比 4 9 8 4 4 9
结果 + + + + + +
表 2 所示。
2.4 RT-PCR灵敏度检测结果
苹果锈果类病毒总 RNA 按 10、102 及 103 梯度
稀释后进行 RT-PCR 检测，电泳结果（图 5）表明
可从阳性材料中扩增出约 330 bp 的特异性目标条带。
随着检测总 RNA 稀释倍数的增大，可以观察到明显
的浓度梯度谱带，稀释梯度限点为 102。
M 1 2 3 4 5
330
bp
图 5 RT-PCR 灵敏度检测结果
病毒种类
ASSVd CDVd
探针编号 1 4 5 6 9 2 3
探针信号值 6642 48016 14567 1892 5453 10545 3764
信噪比 19 330 41 6 16 25 8
结果 + + + + + + +
2013年第2期 155张永江等 ：苹果锈果类病毒属属级寡核苷酸芯片筛查方法的建立
3 讨论
属级筛查芯片技术是近年出现的一种用于某
类病原物筛查的技术，该技术将芯片的高通量特性
与属级探针的兼容性特点相结合，大大提高了病原
微生物筛查鉴定的能力，已在多种病原生物的筛查
中得到应用。Chou 等［20］ 对属级探针芯片进行了
有益的尝试，通过试验确证了属级芯片在新发病
毒鉴定中的作用 ；Palacios 等［21］建立了一种名为
GreeneChipPm 的传染病诊断芯片平台，包括了病毒、
细菌、真菌和寄生虫的 29 455 条探针，使用该平
台诊断出不明死因病人的病原生物为细菌。Huyghe
等［22］对细菌序列进行探针筛选，获得 9 500 余条探
针，在此基础上建立的芯片可区分混合细菌样品里
的未知细菌。Zhang 等［18］建立了 13 属植物病毒的
属级筛查芯片，发现了三七样品中的一种新病毒 ；
这些报道的结果证实了这种芯片技术的实用性。本
研究以植物类病毒为研究对象，初步建立了苹果锈
果类病毒属的属级芯片筛查技术。与以往的生物学
测定、正反向聚丙烯酰胺凝胶电泳、Northern 杂交
及 RT-PCR 等技术相比，该技术有以下优点 ：芯片
的探针是属水平上的而非目前报道中针对特定类病
毒种的特异性检测探针，具有属的特征，所以能够
兼容属内的所有类病毒 ；该技术通量高，一次反应
能够确定某一样品中是否含有该属的类病毒（包括
已知及未知的类病毒）。标准样品验证结果显示，建
立的芯片技术可得到有效的探针信号，表明了所设
计探针的有效性。
如何获得足够的标记产物以便得到有效的杂交
信号是芯片检测过程中的一个重要环节。产物标记
主要包括 3 种方式 ：样品中病原物含量足够多时，
可在随机引物进行的反转录过程中加入荧光标记的
dNTP，从而获得标记 cDNA 后直接进行杂交 ；含量
中等的病原物可采用随机引物进行反转录，在随后
的特异性引物 PCR 扩增中加入荧光标记的 dNTP ；
含量较低的病原物需要在反转录时采用特异性引物，
在 PCR 扩增时使用特异性引物或随机引物并加入荧
光标记的 dNTP。本研究的重点在于验证所设计的属
级探针的适用性，所以采用了特异性引物进行 RT-
PCR 扩增来获得标记产物，但从实际应用角度考虑，
应选择使用随机引物来获得标记产物，这需要进一
步的试验。另外，对于含量低的病原物，为了既能
获得足够的标记产物，又减少特异性扩增每种病原
物的繁琐，可以采用属级或科级简并引物来进行
PCR 扩增。
4 结论
本研究通过属级探针设计及标准样品验证，建
立了可用于苹果锈果类病毒属类病毒筛查的芯片技
术。该技术的建立将有助于主动式筛查该属已知及
未知的类病毒，为防止该属类病毒的传播扩散提供
技术支持，从而为苹果等产业的健康发展提供一定
的保障。
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（责任编辑 马鑫）