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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第11期
真核细胞中，蛋白质乙酰化是一种重要的翻
译后修饰。除了以赖氨酸为代表的氨基酸侧链乙酰
化之外，蛋白的 N-末端也可以发生 α-氨基乙酰化
（N-alpha acetylation）。研究表明 N-末端 α-氨基乙酰
化的蛋白质在哺乳动物细胞中占 80%-90%，在酵
母中约占 50%-70%［1-3］，是一种较为普遍存在的乙
收稿日期 ：2014-04-08
基金项目 ：科技部“973”项目（2011CB965303），2012 教育部新世纪优秀人才支持计划
作者简介 ：黄嘉欣，女，硕士研究生，研究方向 ：结构表观遗传学 ；E-mail ：hjx.star@163.com
通讯作者 ：李海涛，博士，教授，研究方向 ：结构表观遗传学 ；E-mail ：lht@tsinghua.edu.cn
人组蛋白 α-氨基乙酰基转移酶 Nat11 表达纯化、晶体
生长及底物结合研究
黄嘉欣 李海涛
（清华大学医学院基础医学系，北京 100086）
摘 要 ： α-氨基乙酰基转移酶 11（Nat11）催化组蛋白 H4 和 H2A 氨基端乙酰化修饰，发挥着重要的表观遗传调控功能。将
人 Nat11 基因构建到原核表达载体 pSUMO 中，转化入大肠杆菌 BL21（DE3）进行重组表达。通过镍柱亲和层析等一系列体外纯化
步骤，获得高纯度 Nat11。利用等温滴定量热法（ITC），测得 Nat11 与底物多肽微摩尔量级结合常数。利用质谱技术，发现纯化后
的 Nat11 结合有大肠杆菌内源产生的乙酰辅酶 A 或辅酶 A，在 ITC 滴定过程中可以产生对多肽底物的乙酰化修饰，表明纯化获得
的 Nat11 在溶液中具有酶活力。随后，对 Nat11 进行晶体生长研究，通过初筛优化获得蛋白截短体及底物-酶融合蛋白单晶。
关键词 ： α-氨基乙酰基转移酶 11 重组蛋白表达 蛋白聚集 酶-底物结合 晶体生长
Expression，Crystallization and Substrate Binding Studies of Human
Histone N-terminal Acetyltransferase Nat11
Huang Jiaxin Li Haitao
（Department of Basic Medical Sciences，School of Medicine，Tsinghua University，Beijing 100086）
Abstract: The alpha-amino groups of histones H4 and H2A can be acetylated by histone N-terminal acetyltransferase 11（Nat11）,
which plays an important role in epigenetic regulation. The cDNA of human Nat11 was amplified and cloned into pSUMO vector. The resultant
construct was transformed into E.coli strain BL21（DE3）for recombinant protein expression. Homogenous Nat11 was highly purified through a
series of purification procedures including nickel column affinity chromatography. Using isothermal titration calorimetry（ITC）, we measured
micromolar binding constants between Nat11 and histone H4 peptides. MALDI-TOF mass spectrometry analysis revealed that purified Nat11
was pre-bound with acetyl coenzyme A or coenzyme A that was co-purified from E.coli. After ITC titration using unmodified peptide as ligand,
N-acetylated product was detected by mass spectrometry, suggesting that the purified Nat11 is active. We performed crystallization screening and
successfully obtained single crystal of a truncate form of Nat11 and substrate-enzyme recombinant protein after optimization.
Key words: Alpha-amino acetyltransferase 11 Recombinant protein expression Protein aggregation Enzyme-substrate binding
Crystallization
酰化修饰。真核生物体内，蛋白质 N-末端乙酰化
由 α-氨基乙酰基转移酶（N-alpha acetyltransferases，
NATs）家族成员催化完成。在高等真核生物中，目
前已鉴定出 6 种 NATs 家族成员，分别为 NatA［4］、
NatB［5］、NatC［6］、NatD［7］、NatE［8］ 和 NatF［9］；其
中前 5 种在酵母中也被报道存在。NATs 能够与核糖
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期194
体结合，以一种共翻译修饰方式完成新生多肽链 N-
末端的乙酰化修饰。与此同时，尤其是在人体内，
很大一部分的 NATs 可以游离于核糖体之外存在，
发挥着共翻译修饰以外的功能。蛋白氨基端乙酰化
可以中和自由氨基端的正电荷，并引入额外的化学
修饰基团，在蛋白质降解、蛋白-蛋白和蛋白-生物
膜相互作用，以及蛋白质定位等细胞生理过程中发
挥着重要调控功能。2011 年，人们首次发现 Nat 基
因突变是一种人类遗传紊乱病——Ogden 综合症的
分子遗传学病因［10］。患这种疾病的男孩出现全身发
育延迟，而且在婴儿期就会死去，充分显示了蛋白 N-
末端乙酰化的重要性。
染色质的基本单位是核小体，每个核小体是由
核心组蛋白八聚体以及缠绕在上面的 147 个碱基对
DNA 所组成。核心组蛋白八聚体包括 H2A、H2B、
H3 和 H4 各两分子［11，12］，其中组蛋白上许多位点
能发生翻译后修饰，比如乙酰化、甲基化、磷酸化、
泛素化、SUMO 化等。这些组蛋白修饰及其组合被
宽泛的定义为一类“组蛋白密码”［13-15］，发挥重要
的基因表达和染色体结构调控作用。研究表明，组
蛋白 H2A、H2B 和 H4 的 N-末端也可以发生乙酰化
修饰，而 H3 却不发生该修饰［16］。其中，组蛋白
H2B N-末端乙酰化由 NatA 负责［17］，而组蛋白 H2A
和 H4 的 N-末端乙酰化却是由 Nat11（亦名 NatD，
Naa40p）来完成，表现出组蛋白氨基端乙酰化修饰
的底物特异性。研究表明，NatA 还能修饰除 H2B 以
外的许多蛋白质底物 ；而与 NatA 不同，Nat11 迄今
为止被发现只能特异性地修饰 H2A 和 H4［7，16，18］。
人组蛋白 H2A 和 H4 的 N-末端序列非常相似，分别
为 S1GRGKQGGK9 和 S1GRGKGGKG9，相似的序列可
能是它们都能被 Nat11 催化的分子基础。Nat11 只有
一个亚基，在细胞质中部分 Nat11 与核糖体共定位，
暗示着伴随 H2A 和 H4 的合成，新生组蛋白 H2A、
H4 多肽的 N-末端发生乙酰化修饰［13，19］。同时有试
验表明，人 Nat11 除了存在于细胞质中，在细胞核
中也有分布［7］。另外，在小鼠脑细胞中有 7% 的 H4
N-末端没有乙酰化修饰［20］，在 HeLa 细胞中也鉴定
出约 8.5% 的 H4 N-末端不带乙酰基［21］，这共同暗
示了 Nat11 在细胞核中发挥某种调控作用。最近研
究表明，H4 N-末端乙酰化会影响 H4 第 3 位精氨酸
（H4R3）的甲基化以及核糖体 DNA（ribosomal DNA，
rDNA）沉默。Nat11 缺失后，会导致 H4R3 出现非
对称二甲基化，同时 rDNA 沉默加剧［22］。由此可见，
Nat11 所催化的 H4 N-末端乙酰化具有重要的表观遗
传调控功能。
本研究表达纯化人 Nat11 进行晶体生长研究，
并利用等温滴定量法测量 Nat11 与底物多肽、产物
多肽的结合常数，旨在为进一步深入研究 Nat11 特
异识别并催化组蛋白 H2A 和 H4 N-末端乙酰化修饰
的分子结构机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验所使用的表达载体为 pSUMO10，改造于
表达载体 pET-28b，带氨基端串联 10×His-SUMO 标
签。PCR 引物合成及基因测序由 Invitrogen 公司合成；
PCR mixture 为购自 Genstar 公司 ；限制性核酸内切
酶及 T4 连接酶购自 NEB 公司 ；质粒抽提试剂盒和
琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒为康为公司 ；蛋白质
Marker、DNA Marker 购自全式金公司 ；琼脂糖购自
BIOWEST 公司 ；镍亲和层析预装柱、分子筛 HiLoad
SuperdexTM 75、脱盐柱 HiPrep 26/10 Desalting Column
购 自 GE Healthcare 公 司。 多 肽 人 H4（1-9）、 人
acH4（1-9）、人 H4（1-25），购自北京中科亚光公司。
所使用的晶体筛选试剂盒购自 Hampton Research 公
司和 Emerald Biosystems 公司 ；结晶试剂购自 Sigma-
Aldrich 公司，均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 人 Nat11 截短体及融合蛋白设计 将人 Nat11
与 RimL 进行序列比对，RimL 为原核细胞鼠伤寒沙
门菌蛋白质 N-末端乙酰基转移酶，结构已解。设计
截短体人 Nat11（21-237）和（21-223）。此外，为获
得人 Nat11 与底物 H4 的复合物结构，设计了底物-
酶融合蛋白，将人 H4 N-末端 7 肽（SGRGKGG）融
合人 Nat11（24-223）的 N-末端，即 H4（1-7）-Nat11
（24-223）融合蛋白。
1.2.2 原核表达质粒构建 以人 cDNA 库为模板，
PCR 扩增出 Nat11 全长及截短体基因，并连接到
pSUMO 载体上，转化到大肠杆菌 DH5α 感受态中，
培养单克隆，提取质粒测序，最后获得人 Nat11 全
2014年第11期 195黄嘉欣等：人组蛋白 α-氨基乙酰基转移酶 Nat11 表达纯化、晶体生长及底物结合研究
长及截短体的原核表达质粒。
1.2.3 人 Nat11 全长及截短体蛋白表达 将质粒转
化入大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞。挑取单克
隆菌落 37℃培养，至菌液 OD600 为 0.8-1.0，降温至
25℃，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至 0.2
mmol/L，过夜诱导。
1.2.4 重组蛋白镍柱亲和层析纯化 收集菌体，用
缓冲液 20 mmol/L Tris（pH8.5），500 mmol/L NaCl 重
悬，破碎后高速离心。将上清液上样到镍柱，先用
裂解缓冲液除去不结合镍柱的杂蛋白，随后逐渐提
高咪唑浓度，重组蛋白在含约 95 mmol/L 咪唑的缓
冲液中洗脱出来。蛋白溶液中加入含 6×His 标签
的重组 SUMO 蛋白酶 ULP1，4℃过夜酶切 SUMO。
Nat11 N-末端的 His-SUMO 标签蛋白会被 ULP1 切除。
1.2.5 目的蛋白与 His-SUMO、His-ULP1 分离 在
过夜酶切的蛋白溶液加入 10 mmol/L 二硫苏糖醇
（DTT）， 浓 缩， 过 脱 盐 柱 HiPrep 26/10 Desalting
Column，缓冲液为重悬缓冲液。蛋白溶液上样到镍
柱，由于目的蛋白不带有 His 标签，不结合镍柱，
因此柱流出液中含有目的蛋白，将流出液收集即可
得到目的蛋白。SUMO 及 ULP1 的 N 端带有 His 标签，
流经镍柱时会与镍柱结合，从而与目的蛋白分离。
1.2.6 分子筛进一步纯化人 Nat11 蛋白溶液 加入
新鲜 DTT 至 5 mmol/L 浓缩，上样到分子筛 HiLoad
SuperdexTM 75 中，用缓冲液 20 mmol/L HEPES（pH
7.5），100 mmol/L NaCl，2 mmol/L DTT 洗脱。280 nm
紫外分光检测蛋白质浓度，分装，在液氮中速冻，
于 -80℃保存。
1.2.7 全长蛋白晶体生长 人 Nat11 全长蛋白二聚
体 分 别 与 CoA 或 AcCoA 按 摩 尔 比 1∶3 相 混， 冰
上孵育 2 h，使用商业试剂盒 Structure Screen I、II，
Crystal Screen I、II 以及 Natrix I 进行初筛，坐滴，1
μL 蛋白混合物溶液与 1 μL 结晶试剂相混，18℃静置。
长出晶体，并对条件进行优化。
1.2.8 截 短 体 人 Nat11（21-237） 纯 化 及 晶 体 生
长 截 短 体 人 Nat11（21-237） 与 AcCoA 按 摩 尔
比 1∶3 相混，冰上孵育 2 h，筛选试剂盒 Index 和
Structure Screen I、II 时，在池液中添加新鲜 DTT 至
10 mmol/L。长出晶体后，对条件进行优化。
1.2.9 底物-酶融合蛋白晶体生长 融合蛋白 H4（1-
7）-Nat11（24-237）与 AcCoA 按摩尔比 1∶3 相混，
冰上孵育 2 h，筛选试剂盒 Index 和 Structure Screen I、
II 时。长出晶体后，对条件进行优化。
1.2.10 等温滴定量热法（ITC）测定截短体对底
物及产物结合能力 在 25℃ 1 mmol/L 底物多肽 H4
（1-9） 对 0.1 mmol/L 截 短 体 Nat11（21-223） 进 行
ITC 滴定，用于稀释多肽和蛋白的缓冲液成分为 20
mmol/L HEPES（pH7.0），100 mmol/L NaCl。
1.2.11 质谱分析 将 ITC 滴定产物和底物-酶融合
蛋白进行质谱 MALDI-TOF 分析。
2 结果
2.1 人Nat11原核表达质粒构建
pSUMO 原核表达载体改造于 pET-28b，N 端标
签是带有 10 个 His 的 SUMO 蛋白，SUMO 对于蛋白
质折叠有促进作用，能提高蛋白质的溶解度。蛋白
酶 ULP1 特异性识别 SUMO 的三维结构，并在其 C
端酶切，酶切后目的蛋白的 N-末端会残留一个氨基
酸丝氨酸。由于 H4 N-末端第一位氨基酸正是丝氨酸，
所以底物-酶融合蛋白使用 pSUMO 载体，能确保融
合蛋白中底物位点不被屏蔽。此外，Nat11 全长蛋白
很难获得单晶，因此通过与 RimL 序列比对，设计
了截短体人 Nat11（21-237）和（21-223）。
2.2 重组蛋白镍柱纯化结果
在 25℃，0.2 mmol/L IPTG 过夜诱导下，80% 重
组蛋白为可溶性表达。重组蛋白带有 His 标签，能
与镍柱结合，而杂蛋白不结合或只有微弱结合，因
此镍柱能分离重组蛋白与杂蛋白。咪唑会与重组蛋
白竞争结合镍柱，逐渐提高咪唑浓度，能将重组蛋
白洗脱下来。重组蛋白在大约 95 mmol/L 咪唑浓度
下被洗脱下来。
2.3 His-SUMO标签蛋白与目的蛋白分离
镍柱纯化后，使用 SUMO 蛋白酶 ULP1 将 Nat11
N 端 的 标 签 蛋 白 His-SUMO 切 掉。 由 于 SUMO 和
ULP1 的 N 端都有 His 标签，通过再次过镍柱，反
挂除去，进而实现目的蛋白的纯化。值得注意的是，
经过第一次镍柱纯化后，溶液中含有咪唑，会影响
His-SUMO 及 His-ULP1 结合镍柱，所以先使用脱盐
柱将咪唑除去。此外，上脱盐柱前，蛋白质浓缩时
加入 DTT，由于 DTT 会螯合镍柱上的镍离子，所以
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期196
脱盐柱缓冲液不含有 DTT。利用脱盐柱除去蛋白溶
液中的咪唑及 DTT。经 SDS-PAGE 鉴定，发现反挂
镍柱的流出液中不存在 SUMO 及 ULP1 组分，只有
目的蛋白条带。
2.4 分子筛纯化Nat11及Nat11聚集研究
利用蛋白质分子量差异，使用分子筛 HiLoad
SuperdexTM 75 进一步纯化蛋白质 Nat11。浓缩及分子
筛缓冲液中不含有还原剂时，全长蛋白过分子筛时
发现出现 3 个峰（图 1-A），根据出峰位置与蛋白分
子量的对应关系，这 3 个峰分别对应着高聚体，二
聚体和单体。经 SDS-PAGE 检测蛋白质纯度，发现
不管是二聚体蛋白还是单体蛋白，纯度都达到 95%
以上，而高聚体则存在少量大分子量的杂蛋白。由
于蛋白质分子发生聚集会导致状态不均一，进而影
响晶体生长。为解决这一问题，我们尝试改变缓冲
液 pH。使用 3 种不同 pH 的缓冲液，分别为 NaAc
（pH4.5），Bis-Tris（pH6.3） 和 HEPES（pH7.5） 发
现在不同 pH 的缓冲液中，蛋白质依旧出现聚集峰，
这说明 pH 改变并不能改善蛋白质聚集。分析 Nat11
序列发现，Nat11 全长序列中含有 10 个半胱氨酸，
可能会导致分子间交联，引起蛋白质聚集，因此在
浓缩过程加入新鲜 DTT 至 5 mmol/L，并在分子筛缓
冲液中也添加 2 mmol/L DTT。经过分子筛后，发现
高聚体和二聚体含量明显下降，单体成为主要成分
（图 1-B）。由此可见，使用还原剂 DTT 破坏二硫键
形成，能有效改善蛋白的聚集行为。
2.5 等温滴定量热法（ITC）检测Nat11对H4结合
还原剂 DTT 的存在会造成 ITC 滴定体系基线
漂移。在没有 DTT 的环境下，为尽量降低蛋白质的
聚集情况，使用新鲜纯化的截短体 Nat11（21-223）
单 体 进 行 ITC 滴 定。 分 别 使 用 底 物 H4（1-9） 多
肽和产物 acH4（1-9）多肽滴定蛋白，测量结合常
数。经后续质谱检测，发现蛋白溶液中含有 AcCoA
和 CoA，所以底物多肽滴定时会发生乙酰化反应，
另外结合的 AcCoA 可能会对产物多肽与蛋白结合
有抑制作用，所以测得的结合常数为表观结合常
数，底物多肽与蛋白的表观结合常数（Kd）为 1.1
μM ；产 物 多 肽 与 蛋 白 的 表 观 结 合 常 数 为 4.6 μM
（图 2）。
2.6 质谱结果分析
将用于进行 ITC 的蛋白溶液进行质谱分析，发
现溶液中存在 AcCoA 和 CoA（图 3-A），由于蛋白质
表达以及纯化时并没有添加 AcCoA 和 CoA，因此推
测来源于大肠杆菌，Nat11 在表达及后续纯化过程
中，一直保持结合状态。所结合的 CoA 是发生催化
反应后由 AcCoA 转变而来的，还是直接结合的，还
需要进一步确证。底物 H4（1-9）多肽滴定蛋白质
后，质谱分析发现，溶液中同时存在 H4（1-9）和
乙酰化的 H4（1-9）（图 3-B），而且只有 CoA，并没
有 AcCoA，这说明了在滴定时，发生了乙酰化反应，
与蛋白质结合的 AcCoA 被消耗完，但由于蛋白含量
少于 AcCoA，所以只有部分底物被乙酰化。此外，
产物多肽滴定蛋白质，无法发生乙酰化反应，所以
同时存在 AcCoA 和 CoA。
由于 Nat11 在表达纯化过程中结合大肠杆菌中
的 AcCoA，因此猜测底物-酶融合蛋白表达时也会结
合 AcCoA。质谱分析融合蛋白，发现只有 CoA，没
有 AcCoA，而且蛋白质的分子质量比理论分子质量
多了 42（图 3-D），为一个乙酰基的大小，这表明融
0
45 55 65 706050
200
400
600
HiLoad 16/60
SuperdexTM75
HiLoad 26/60
SuperdexTM75儈㚊փ Ҽ㚊փ অփ
200
0
100 120 140 160 180 200 220 240⍇㝡փ〟 mL ⍇㝡փ〟 mL 280nm mAU 28
0n
m
mAU
400
1
2
116
kD
45
35
25
18.4
14.4
Nat11
1 2 3 4
3
4
600
800
1000
A
B
A：在分子筛 Hiload 26/60 SuperdexTM 75 上 Nat11 洗脱峰，蛋白质出现聚集；B：
在分子筛 Hiload 16/60 SuperdexTM 75 洗脱峰。橙线，缓冲液不含 DTT ；蓝线，
缓冲液中含有 2 mmol/L DTT，DTT 显著防止蛋白质聚集（颜色标识见电子版）
图 1 人 Nat11 全长蛋白聚集情况
2014年第11期 197黄嘉欣等：人组蛋白 α-氨基乙酰基转移酶 Nat11 表达纯化、晶体生长及底物结合研究
合蛋白确实结合了大肠杆菌中的 AcCoA，并且利用
其作为底物，发生了自我乙酰化。
2.7 晶体生长
把人 Nat11 全长蛋白与 CoA 或 AcCoA 相混进行
晶体生长，可以在多个条件长出成簇针状微晶（图
4-A），但难以优化并进行衍射数据收集。为解决该
问题，尝试使用截短体 Nat11（21-237）进行晶体筛选，
最 后 在 Structure Screen I 的 第 7 号 条 件 ：0.2 mol/L
NH4Ac，0.1 mol/L Na3Citrate，pH5.6，30% PEG 4K，
10 mmol/L DTT 中长出截短体 Nat11 与 AcCoA 复合
物的片状晶体（图 4-B）。随后优化条件，最后沉淀
剂换成 30% PEG 3350，能重复出一样的晶体。在点
晶体时发现，将蛋白质与结晶试剂相混，会立刻出
现白色小颗粒状沉淀，随着沉淀剂 PEG 3350 的浓度
提高，沉淀会变严重。但 18℃静置 1 d 后，沉淀就
会消失，随后晶体长出来。
由于质谱结果（图 3-D）显示，底物-酶融合
蛋白能发生自我乙酰化，所以推测底物部分与酶结
合了，故用此融合蛋白进行晶体生长，获得复合物
结构。底物-酶融合蛋白与 AcCoA 及 CoA 混合物均
在 Structure Screen II 的 1 号 条 件 ：0.1 mol/L sodium
chloride，0.1 mol/L Bicine（pH9.0），30% PEG 550
MME 中 10 d 后长出晶体（图 4-C）。
3 讨论
在真核细胞中，蛋白质 N-末端乙酰化普遍存在，
其中核小体核心组蛋白 H2A、H2B 和 H4 都能发生
该修饰，而 H3 则不发生。特异性乙酰化 H2A 和 H4
的酶是 Nat11，人 Nat11 在细胞核中有分布，暗示着
Nat11 在细胞核中起着某种调控作用。
本试验根据序列比对及序列分析，构建 Nat11
全长蛋白、截短体以及底物-酶融合蛋白-pSUMO 原
核表达体系。经大肠杆菌表达，经过镍柱亲和层
析 初 步 纯 化，ULP1 酶 切 His-SUMO， 脱 盐 柱 除 咪
唑，二次镍柱除去 His-SUMO 及 His-ULP1，最后通
过分子筛，对蛋白质进一步纯化。使用的分子筛是
HiLoad SuperdexTM 75，分离范围为 3-70 kD。由于分
子筛对上样量的体积有要求，所以在上分子筛前需
要浓缩蛋白质。浓缩后过分子筛，发现出现蛋白质
高聚体峰，二聚体峰和单体峰，表明发生了蛋白质
聚集，而且有高聚化。通过改变分子筛缓冲液 pH 值，
发现对于聚集问题并没有改善。分析全长序列发现，
Nat11 含有 10 个半胱氨酸，聚集可能是由于分子间
产生二硫键交联，因此在浓缩时加入 5 mmol/L DTT，
并在分子筛缓冲液中加入 2 mmol/L DTT，此时发现
高聚体和二聚体含量明显下降，单体成为主要成分，
由此说明蛋白聚集是因为分子间形成二硫键，使用
还原剂能极大地改善这一现象。
从质谱结果得知，高纯度 Nat11 截短体（21-223）
溶液中含有 AcCoA 和 CoA，由于没有人为添加，所
以 AcCoA 和 CoA 均为大肠杆菌内源产生，而且在
纯化时一直与蛋白结合。Nat11 结合 AcCoA，在底
物多肽 ITC 滴定蛋白质时，发生了乙酰基转移反应。
0 10
-2.0
-1.5
μc
al
/s
ec -1.0
-0.5
0.0
H4 1-9 SGRGKGGKGA
20 30
0.0 0.5 1.51.0 2.0
-16Kd=1.1 μM
-12
-8
-4
0 kcal/m
ole of injectant
Molar Ratio
40 50 60ᰦ䰤 min
0 10
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
μc
al
/s
ec
-0.2
0.0
acH4 1-9 acSGRGKGGKGB
20 30
0.0 0.5-0.5 1.51.0 2.0 3.0 4.03.52.5
-4Kd=4.6 μM
-2
0 kcal/m
ole of injectant
Molar Ratio
40 50 60ᰦ䰤 min
A ：Nat11 截短体与底物多肽 ITC 滴定 ；B ：Nat11 截短体与产物
多肽 ITC 滴定
图 2 等温滴定量热法测量 Nat11 截短体（21-223）与底物
多肽、产物多肽的表观结合常数
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期198
100
A
80
in
te
ns
ity
%
60
40
20
0
720 756 792 828 864
mass m/z
100 H4 1-9
802.3992
acH4 1-9
844.4087
B
80
in
te
ns
ity
%
60
40
20
0
794.0 806.6 819.2 831.8 844.4
mass m/z
100
C
80
in
te
ns
ity
%
60
40
20
0
766
CoA
768.0458
CoA
768.0743
AcCoA
810.0808
772 778 784 790
mass m/z
100
D
80
in
te
ns
ity
%
60
40
20
0
10000 14000 18000 22000
acH4 1-7 -Nat11 24-223
23768.2793
26000
mass m/z
100
CoA
768.0627
E
80
in
te
ns
ity
%
60
40
20
0
750 764 778 792 806
mass m/z
A ：Nat11 截短体（21-223）溶液存在 AcCoA 和 CoA ；B ：底物多肽 ITC 滴定 Nat11 截短体后发生乙酰化反应，出
现乙酰化多肽 ；C ：底物多肽 ITC 滴定后，只存在 CoA，没有 AcCoA ；D ：纯化得到的底物-酶融合蛋白发生自我
乙酰化 ；E ：底物-酶融合蛋白溶液中只存在 CoA，没有 AcCoA
图 3 ITC 滴定体系及底物-酶融合蛋白质谱结果
2014年第11期 199黄嘉欣等：人组蛋白 α-氨基乙酰基转移酶 Nat11 表达纯化、晶体生长及底物结合研究
由于 Nat11 含量低于多肽，即与蛋白结合的 AcCoA
含量低于多肽，所以只有部分底物多肽被乙酰化，
全部 AcCoA 转化为 CoA。产物多肽滴定蛋白，没有
乙酰化反应，AcCoA 和 CoA 共存。H4 多肽对 Nat11
滴定峰为倒峰，意味着结合是放热反应。而底物多
肽滴定时发生的乙酰化反应也是放热反应，所以
ITC 量热应为两者的共同贡献，所测得的表观结合
常数 1.1 μM 应比实际结合常数大。部分 Nat11 结合
AcCoA，AcCoA 的存在可能对产物多肽结合蛋白有
抑制作用，所以测得的表观结合常数 4.6 μM 应比实
际结合常数小。从两个反应的表观结合常数可看出，
底物和产物与蛋白的实际结合常数均应为 4.6-1.1
μM 之间。后续将通过设计不影响结合的催化残基突
变体，来测定实际结合常数。
另外，质谱分析底物-酶融合蛋白溶液，发现
溶液中只含有 CoA，并且蛋白质的分子量比理论分
子量多了 42，正好是一个乙酰基的大小，因此我们
认为，融合蛋白也能在表达时结合大肠杆菌生产的
AcCoA，并且发生自身乙酰化。
4 结论
本研究成功将人 Nat11 全长，截短体及底物-酶
融合蛋白基因构建到原核表达载体，利用一系列纯
化手段，获得了高纯度 Nat11，发现还原剂 DTT 能
改善蛋白质聚集这一问题。使用高纯度 Nat11 进行
晶体生长，最后获得截短体（21-237）以及底物-
酶融合蛋白单晶。同时 ITC 测得 Nat11 与底物多肽
微摩尔量级结合常数。质谱结果显示，Nat11 及底
物-酶融合蛋白在表达纯化时会结合大肠杆菌生产的
AcCoA 及 CoA，底物-酶融合蛋白还会发生自身乙
酰化。
参 考 文 献
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A B C
A ：Nat11 全长蛋白成簇针状晶体 ；B ：Nat11 截短体（21-237）片状单晶 ；
C ：底物-酶融合蛋白单晶
图 4 Nat11 晶体生长
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期200
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（责任编辑 马鑫）