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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
3-羟 基 丙 酸（3-hydroxypropionic acid， 简 称 3-
HP），又名 β-羟基丙酸，是一种较为活泼的分子，
可以用来合成多种重要的化工产品，还可以用于生
产医药产品以及个人护理用品，所以其在商业上具
有重大的开发价值［1］。目前，3-HP 的生产方法主要
是化学合成法，然而采用化学合成法生产 3-HP 难度
较大，且产品分离纯化较复杂，生产成本相应较高。
收稿日期 ：2012-11-27
基金项目 ：陕西省教育厅访问学者项目（12JS030），陕西省科技厅访问学者项目（2011HBSZS003）
作者简介 ： 张晓梅，女，副教授，博士，研究方向 : 生物制药 ；E-mail ：hanqiaowu@sina.com
通讯作者 : 许正宏，男，教授，博士生导师 ；E-mail ：zhenghxu@163.com
产 3-羟基丙酸重组大肠杆菌 JM109 的构建及
发酵条件优化
张晓梅1，2 李新生1 许正宏2
（1. 陕西理工学院资源生物重点实验室，汉中 723001 ；2. 江南大学药学院，无锡 214122）
摘 要 ： 将编码乙醛脱氢酶编码基因 aldh 连接重组质粒 pEtac-dhaB，转化大肠杆菌，得到产 3-羟基丙酸（3-HP）重组大肠
杆菌 JM109（pEtac-dhaB-aldh），并将响应面法应用于重组大肠杆菌 JM109（pEtac-dhaB-aldh）发酵条件优化。单因素发酵试验结果
表明，影响 3-HP 产量的 4 个主要因子是初始甘油浓度，酵母膏浓度，维生素 B12 浓度以及 KH2PO4 浓度，应用响应面分析法对各
因素的最佳水平范围及其交互作用进行了研究和探讨。优化后培养基组成（g/L）：甘油 62 g/L、VB12 0.05 g/L、KH2PO4 7.4 g/L 及酵
母膏 6.2 g/L，在此培养基中 3-HP 的产量为 5.8 g/L。
关键词 ： 重组大肠杆菌 构建 3-羟基丙酸 响应面法 优化
Construction of Recombinant E. coli JM109 Capable of Producing
3-Hydroxypropionic Acid and Its Fermentation Condition Optimization
Zhang Xiaomei1，2 Li Xinsheng1 Xu Zhenghong2
（1. Key Laboratory of Biological Resources，Shaanxi University of Technology，Hanzhog 723001 ；2. School of Medicine and Pharmaceutics，
Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract: The expression vector pEtac harboring aldh gene and dhaB gene was transformed into E.coli JM109 to construct recombinant
E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）. And the response surface method（RSM）was firstly applied to determine and optimize the fermentation
condition for the novel recombinant E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）capable of producing 3- hydroxypropionic acid. A mathematical model
was then developed to show the effect of each medium composition and their interactions on the production of 3- hydroxypropionic acid. The
model estimated that, a maximal yield of 3-hydroxypropionic acid（5.4 g/L）could be obtained when the concentrations of glycerol, VB12,
yeast extract KH2PO4 were set at 62 g/L, 0.05 g/L, 6.2 g/L and 7.4 g/L, respectively. These predicted values were also verified by validation
experiments. Compared with the values obtained by other runs in the experimental design.The yield and productivity under the optimal
parameters and process can reach 5.8 g/L.
Key words: Recombinant E. coli Construction 3- hydroxypropionic acid Response surface methodology Optimization
微生物发酵法与化学法相比，具有成本低、操作简
单、条件温和、副产物少及绿色环保等优点。利
用自然筛选的微生物还无法直接进行发酵法生产
3-HP。因此，利用基因工程技术构建高产菌株被认
为是今后的研究方向［2］。
微生物转化法生产 3-HP 有两条途径 ：以大肠
杆菌为宿主菌，以葡萄糖［3-5］和甘油［6，7］为底物
2013年第6期 201张晓梅等 ：产 3-羟基丙酸重组大肠杆菌 JM109 的构建及发酵条件优化
的生物转化路线。Cameron 在专利中首次报道了甘
油能在甘油脱水酶（来源于克雷伯氏菌）的作用下
生成 3-羟基丙醛（3-HPA），后者在醛脱氢酶（来源
于酿酒酵母）的继续作用下生成 3-HP［3-5］，但是，
由于修饰系统的及启动子原因，来自于酿酒酵母的
Aldh 活性在大肠杆菌中始终较低。Raj 等［6］以 E.coli
BL21（DE3）为宿主共表达了来源于克雷白氏肺炎
杆菌（K.pneumoniae）DSM2026 的甘油脱水酶 DhaB
和来源于 E. coli K-12 MG1655 的乙醛脱氢酶 AldH，
该重组菌可以直接利用甘油生产 3-HP，但其产量仅
为 0.58 g/L，进一步优化载体及诱导条件后，3-HP
的最高产量达到 4.4 g/L［7］。最近有研究者报道了以 K.
pneumoniae 作为宿主菌，以甘油作为底物构建了产
3-HP 基因工程菌，但由于 K. pneumoniae 将更多的
甘油转化成为 1，3-丙二醇，因此 3-HP 的转化率难
以提高［8，9］。本研究室在前期构建了能转化甘油为
3-HP 的含有双质粒的重组大肠杆菌 JM109（pUCtac-
aldh，pEtac-dhaB），其 3-HP 的产量为 4.9 g/L［10］。由
于双质粒存在稳定性的问题，因此在前期研究基础
上构建了在一个质粒上串联表达两个关键酶基因的
重组质粒 pEtac-dhaB-aldh，然后转化大肠杆菌 E.coli
JM109，得到了含有单一质粒、可以利用甘油产 3-HP
的 重 组 菌 E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）， 应 用 响
应面分析法对影响重组菌 E.coli JM109（pEtac-dhaB-
adlh）发酵的各因素最佳水平范围及其交互作用进行
探讨，旨为微生物发酵法生产 3-HP 奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 和 质 粒 大 肠 杆 菌（Escherichia coli）
JM109，由本实验室保藏，质粒载体 pUCtac-aldh，
pEtac-dhaB 由本实验室先期构建和保藏［11，12］。
1.1.2 工具酶和试剂 限制性内切酶 Xba I、Pst I，
碱性磷酸酶 CIAP 购自 TaKaRa 公司 ；T4 DNA 连接
酶及 Taq DNA 聚合酶购自上海华美生物工程公司 ；
Gel Extraction Mini Kit、PCR Purification Mini Kit 购自
上海华舜生物工程有限公司。丙烯酰胺、甲叉双丙
烯酰胺、广范围蛋白质分子量标准为 Promega 公司
产品。
1.1.3 SDS-PAGE 采用 5% 浓缩胶及 12% 分离胶的
不连续垂直平板电泳，考马斯亮蓝 R-250 染色。以
大肠杆菌 JM109 作对照。
1.1.4 培养基和培养条件 LB 培养基（g/L）：蛋白
胨 10，酵母膏 5，氯化钠 10，固体培养基含 20 g/L
的琼脂，固体和液体培养基在需要时加入卡那霉素。
种子培养基 ：采用 LB 培养基。
发 酵 培 养 基（g/L）：（NH4）2SO4 2.0，MgSO4·
7H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.005，CaCl2 0.1，2 mol/L
KOH 调 pH 值 7.0。 维 生 素 B12、 甘 油、 酵 母 膏 及
KH2PO4 根据试验方案设计。发酵 ：从新鲜的 LB 培
养基斜面上挑取一环菌株接入 50 mL 摇瓶（装液量
为 10 mL）中，于旋转式摇床中 30℃、140 r/min 培
养 16 h 得到种子液。按 5% 接种量接入 500 mL 摇瓶
（装液量 50 mL）中，在 140 r/min 旋转式摇床中，培
养至 OD600 为 0.7，再加入 1 mmol/L IPTG 诱导过夜，
同时以未加入 IPTG 诱导的发酵液为对照。发酵条件
优化试验根据试验方案改变培养基及培养条件进行
发酵。
1.2 方法
1.2.1 重组菌 E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）质粒
稳定性分析 单细胞生物的细胞呈几何级数 2n 增
长，当 n=20 时，220=1.05×106，将稳定期的菌液稀
释 10-6，再将其培养到稳定期，即可认为细胞已连
续传代 20 次。具体方法如下 ：从新鲜转化平板上挑
取单菌落。接种至 2 mL 不含抗生素的 LB 中，30℃
培养 24 h，即得 20 代的菌液，以此类推，直至连续
传代至 100 代。其中每隔 20 代统计 1 次质粒丢失情
况，将上述菌液涂布于不含抗生素的 LB 板上，从
中挑选 100 个单菌落分别点在添加和不添加抗生素
的平板上，通过计数即可测得该代数的质粒稳定性。
1.2.2 测定方法 生物量用比色法检测（OD600）光
密度法检测。发酵液中 3-HP 含量的检测方法 ：采
用高效液相色谱法，其最佳 HPLC 条件 ：色谱柱
Diamonsal C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相 ：
甲醇∶水 =5∶95，加入 H3PO4 至 0.05% ；洗脱条件
为：流动相平衡 60 min，洗脱时间 20 min，流速为 0.8
mL/min ；检测器 ：紫外检测器。柱温 ：30℃。
甘油的检测方法 ：采用高效液相色谱法检测。
其最佳 HPLC 条件 ：色谱柱 ：ZORBAX NH2（5 μm，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期202
250 mm×4.6 mm）；流动相 ：乙腈和水的配比为 70 ：
30 ；流动相平衡 60 min，洗脱时间 20 min，流速为
1 mL/min ；检测器 ：示差检测器。
2 结果
2.1 重组质粒稳定性分析
用含卡那青霉素 50 μg/mL 筛选得到重组大肠杆
菌 E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）， 重 组 大 肠 杆 菌
E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）在无卡那霉素选择压
力的条件下，连续转种 5 次，统计重组大肠杆菌 E.coli
JM109（pEtac-dhaB-aldh）的菌落数。结果（表 1）显
示，传 100 代后重组大肠杆菌 E.coli JM109（pEtac-
dhaB-aldh）的质粒保持率为 82%。
表 1 重组菌 E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）连续转种
后在平板上的菌落数
传代次数 pEtac-dhaB-aldhKan（-）
20 98%
40 97%
60 91%
80 87%
100 82%
2.2 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE电泳分析
挑取 E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）接种于含
有卡那霉素 50 μg/mL 的 LB 培养基中，37℃培养至
对数后期，1 mmol/L IPTG 诱导培养 5 h，离心收集
菌体，超声波破壁，加入 1 倍的 SDS-PAGE 电泳加
样缓冲液中悬浮，100℃水浴 5 min，进样量为 10
μL，重组菌 E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）全细胞
蛋白 SDS-PAGE 电泳分析如图 1 所示。从图 1 可以
看出，其中 61、21 和 16 kD 处出现蛋白质特征带正
好对应甘油脱水酶 DHAB 三个亚基分子量的位置，
说明已经存在表达产物。另外在 54、49 和 12 kD 处
出现蛋白质特征带正好与乙醛脱氢酶酶 ALDH 蛋白
大小相符，说明表达产物中已经存在乙醛脱氢酶酶
蛋白。
2.3 重组菌的生长曲线
分 别 接 种 单 菌 落 重 组 菌 E.coli JM109（pEtac-
dhaB-aldh） 于 100 mL LB 培 养 基（ 含 卡 那 霉 素 50
μg/mL），37℃，120 r/min 培养 36 h，每隔 2 h 取一
次样，重组菌的生长曲线如图 2。根据重组菌的生
长曲线的结果，确定将重组菌 E.coli JM109（pEtac-
dhaB-aldh）的种子培养液接入发酵培养基的接种时
间确定为 16 h。
97.4
kD
1 2 3
97.4
20.1
14.4
43
1 ：E.coli JM109（pEtac）（ 对 照 ）；2 ：E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）IPTG
诱导 4 h ；3 ：蛋白质分子量标准
图 1 重组菌表达产物的 SDS-PAGE 电泳分析
图 2 重组菌 E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）生长曲线
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36
ᰦ䰤 h
O
D
60
0
2.4 单因素试验结果
2.4.1 初始甘油浓度对重组菌发酵的影响 考察重
组菌发酵甘油产 3-HP 的能力，对该重组菌在不同初
始甘油浓度 20、30、40、50、60、70 以及 80 g/L（其
中 酵 母 膏 6 g/L、KH2PO4 7.5 g/L、VB12 0.02 g/L） 的
发酵培养基中 37℃，140 r/min，发酵 48 h，结果如
图 3 所示。从图 3 可以看出，当甘油浓度在 50 g/L
时，3-HP 的产量最高可以达到 3.4 g/L。
2.4.2 维生素 B12 浓度对重组菌发酵的影响 发酵
培养基中初始甘油浓度为 50 g/L 时，考察了 VB12 的
浓度对发酵的影响，结果如图 4。从图 4 可以看出，
当 VB12 的浓度 0.05 g/L 时，培养条件为 37℃，140 r/min
培养 48 h，发酵液中 3-HP 产量 3.8 g/L。
2013年第6期 203张晓梅等 ：产 3-羟基丙酸重组大肠杆菌 JM109 的构建及发酵条件优化
0
1
2
3
4
20
0
10
20
30
40Residual glycerol
3-
H
P g
/L
30 40 50 60 70 80
Glycerol g/L
3-HP
R
es
id
ua
l g
ly
ce
ro
l g/
L
图 3 甘油浓度对重组菌发酵产 3-HP 的影响
0
1
2
3
4
0
VB12 g/L
3-
H
P g
/L
0
10
20
30
40
R
es
id
ua
l g
ly
ce
ro
l g/
L
Residual glycerol
0.02 0.05 0.08 0.1 0.12
3-HP
图 4 VB12 浓度对重组菌发酵产 3-HP 的影响
2.4.3 磷酸二氢钾浓度对重组菌发酵的影响 在初
始甘油 50 g/L，VB12 的浓度 0.05 g/L 时，培养条件为
37℃，140 r/min 培养 48 h，考察了 KH2PO4 浓度对产
3-HP 重组菌发酵结果的影响（图 5）。由图 5 可知，
当 KH2PO4 浓度为 6 g/L 时，3-HP 产量可达 4.1 g/L。
2.4.4 酵母膏浓度对重组菌发酵的影响 发酵培养
基中初始甘油浓度为 50 g/L，VB12 的浓度为 0.05 g/L，
0
1
2
3
4
5
1.5
KH2PO4 g/L
3-
H
P g
/L
0
10
20
30
R
es
id
ua
l g
ly
ce
ro
l g/
L
Residual glycerol
3 4.5 6 7.5 9 10.5
3-HP
图 5 KH2PO4 浓度对重组菌发酵产 3-HP 的影响
0
1
2
3
4
5
2 䞥⇽㞿 g/L
3-
H
P(
g/
L)
0
10
20
30
R
es
id
ua
l g
ly
ce
ro
l g/
L
Residual glycerol
3 4 5 6 7 8
3-HP
图 6 酵母膏浓度对重组菌发酵产 3-HP 的影响
KH2PO4 浓度为 6 g/L 时，培养条件为 37℃，140 r/min
培养 48 h，考察了酵母膏浓度对重组菌发酵产 3-HP
的影响。由图 6 可看出，当酵母膏浓度为 5 g/L 时，
3-HP 的产量达到 4.5 g/L。但是随着酵母膏浓度的增
大，3-HP 的产量逐渐下降，分析原因可能是由于酵
母膏浓度增大导致菌体生长和其他代谢产物的形成。
因此，合适的酵母膏浓度对于维持重组菌 3-HP 的较
高产量水平也是至关重要的。
2.5 响应面分析（RSA）试验设计
单因素发酵结果表明 3-HP 的含量主要取决于
底物甘油的浓度，甘油脱水酶辅酶 VB12 的浓度，
KH2PO4 及氮源酵母膏的浓度，进一步采用响应面分
析的方法考察 4 个因素间的交互影响，进而提高 3-
HP 的产量。将甘油浓度，甘油脱水酶辅酶 VB12 浓
度，KH2PO4 及酵母膏的浓分别记为变量 X 1、X 2、
X 3、X 4，以 3-HP（g/L）作为响应值，记为变量 Y。
根据 Box-Behnken 的中心组成设计原理，设计了 4
因素 3 水平的响应面分析（RSA）试验，共有 27 个
试验点，依据单因素试验结果选取试验因素与水平，
见表 2 ；利用统计分析软件 Stat-Ease/Design-Expert6.
12 对试验结果进行分析。
通过二次回归的旋转中心结合设计，对这 4 个
显著因素进行寻优，以 3-HP 的产量为响应值，对应
于因变量 Y 。运行 SAS 软件得到试验设计表及试验
结果如表 3 所示。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期204
SAS 分析所得到的拟合全变量二次回归方程各
变量的偏回归系数估计值及方差分析结果见表 4 及
表 5。
当显著性检验 P<0.05 时，经 SAS 分析 X1，X3，
X4，X1
2，X2
2，X2X3，X3
2，X4
2 的 P 值均小于 0.05（表
5 中带有 * 标记），因此全变量二次回归方程为 ：
Y=4.91+1.215* X1+0.26* X3 + 0.181*X4 -2.2* X1
2
表 2 因素与水平取值表
变量
变量编码值对应浓度（g/L）
-1 0 1
Glycerol（X1） 10 50 90
VB12（X2） 0 0.05 0.1
KH2PO4（X3） 3 6 9
Yeast extract（X4） 1 5 9
表 3 响应面设计表及试验结果
试验号
变量 3-HP（g/L）
X1 X2 X3 X4 试验值
1 -1 -1 0 0 0.10
2 -1 1 0 0 0.07
3 1 -1 0 0 2.20
4 1 1 0 0 2.91
5 0 0 -1 -1 2.81
6 0 0 -1 1 2.93
7 0 0 1 -1 3.13
8 0 0 1 1 4.31
9 -1 0 0 -1 0.25
10 -1 0 0 1 0.11
11 1 0 0 -1 2.47
12 1 0 0 1 2.63
13 0 -1 -1 0 2.27
14 0 -1 1 0 3.25
15 0 1 -1 0 3.40
16 0 1 1 0 2.83
17 -1 0 -1 0 0.09
18 -1 0 1 0 0.29
19 1 0 -1 0 2.24
20 1 0 1 0 3.05
21 0 -1 0 -1 2.71
22 0 -1 0 1 3.1
23 0 1 0 -1 2.5
24 0 1 0 1 2.97
25 0 0 0 0 4.11
26 0 0 0 0 4.09
27 0 0 0 0 4.15
表 4 方差分析表
误差来源 自由度 利差平方和 均方 F- 值 P>F
Linear 4 19.01 - 74.58 <0.001
Quadratic 4 26.58 - 104.26 <0.001
Crossproduct 6 1.13 - 2.96 0.0518
Total model 14 46.72 - 52.36 <0.001
Total error 12 0.76 0.064 -
变量系数（CV）= 10.4929 ；R2= 0.9839
表 5 回归方程偏回归系数的估计值
变量 自由度 回归系数 标准偏差 t 值 P>t
截距 1 4.116667 0.145753 28.24 <0.0001*
X1 1 1.215000 0.072877 16.67 <0.0001*
X2 1 0.086667 0.072877 1.19 0.2574
X3 1 0.260000 0.072877 3.57 0.0039*
X4 1 0.181667 0.072877 2.49 0.0283*
X1
2 1 -2.200417 0.109315 -20.13 <0.0001*
X1X2 1 0.182500 0.126226 1.45 0.1738
X2
2 1 -0.712917 0.109315 -6.52 <0.0001*
X1X3 1 0.152500 0.126226 1.21 0.2503
X2X3 1 -0.387500 0.126226 -3.07 0.0097*
X3
2 1 -0.425417 0.109315 -3.89 0.0021*
X1X4 1 0.075000 0.126226 0.59 0.5634
X2X4 1 0.020000 0.126226 0.16 0.8767
X3X4 1 0.265000 0.126226 2.10 0.0576
X4
2 1 -0.510417 0.109315 -4.67 0.0005*
* ：P<0.05
-0.71* X2
2 -0.388 X2X3 -0.425 X3
2-0.510*X4
2 。
对全变量的二次回归模型进行规范分析，考察
所拟合的相应曲面形状。获得的响应面立体图如图
7-图12 所示。
图 7 显示了 KH2PO4 及酵母膏位于中心水平，
即 6 g/L 和 5 g/L 时，甘油与 VB12 对重组菌产 3-HP
性能的等高线图及响应面图。从图 7 可以看出，当
维持 VB12 的浓度在一定范围内，3-HP 的产量随着
甘油浓度的升高而增加，但到一定水平时，3-HP 的
产量随着甘油浓度的升高反而下降，当甘油浓度在
0.2-0.6（58-74 g/L），VB12 在 -0.6-0.6（0.02-0.07 g/L）
范围内，3-HP 的产量大于 4 g/L。
图 8 显示了甘油与 KH2PO4 对重组菌产 3-HP 性
能的交互影响效应，等高线的形状能反映出交互效
应的强弱的大小，圆形表示两因素交互作用不显著，
而椭圆形与之相反。从图中可以看出，当 KH2PO4
在一定范围内，3-HP 的产量随着甘油浓度的升高而
2013年第6期 205张晓梅等 ：产 3-羟基丙酸重组大肠杆菌 JM109 的构建及发酵条件优化
增加，当甘油浓度在 0.2-0.6（58-74 g/L），KH2PO4
在 -0.6-0.9（4.2-8.7 g/L）范围内，3-HP 的产量大于
4.8 g/L。
图 9 显示了甘油与酵母膏对重组菌产 3-HP 性
能的交互影响效应，从图中可以看出，当酵母膏在
一定范围内，3-HP 的产量随着甘油浓度的升高而
增加，当甘油浓度在 0.2-0.6（58-74 g/L），酵母膏
在 -0.6-0.8（2.6-8.2 g/L）范围内，3-HP 的产量大于
4.4 g/L。
图 10 显示了 VB12 与 KH2PO4 对重组菌产 3-HP
性能的交互影响效应，从图 10 的等高线图可以直观
地看出两因素的交互作用较为显著，同样从表 5 对
回归方程的显著性检验得到 VB12 与 KH2PO4 交互作
用显著（P=0.0097<0.05）。从图 10 还可以看出，当
KH2PO4 在一定范围内，3-HP 的产量随着 VB12 的升
高而增加，维持发酵培养基中足够高的 VB12 浓度，
对于保证 3-HP 产量是必需的。当 VB12 浓度在 -0.6-0.5
（0.02-0.075 g/L），KH2PO4 在 -0.4-0.9（4.8-8.7 g/L）
范围内，3-HP 的产量大于 3.9 g/L。
图 11 显示了 VB12 与酵母膏对重组菌产 3-HP
性能的交互影响效应，从图 11 可以看出，VB12 与
酵母膏的交互作用不明显，当 VB12 浓度在 -0.4-0.5
（0.03-0.075 g/L）， 酵 母 膏 在 0.3-0.6（6.2-7.4 g/L）
范围时，3-HP 的产量大于 3.9 g/L。
图 12 显示了 KH2PO4 与酵母膏对重组菌产 3-HP
性能的交互影响效应，从图 12 可以看出，当酵母膏
0.9
Y1
0.6
0.3
0.8 1.6 2.4 3.2 3.2
4
0
0.9 0.9
0.9
0.9 GLY
CER
OL
VB12
0.3 0.6 0.9
0
0
GLYCEROL
0.3
0.3
0.6
0.6
0.9
0.9
Fixed levers ：KH2PO4=0 YE=0 Fixed levers ：KH2PO4=0 YE=0
图 7 甘油与 VB12 对重组菌产 3-HP 影响的等高线图及响应面图
0.9
Y1
0.6
0.3
0.8 1.6 2.4 3.2 3.2
0.3 0.6 0.9
0
0
GLYCEROL
0.3
0.3
0.6
0.6
0.9
0.9
4
0.8
Y
1
0.9 0.9 0.9
0.9
GLY
CER
OL
VB12
Fixed levers ：VB12=0 YE=0 Fixed levers ：VB12=0 YE=0
图 8 甘油与 KH2PO4 对重组菌产 3-HP 影响的等高线图及响应面图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期206
0.9
Y1
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0.3
0.8 1.6 2.4 3.2 3.2
0.3 0.6 0.9
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0
GLYCEROL
0.3
0.3
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0.6
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Y
1Y
E
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0.9
GLY
CER
OL
YE
Fixed levers ：KH2PO4=0 VB12=0 Fixed levers ：KH2PO4=0 VB12=0
图 9 甘油与酵母膏对重组菌产 3-HP 的影响等高线图及响应面图
0.9
Y1
0.6
0.3
2.4 2.7 3 3.3 3.3
0.3 0.6 0.9
0
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0.3
0.3
0.6
0.6
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Y
1
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0.9
VB12
K
H
2P
O
4
Fixed levers ：GLYCEROL=0 YE=0 Fixed levers ：GLYCEROL=0 YE=0
图 10 VB12 与 KH2PO4 对重组菌产 3-HP 影响的等高线图及响应面图
0.9
Y1
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E
2.75 3 3.25 3.25 3 2.75
0.3 0.6 0.9
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0
VB12
0.3
0.3
0.6
0.6
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Y
1
0.9 0.9 0.9
0.9
VB12
YE
Fixed levers ：KH2PO4=0 GLYCEROL=0 Fixed levers ：KH2PO4=0 GLYCEROL=0
图 11 VB12 与酵母膏对重组菌产 3-HP 影响的等高线图及响应面图
2013年第6期 207张晓梅等 ：产 3-羟基丙酸重组大肠杆菌 JM109 的构建及发酵条件优化
浓度在 -0.4-0.7（4.84-5.8 g/L），KH2PO4 在 -0.3-0.8
（4.8-8.4 g/L）范围时，3-HP 的产量大于 4.8 g/L。对
模型方程进行典型性分析说明，模型具有稳定点，
稳定点为其最大值。培养基最优组成为：甘油 62 g/L、
VB12 0.05 g/L、KH2PO4 7.4 g/L 及酵母膏 6.2 g/L，在
此培养基中 3-HP 产量的最大估计值为 5.4 g/L。
2.6 模型的验证
以响应面试验优化得到的最佳培养基配方组成
为（g/L）：甘油 62 g/L、VB12 0.05 g/L、KH2PO4 7.4 g/L
及酵母膏 6.2 g/L ；在此培养基条件下，进行 3 次发
酵试验，发酵液中 3-HP 的浓度分别为 5.2 g/L，5.8 g/L，
5.3 g/L 与模型计算值 5.4g/L 相近似，预测值与试验
值之间的良好拟合性证实了模型的有效性及存在着
极大值点，证明响应面方法对培养基优化有效。
3 讨论
由于来源不同的质粒在同一宿主细胞中存在着
许多不定因素，对菌体的生长和外源基因的表达都
有影响，最终对产物的生成也会造成一定影响。而
质粒的稳定性是重组菌高水平发酵生产的一个基本
条件，因此将甘油代谢产 3-HP 途径中两个关键酶基
因进行串联表达，可以有效的提高重组质粒在宿主
菌中的稳定性，从而在一定程度上提高重组大肠杆
菌合成 3-HP 的能力。利用微生物发酵生产 3-HP 可
以有效避免化学合成的不利因素，从甘油到 3-HP 的
生物合成途径中，DHAB 需要 VB12 作为辅酶才能催
化甘油至 3-羟基丙醛（3-HPA）的反应 ［13］。Toraya 等［14］
研究表明，如果将与之结合的被修饰的辅酶 B12 或
VB12 与自由态辅酶 B12 进行交换，可以恢复 DHAB
的催化活性。维持发酵培养基中足够高的 VB12 浓度，
对于激活 DHAB 活性和防止因甘油导致的自杀性失
活，从而保证较高水平 3-HP 的产量是必需的，合成
途径的唯一中间产物为 3-羟基丙醛，其浓度过高将
抑制菌体的生长和甘油的代谢［15］，从而抑制 DHAB
的活性。因此，要实现 3-HP 在重组大肠杆菌的大量
积累，DHAB 的活性起着关键性作用，而如何实现
其活力的提高将是以后研究的重点。
4 结论
将编码乙醛脱氢酶编码基因 aldh 连接重组质
粒 pEtac-dhaB 转化大肠杆菌，成功构建产 3-羟基丙
酸（3-HP）重组大肠杆菌 JM109（pEtac-dhaB-aldh）。
单因素试验考察了甘油、 VB12、KH2PO4 及酵母膏
的浓度对重组菌发酵产 3-HP 的影响，进一步通过
响应面分析优化了重组菌发酵培养基，优化培养基
组成为（g/L）：甘油 62 g/L、VB12 0.05 g/L、KH2PO4
7.4 g/L 及酵母膏 6.2 g/L，在此培养基中 3-HP 的产量
为 5.8 g/L。
参 考 文 献
［1］ 张鸿达 , 刘成 , 高卫华 , 等 . 微生物发酵法生产 3-羟基丙酸的
研究进展［J］. 化工进展 , 2007, 26（1）：33-37.
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pionic acid production ［J］. Applied Microbiology and Biotechnol-
0.9
Y1
0.6
0.3
Y
E
2.75 3 3.25
0.3 0.6 0.9
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KH2PO4
0.3
0.3
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Fixed levers ：GLYCEROL=0 VB12=0 Fixed levers ：GLYCEROL=0 VB12=0
图 12 KH2PO4 与酵母膏对重组菌产 3-HP 影响的等高线图及响应面图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期208
ogy, 2009, 82（6）：995-1003.
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（责任编辑 李楠）