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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-08-09
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30660090, 31160067）, 国家公益性行业（农业）科研专项（201003021）, 云南省应用基础研究重点项
目（2008C04）, 云南省高端人才引进项目（2010CI120）, 云南省攻关项目（2010BB004）
作者简介 : 刘艳平 , 女 , 博士研究生 , 研究方向 : 植物分子生物学 ;E-mail:liuyp6789@163.com
通讯作者 : 黄兴奇 ,E-mail:xingqih@public.km.yn.cn
云南药用野生稻 BIBAC 文库混合克隆池制备及筛选
刘艳平1,2 程在全1 殷富有1 余腾琼1 张敦宇1 郭怡卿1 张薇3 黄兴奇1,2
（1云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，昆明 650223 ；2云南大学生命科学学院，昆明 650091 ；
3云南省昭通市农科所，昭通 657000 ）
摘 要 : 在已构建完成的云南药用野生稻 BIBAC（binary bacterial artificial chomosome）文库的基础上，将文库制备成一、二、
三级混合克隆池，各级混合池的数量分别为 3 360、140 和 14 个。根据 Xa21 抗病基因序列设计 1 对特异引物，利用 4 步 PCR 法对
文库混合克隆池进行逐级筛选，初步确定了 3 个抗病基因阳性克隆。为今后以 PCR 法高效利用云南药用野生稻 BIBAC 文库挖掘其
优异基因奠定了良好的基础。
关键词 : 云南药用野生稻 BIABC 文库 混合克隆池 PCR 筛选 Xa21 基因
Preparation and Screening of Mixed-clones Pools from BIBAC
Library of Oryza officinallis in Yunnan Province
Liu Yanping1,2 Cheng Zaiquan1 Yin Fuyou1 Yu Tengqiong1 Zhang Dunyu1 Guo Yiqing1
Zhang Wei3 Huang Xingqi1,2
（1Biotechnology & Genetic Germplasm Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650223 ；2College of Life Science，
Yunnan University，Kunming 650091 ；3Zhaotong Agricultural Sciences Institute，Zhaotong 657000）
Abstract: Based on the BIBAC library of Oryza officinalis Wall. ex Watt., three grades mixed-clones pools of the BIBAC library were
prepared, including the primary, secondary and tertiary. The number of the primary, secondary and tertiary mixed-clones pools was 3 360, 140
and 14, respectively, and the 14 tertiary mixed-clones pools contained entire BIBAC clones of the library. One pair of specific primers was
designed according to the reported sequence of Xa21 which features broad-spectrum resistance against bacterial blight caused by different strains
of Xanthomonas oryzae pv. oryzae （Xoo）. Three positive BIBAC clones containing Xa21 DNA fragment were obtained through a four-step PCR
screening in the mixed-clones pools.
Key words: Oryza officinallis Wall. ex Watt. in Yunnan BIBAC library Mixed-clones pools PCR screening Xa21 gene
药用野生稻（Oryza officinalis Wall. ex Watt.）是
我国仅有的 3 种珍稀野生稻种质资源之一，其分布
于云南、广西、广东、海南各地。分布于云南的药
用野生稻有多种类型，如耿马类型和孟定类型［1］。
云南孟定类型药用野生稻具有许多优良遗传特性，
如茎杆粗壮抗倒伏，长势非常旺，穗大，耐寒冷（在
0℃条件下一周内植株仍能存活），耐旱，抗稻飞虱、
白叶枯病、稻瘟病和细条病，品质优等［1,2］。利用云
南药用野生稻中的优异基因对现有栽培稻进行改良，
是提高水稻产量和品质的一个重要途径。药用野生
稻的基因组为 CC 型，与栽培稻 AA 基因组差异大，
是拓宽水稻育种遗传基础的重要资源，但其分子遗
传背景不清楚，远缘杂交转育效率不高。为此，我
们力图应用基因工程技术，将药用野生稻染色体（基
因组）大片段 DNA（60-100 kb）构建到可转化载体
（BIBAC）形成文库，通过农杆菌介导的转基因技术
将大片段 DNA 导入具有代表性的栽培稻中建立“渗
入系”库，以拓宽栽培稻遗传基础，研究、发掘和
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期118
利用药用野生稻的优异种质基因。
已构建完成的云南药用野生稻 BIBAC 文库包含
53 760 个克隆，保存于 140 个 384 孔板中，随机检
测其中的 50 个阳性克隆检测，DNA 插入片段大小
分布在 25-200 kb 之间，平均 76 kb，空载率为 6.0%。
覆盖了药用野生稻基因组大小的 5.86 倍［3］。在药用
野生稻 BIBAC 文库构建完成的基础上，对文库要筛
选出一批克隆（包括其中的大片段）用于转化水稻，
把药用野生稻中带有抗病基因同源片段的基因组部
分转移到水稻获得“渗入系”，从而探索出快速简便
有效的药用野生稻优良基因发掘利用途径。
基因组文库 PCR 筛选法仍然遵从 PCR 反应的
基本原理及反应条件，所不同的是通过混合克隆的
PCR，以尽可能少的 PCR 反应次数从含有成千上万
个克隆的基因文库中筛选出目的（阳性）克隆。在
PCR 基础上建立的许多新方法已被应用于基因的分
离，在文库筛选中的应用已有成功的报道［4-9］。
1 材料与方法
1.1 材料
云南药用野生稻（Oryza officinalis Wall. ex Watt.）
BIBAC 文库。
1.2 方法
制备一个完整的 BIBAC 文库混合克隆池，需
要 对 文 库 中 所 有 的 有 插 入 片 段 的 克 隆 进 行 池 化
（pooling）和保存。混合克隆池建成后存于 -70℃超
低温冰箱，供后续筛选使用。
1.2.1 建立混合克隆池的准备工作 培养基为保存
文库所用的冻存缓冲储存液（LB，36 mmol/L K2HPO4，
13.2 mmol/L KH2PO4，1.7 mmol/L sodium citrate，
0.4 mmol/L MgSO4·7H2O，6.8 mmol/L （NH4）2SO4, 4.4%
glycerol），经高温高压灭菌备用。将经灭菌处理的
培养基和 1.5 mL 离心管及 10 μL、200 μL、1 mL 移
液器和枪头放置于超净工作台上方便拿取的位置。
调节工作间温度至 25℃ 以下，将保存 BIBAC 文
库的 384 孔板从超低温冰箱中取出，放入超净工
作台解冻。
在经高压灭菌冷却后的培养基中加入终浓度为
50 mg/L 的 Kanamycin，摇匀后用 1 mL 移液器按每
离心管 800 μL 培养基分装在 1.5 mL 离心管中。调节
恒温摇床为 37℃，以备文库混合池建成后混合克隆
的培养。
1.2.2 一级混合克隆池的建立 待文库保存板中的
菌液完全融化后，用 10 μL 移液器分别吸取 384 孔
板的第 1 列中 16 个孔的单克隆菌液（每孔 10 μL），
加入到已分装有培养基的 1.5 mL 离心管中，每次必
须更换新枪头，尽量保证在用移液器将沉淀在板底
的菌体重悬后再吸取足量的菌液。将收集了第 1 列
混合菌液的离心管标号为 -1（X 为文库 384 孔板的
编号）。依此，第 2 到第 24 列依次标号为 -2，……，-24。
这样，每个 384 孔板制备成 24 个一级混合池，即整
个文库包含 3 360（140×24）个一级混合池。将制
备的混合池放入恒温摇床中培养 6-8 h。
1.2.3 二级混合克隆池的建立 将培养后的一级混
合池中的菌液借助于移液器充分重悬、混匀，从第
一个文库 384 孔板所对应的 24 个一级混合池中分别
吸取 50 μL 菌液，加入空的 1.5 mL 离心管中，每次
更换新枪头。将收集了第一个 384 孔板混合菌液的
离心管标号为 1。依此，第 2 到第 140 板依次标号
为 2，……，140。共建成 140 个二级混合池，其编
号与原始文库编号对应。
1.2.4 三级混合克隆池的建立 按二级混合克隆
池编号顺序， 从 1 至 10 号混合克隆池分别吸取 100
μL 菌液，加入一个空的 1.5 mL 离心管中，并标号
为 1-10，即每 10 个二级混合克隆池合并成为一个
三级混合克隆池。依此，第 11 到第 140 号二级混
合池合并成的三级混合池依次标号为 11-20，……，
131-140，共计 14 个。将制备的二、三级混合克隆
池放入恒温摇床中培养 6-8 h。
1.2.5 PCR 法分级筛选药用野生稻 BIBAC 文库混
合池
1.2.5.1 PCR 引物设计 参照翟文学等［10］根据 Xa21
序列设计的特异引物序列，委托上海生工生物工
程技术服务有限公司合成特异引物一对。其引物序列
如下 ：上游引物 ：5-ATTGAATAATTCACTGGGTAT
TGG-3；下游引物：5-GTCTTGCCTTGCACTTCTGCAC
GA -3。
1.2.5.2 PCR 反 应 体 系 （1）PCR 反 应 体 系 如
下 ：① 10×PCR Buffer ：2.5 μL ② dNTP 混 合 液
（2.5 mmol/L）：2 μL ③ MgCl2（25 mmol/L）：1.5 μL
2012年第2期 119刘艳平等 ：云南药用野生稻 BIBAC 文库混合克隆池制备及筛选
④ 10 μmol/L 引物（正、反）：各 1.25 μL ⑤ Taq 酶
（5 U/μL）：0.3 μL ⑥ DNA ：2 μL ⑦ ddH2O ：15.2 μL，
总体积为 25 μL。最后在反应体系上覆盖一层液体
石蜡油。（2）PCR 扩增程序 ：94℃预变性 3 min，再
进行 35 次循环（94℃ 变性 50 s，56℃ 退火 1 min，
72℃ 延伸 2 min）, 最后 72℃延伸 10 min。扩增反应
结束后，取 5 μL 反应液，用 1.0% 的琼脂糖电泳分离，
电泳结束后，紫外灯下观察结果并照相。
1.2.5.3 分步 PCR 法筛选文库 首先将保存的 14
个三级混合克隆池分别用碱裂解法［11］提取混合质
粒，利用已设计的一对特异引物，PCR 法分别筛选
14 个三级混合克隆池，获得阳性混合池 ；选取每个
阳性三级混合克隆池所对应的 10 个二级混合克隆
池分别作为第二步筛选的模板，获得二级阳性混合
池 ；选取每个二级阳性混合克隆池所对应的 24 个
一级混合克隆池分别作为第三步筛选的模板，获得
阳性一级混合池 ；最后从冻存的文库中挑出阳性一
级混合池中的 16 个单克隆，分别进行 PCR 扩增筛
选，初步确定目标单克隆。这样，利用四步共 64
（14+10+24+16）个 PCR 反应就能筛选到目标单克隆。
2 结果
2.1 云南药用野生稻BIBAC文库混合克隆池制备
为了快速筛选出目标单克隆，将云南药用野生
稻 BIBAC 文库制备成一、二、三级混合克隆池，建
成的一级混合克隆池为 3 360 个 ；二级混合克隆池
为 140 个；三级混合克隆池为 14 个。分别保存在 -70℃
冰箱备用。
2.2 云南药用野生稻BIBAC文库筛选
第一步，分别以 14 个三级混合池的混合质粒
为模板，通过 PCR 法进行筛选，扩增到目的条带后
反复验证，筛选结果如图 1 所示。图 1-a 中第 14 泳
道的条带为文库第 14 个三级混合克隆池扩增得到
的产物，记录此混合池号（131-140）。第二步，取
此阳性三级混合池（131-140）所对应的 10 个二级
混 合 池 分 别 进 行 PCR 筛 选。 图 1-b 为 131-140 二
级混合池的混合质粒为模板扩增得到的产物，条
带大小与第一步扩增得到的条带大小一致，泳道
4 为第 134 个二级混合池的混合质粒为模板扩增得
到的结果。第三步，取第 134 个二级混合克隆池
所对应的 24 个一级混合池分别进行 PCR 筛选，扩
增到的条带大小与第二步扩增得到的条带大小一
致。图 1-c 为以第 134 个二级混合池中的 24 个一
级混合池的混合质粒为模板筛选，获得阳性一级混
合池 ：第 4 个一级混合池（图 3 第 4 泳道）。第四
步，取第 4 个一级混合池所对应的 16 个单克隆质
粒进行 PCR 筛选，得到 3 个含有目的片段大小的
单克隆。图 1-d 中泳道 4，8，15 分别为单克隆质粒
扩增得到的 PCR 产物，条带大小与第一、二、三
步扩增得到的产物的条带大小一致，初步判断为阳
性克隆。结果表明，用本筛选系统从 BIBAC 文库
53 760 个克隆中只需四步共 64 个 PCR 反应即可准
确筛选出 3 个阳性克隆，该筛选方法效率较高。
从扩增图谱可以看出，所扩增到的片段大小约
1.4 kb，与预期的片段大小相符，这表明云南药用野
生稻中可能存在抗白叶枯病基因 Xa21 的同源基因，
其功能尚不清楚。
M. DL2000 Marker ；a.14 个三级混合克隆池 PCR 筛选 ；1-14.14 个三级混合
池的混合质粒筛选结果 ；14. 阳性混合池（第 14 个三级混合克隆池）；b. 第
131-140 二级混合克隆池筛选 ；1-10.131-140 二级混合池的混合质粒筛选结
果 ；4. 阳性克隆池（第 134 个二级混合池）；c. 一级混合池筛选 ；1-4. 部分
一级混合克隆池筛选：4. 阳性一级混合克隆池（第 4 个一级混合克隆池）；d. 阳
性一级混合池中的 16 个单克隆筛选 ；1-16.16 个单克隆筛选 ；4,8,15. 阳性
单克隆
图 1 四步 PCR 法筛选文库混合克隆池及单克隆
3 讨论
常用的基因组文库筛选方法有高密度（high
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期120
density）杂交膜筛选［12］和 PCR 筛选法［5-7］。文库的
常规杂交筛选有如下制约因素 ：第一，必须知道分
子标记或特定基因序列，而目前知道的药用野生稻
紧密连锁分子标记和特定基因序列很少 ；第二，杂
交筛选如果用同位素标记探针需要专门的防护条件
和设施，而用非同位素法标记探针灵敏度差，成本
高，操作也较复杂。第三，由于大分子文库通常有
5 倍的覆盖率，导致杂交筛出的许多阳性克隆是重
复的，甚至是重复多倍的，大大增加了后续试验的
工作量。以 PCR 为基础来筛选文库的方法比依赖杂
交筛库的方法更为灵敏［4］。采用混合池 PCR 法筛选
文库，只需设计用于扩增目的基因的引物即可，简
单易行，而且节省成本，现在已被广泛地应用于大
片段基因组文库筛选，特别是以混合池方式保存的
文库，采用 PCR 方法筛选比膜杂交方法显示出了
更大优势［7,11］。
本研究构建的云南药用野生稻 BIBAC 文库混合
克隆池不仅容纳了文库中的所有克隆，而且可以用
于重复的筛选研究，比其它文库筛选策略具有更高
的可操作性、可重复性和高效性，在一周左右就能
完成从三级混合克隆池到单克隆的筛选。一方面该
混合池可以作为保护处于濒危状态的云南药用野生
稻资源的另一种手段 ；另一方面本研究所构建的文
库混合池为后续药用野生稻抗病虫害或者其它优良
性状控制基因的挖掘和利用奠定了基础 ；也可以在
不了解基因功能的前提下大规模进行混合 BIBAC 克
隆转化，进而获得药用野生稻全基因组或部分基因
组“渗入系”库，从中筛选具有有利性状的植株应
用于水稻新品种的培育。
4 结论
将云南药用野生稻 BIBAC 文库制备成一、二、
三级混合克隆池，各级混合池的数目分别为 3 360 个、
140 个、14 个。利用 Xa21 基因的特异引物分别对文
库三、二、一级混合池进行分级 PCR 筛选，经四步
64 个 PCR 筛选，得到 3 个含有目的片段大小的单克
隆。所扩增到的片段大小与 Xa21 基因的片段大小相
同，这表明云南药用野生稻中可能存在抗白叶枯病
基因 Xa21 的同源基因。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）