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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
近年来，水体富营养化导致了藻类形成水华和
赤潮，特别是有害藻类的过度繁殖，不仅影响水生
生态系统和人文景观，甚至通过给水系统危害公众
的健康［1］，寻求有效的防治途径势在必行。生物法
除藻相对于物理法和化学法对环境的危害更小，是
一种环境友好的除藻方法，至今报道过的溶藻微生
物多以细菌为主［2］。
溶藻细菌（Algicidal bacteria）是在天然水体中
大量存在，并对水体里的藻类具有抑制或致死作用
的一类细菌的总称，它们通过直接或间接方式，抑
制藻类生长或杀死藻类，从而溶解藻细胞［3］。本研
究从河南省平顶山市白龟山水库大坝下游水体中分
离筛选到一株具溶藻能力的细菌，命名为 NP23，研
究它对湖泊中优势藻（小球藻、惠氏微囊藻、栅藻
和蛋白核小球藻）的溶藻效果，并通过生理生化和
16S rDNA 测序分析对 NP23 的藻去除率与菌液的浓
度关系、溶藻物质和溶藻方式进行分析，旨在为进
一步探讨研究溶藻菌提供参考。
收稿日期 : 2012-01-12
基金项目 : 河南省科技攻关重点项目（092102310069）
作者简介 : 廖春丽 , 女 , 硕士 , 讲师 , 研究方向 : 微生物发酵 ; E-mail: liaoliao8178@yahoo.com.cn
通讯作者 : 单林娜 , 女 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 环境生物技术 ; E-mail: linnashan@qq.com
一株溶藻细菌 NP23的初步分离鉴别及其溶藻作用研究
廖春丽 杨闪闪 许晨 郭端强 单林娜
（河南城建学院生物工程系，平顶山 467044）
摘 要： 从水体中分离得到一株具有溶藻能力的细菌，命名为 NP23。经形态特征、生理生化鉴定和 16S rDNA 序列分析表
明，该菌株属于肠杆菌属（Enterobacter）。研究了该菌株对湖泊中优势藻的溶藻效果，初步探讨了其溶藻方式及溶藻物质。结果表
明，该菌株对小球藻、惠氏微囊藻、栅藻和蛋白核小球藻具有一定的去除效果，叶绿素 a的去除率分别为 64.1%、53.1%、87.2%
和 84.4%，而且在 10-108 CFU/mL菌浓度范围内，藻的去除率与菌液的浓度成正相关；该菌株对小球藻、栅藻和蛋白核小球藻是
间接溶藻，对惠氏微囊藻是直接溶藻；该菌株对栅藻的溶藻物质是蛋白类物质，对蛋白核小球藻的溶藻因子是菌体胞外分泌的具
有热稳定性的非蛋白类物质。
关键词： 溶藻细菌 NP23 小球藻 惠氏微囊藻 栅藻 蛋白核小球藻 分离和鉴定
Isolation，Identification and Function of an Algicidal Bacteria Strain
Liao Chunli Yang Shanshan Xu Chen Guo Duanqiang Shan Linna
（Department of Biology Engineering，Henan Institute of Urban Construction，Pingdingshan 467044）
Abstract: One strain of algicidal bacteria NP23 was isolated from water. Its morphology characteristic, physiological biochemistry
characteristic and the results of 16S rDNA sequence analyze strongly suggested that algicidal bacteria NP23 belongs to Enterobacter. Focusing
on its algicidal effect and mechanism against advantage algaes from Lakes. Results showed that the algicidal bacteria NP23 had a good removal
effect on Chlorella, Microcystis wesenbergii, Scenedesmus and Chlorella pyrenoidosa. The removal rates to chlorophyll a reached 64.1%, 53.1%,
87.2% and 84.4%, and in the filtrate concentration ranges of 10-108 CFU/mL, its removal rates and filtrate concentration showed positive
correlation. NP23 algicidal mechanism is direct dissolve algae of Chlorella, Scenedesmus and Chlorella pyrenoidosa and indirect dissolve algae of
Microcystis wesenbergii. The dissolved algae matter produced by this strain was of protein substances of Scenedesmus and of extracellular thermo-
stable non-protein substances of Chlorella pyrenoidosa.
Key words: Algicidal bacteria NP23 Chlorella Microcystis wesenbergii Scenedesmus Chlorella pyrenoidosa Isolation and
identification
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期164
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 溶藻细菌 NP23，来自本课题组从河南
省平顶山市白龟山水库大坝下游水体中经富集、分
离纯化得到的一株野生细菌。
1.1.2 藻种 藻种选用小球藻、栅藻、惠氏微囊藻、
蛋白核小球藻、衣藻、红球藻和地木耳，均来自中
科院水生生物研究所藻种保藏中心。藻种经活化后，
在 25℃、光照强度为 2 500 lx、光暗期为 12 h 12 h
的条件下培养。藻种的接种及传代过程均严格按照
无菌操作规则进行。
1.1.3 培养基 溶藻菌 NP23 液体培养基 ：0.4%
KNO3，0.4% （NH4） 2SO4，0.04% MgSO4·7H2O，
0.05% K2HPO4，0.011% CaCl2.，0.15% NaCl，0.02%
KH2PO4，0.005% FeSO4·7H2O，0.2% NaAc，pH7.5。
藻培养基 ：绿藻使用 SE 培养基［4］；蓝藻使用
BG11 培养基［5］。
1.2 方法
1.2.1 菌种分离及纯化 从河南省平顶山市白龟山
水库大坝下游水体中取水样，无菌生理盐水稀释不
同梯度涂平板法分离筛选到十几种菌株，平板划线
法纯化菌种并编号，培养基为普通营养琼脂培养基。
1.2.2 溶藻细菌的鉴定 对分离得到的菌株NP23形
态特征及生理生化鉴定参照文献［4］；16S rRNA 序
列分析［5］：按照 TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identifi-
cation PCR Kit 提取细菌的基因组总 DNA ；以提取的
DNA 为模板，采用引物（正向 ：5-GAGCGGATAA-
CAATTTCACACAGG-3，反向 ：5-CAGCAGCCGCG-
GTAATAC-3，）进行 16S rDNA 基因扩增。反应程序
为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 60 s，50℃退火 1
min，72℃延伸 1.5 min，30 个循环 ；末轮 72℃延伸
5 min。PCR 产物经检测后，送交大连 TaKaRa 公司
测序，将所测的 16S rDNA 基因序列经校对后，在
GenBank 数据库中进行 BLAST 比对分析。
1.2.3 菌生长曲线的测定 在无菌条件下，挑取活
化菌株按 10% 接种量，在 28℃（转速 180 r/min）振
荡培养，并定时取样测定在 660 nm 处的吸光值，根
据吸光值的大小绘制菌的生长曲线。
1.2.4 菌对藻的溶藻效果测定 将培养至对数期的
菌液（菌浓度 108个/mL）与培养至对数期的藻液（叶
绿素 a 含量 725 mg/m3）按 1 9 的比例混合培养，培
养条件与藻的相同。设置对照和加菌样各 3 组平行。
对照和加菌样每隔 12 h 取样一次，每次 5 mL，取出
的藻样按丙酮冻融法测量叶绿素 a 的吸光值，进而
求出叶绿素 a 的含量，计算出菌株对藻的溶藻率。
根据公式计算菌的溶藻率 ：R=（C0-Ce）/C0，
式中 ：C0 为对应时刻对照样藻中叶绿素 a 的含量
（mg/m3）；Ce 为对应时刻处理样藻中叶绿素 a 的含
量（mg/m3）。其中，叶绿素 a 的含量计算公式为 ：
叶绿素 a（mg/m3）=［11.64×（OD663-OD750）-2.16×
（OD645-OD750）+0.10×（OD630-OD750）］V1/V/δ，式中：
V 为取样体积（L），OD 为吸光度，V1 为提取液定
容后的体积（mL），δ 为比色皿光程（cm）。
1.2.5 溶藻方式研究
1.2.5.1 胰蛋白酶对藻的影响 用胰蛋白酶处理藻
液 ：将 2 mL 藻样接种于 98 mL 培养基中，培养至对
数生长期 ；其中一瓶作为空白对照，另外一瓶加入
100 μL 胰蛋白酶（100 mg/mL）处理 ；4 d 后测叶绿
素 a 的含量。
1.2.5.2 溶藻物质特性的研究 将不加溶藻细菌的
藻纯培养液（CK）、高温处理过滤液后再用胰蛋白
酶处理的过滤液Ⅰ各 10 mL，分别加入到 90 mL 藻
中进行溶藻试验，7 d 后测定叶绿素 a 的下降量。
1.2.5.3 溶藻方式的研究 将不加溶藻细菌的藻纯
培养液（CK）、NP23 菌株经 0.22 μm 滤膜的过滤液
Ⅰ、NP23 菌株经 0.22 μm 滤膜的过滤后的菌体悬液
Ⅱ各 10 mL，分别加入到 90 mL 藻中进行溶藻试验，
7 d 后测定叶绿素 a（Chla）的下降量。
1.2.6 菌液浓度对溶藻效果的影响 将不同浓度的
菌液（浓度分别为 10、102、104、106、108 CFU/mL）
分别加入到小球藻、栅藻、惠氏微囊藻、蛋白核小
球藻中，定时测量叶绿素 a 的含量，以计算溶藻效果。
2 结果
2.1 菌株NP23鉴定结果
2.1.1 形态特征及生理鉴定 NP23 菌株革兰氏染色
为阴性菌，菌落呈淡黄色、圆形湿润凸起、边缘整齐、
无芽孢、在液体培养基中呈中等大小棒杆状，无菌毛、
鞭毛和无运动特性（图 1）；糖发酵试验表明，两菌
2012年第8期 165廖春丽等 ：一株溶藻细菌 NP23 的初步分离鉴别及其溶藻作用研究
株均具有分解葡萄糖、乳糖和蔗糖的能力 ；VP 试验
均为阳性 ；甲基红试验均呈阴性 ；均能利用柠檬酸
盐作为唯一碳源，不能产生胞外酶水解淀粉 ；不能
分解含硫氨基酸产生硫化氢 ；不含有苯丙氨酸脱氨
酶 ；菌落较小吲哚试验呈阳性。
图 2 菌株 NP23的生长曲线
2.1.2 16S rRNA 序列分析及其分子鉴定 PCR 扩增
产物长度为 1.5 kb，获得的 16S rRNA 基因序列已在
GenBank 注册，获得登录号为 JQ231212。BLAST 程
序搜索发现，NP23 菌株与肠杆菌属的 16S rDNA 核
苷酸序列的同源性均在 99.9%，因此结合形态特征
和生理生化特性，鉴定 NP23 菌株属于肠杆菌属。
2.2 溶藻细菌的生长曲线
以培养时间为横坐标，测得的光吸收值即 OD
为纵坐标，绘制出菌的生长曲线。由图 2 可知，菌
株的停滞期在 0-12 h 左右，在 12 h 后进入对数生长
期，培养至大约 21 h 后可达到稳定期。
图 3 菌对不同藻的溶藻效果
2.4 溶藻方式的研究
根据图 3 显示，对溶藻效果好的小球藻、惠氏微
囊藻、栅藻、蛋白核小球藻 4 种藻进行溶藻方式的
研究。
2.4.1 胰蛋白酶对藻的影响 胰蛋白酶对于藻生长
的影响结果（图 4）表明，加入胰蛋白酶的 4 d 内，
惠氏微囊藻和小球藻 CK 组的 Chla 含量与胰蛋白酶
处理的藻液 Chla 的含量相差较大，说明胰蛋白酶本
身对惠氏微囊藻和小球藻有溶解作用，因此不可以
利用胰蛋白酶处理细菌滤液，也就无法进一步判断
对这两种藻的溶藻物质特性。而栅藻和蛋白核小球
藻 CK 组 Chla 含量与胰蛋白酶处理的藻液 Chla 的含
量相当，说明胰蛋白酶本身对栅藻和蛋白核小球藻
没有溶解作用。因此可以利用胰蛋白酶处理细菌滤
液，去除其中的蛋白质，而非采用普通的高温处理
来进一步判断对这两种藻的溶藻物质特性。
图 4 胰蛋白酶对藻的影响
2.4.2 溶藻物质特性的研究 由图 5 可见，NP23 菌
株滤液经胰蛋白酶处理后的叶绿素 a 的含量与 CK
组相当，结果证明 NP23 对栅藻的溶藻物质是蛋白
类物质。图 6 显示，NP23 菌株滤液经胰蛋白酶处理
后对蛋白核小球藻也仍具有溶解作用，证明 NP23
菌体对蛋白核小球藻的溶解不是通过分泌蛋白质酶
溶藻，而且这种具有溶藻功能的物质具有热稳定性。
2.4.3 溶藻方式的研究 图 7 显示，对于小球藻、栅
藻和蛋白核小球藻来说，NP23 培养液经 0.22 μm 滤
图 1 电镜下观察 NP23菌株形态
2.3 菌对藻的溶藻效果的测定
由图 3 可以看到，NP23 对蛋白核小球藻、栅藻、
小球藻和惠氏微囊藻具有较好的溶藻效果。其中对
栅藻溶藻效果最佳。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期166
膜过滤后，滤液中已不含菌体，滤液仍具有溶藻作用，
表明 NP23 释放的某种物质对这 3 种藻具有溶解作
用，即间接溶藻。对于惠氏微囊藻，NP23 培养液经
0.22 μm 滤膜的过滤后的菌体悬液，已不含释放的胞
外物质，滤液仍具有溶藻作用，表明 NP23 菌体本
身对惠氏微囊藻具有溶解作用，也即直接溶藻。
3 讨论
目前，国内外对于藻类降解微生物的分离有多
种途径，其中大多是利用发生水华或赤潮的湖泊或
海洋水样。本研究就是从平顶山市白龟山水库大坝
下游水体中经富集、分离纯化得到一株野生溶藻细
菌 NP23。通过该方式获得的溶藻菌在自然水体中
（有机碳贫瘠）易增殖，并达到溶藻的有效浓度阈值。
目前 16S rDNA 序列的相似性分析也是细菌分
类鉴定的一个重要指标，本试验在常规菌株生理生
化特征分析的基础上结合 16S rDNA 序列法对分离纯
化得到的野生溶藻细菌 NP23 进行鉴定，初步鉴定
该菌株属于肠杆菌属。
溶藻细菌在国内外文献中陆续有一些报道，这
些细菌多为革兰氏阴性菌，其作用对象比较广泛，
既有蓝藻，也有绿藻［8］。本研究表明，NP23 菌具
有理想的溶藻效果，对淡水中存在的优势藻小球藻、
惠氏微囊藻、栅藻和蛋白核小球藻的溶藻效果较好。
不同的溶藻细菌有不同的作用藻类，这是利用细菌
溶藻的一个优点，因为细菌在溶解有害藻种的同时
不危害其它水生生物。但是水华爆发通常是几个不
同藻类共同作用的结果，因此，单一溶藻菌难以达
到有效控制水华的目的，高效复合溶藻菌群的富集
与组合筛选具有重要的应用研究价值，这也成为本
课题下一步研究的重点。本研究中藻的生长受环境
的影响较大，不同的环境所含的叶绿素 a 也不同，
这样在测定菌对藻的溶藻效果时，偏差较大。为了
解决这个问题，在藻不适应生长的环境下，放在恒
温培养箱中生长。
图 6 NP23对蛋白核小球藻的溶藻物质特性
图 5 NP23对栅藻的溶藻物质特性
CK 为不加菌的藻纯培养液，Ⅰ为高温处理过滤液后再用胰蛋白酶处理
CK 为不加菌的藻纯培养液，Ⅰ为高温处理过滤液后再用胰蛋白酶处理
1. 小球藻 ；2. 惠氏微囊藻 ；3. 栅藻 ；4. 蛋白核小球藻。CK 为不加
NP23 的藻纯培养液，Ⅰ为 NP23 经 0.22 μm 滤膜的过滤液，Ⅱ为 NP23
菌株经 0.22 μm 滤膜的过滤后的菌体悬液
图 7 NP23的溶藻方式
图 8 不同浓度菌液对藻的去除效果
2.4.4 菌液浓度对溶藻效果的影响 图 8 显示溶藻
菌滤液浓度越高，除藻效果越好。溶藻率与投加的
菌体浓度呈正相关。
2012年第8期 167廖春丽等 ：一株溶藻细菌 NP23 的初步分离鉴别及其溶藻作用研究
NP23 菌株对本试验研究的藻的溶解过程宏观表
现为藻液从绿变黄，直至无色，说明藻细胞在 NP23
菌株作用下被溶解。细菌溶解藻细胞的作用方式可
归结为 2 种方式 ：一是直接溶藻（direct attack），此
方式需要菌体与藻细胞直接接触，通过分泌溶解纤
维素的酶消化微藻细胞壁，进而溶解整个藻细胞［10］，
或者细菌进入藻细胞溶藻［11］；二是间接溶藻（indirect
attack），即通过分泌细胞外物质溶藻，非选择性地
杀伤藻细胞［12］，或通过竞争有限营养物质抑制微藻
生长［13］。NP23 菌株培养液经 0.22 μm 滤膜过滤液、
经 0.22 μm 滤膜过滤后的菌体悬液、高温处理过滤液
后再用胰蛋白酶处理的过滤液均有溶解小球藻、栅
藻和蛋白核小球藻的效果，并且溶藻效果与该菌株
培养液无明显区别，说明 NP23 菌株的溶藻作用方式
为间接溶藻，即通过该菌株分泌的溶藻活性物质实
现溶藻作用，并且这种溶藻活性物质对栅藻具有热
不稳定性的蛋白类物质，对蛋白核小球藻具有热稳
定性的非蛋白类物质 ；但对惠氏微囊藻是直接溶藻。
溶藻作用与溶藻细菌的浓度有关，不同的溶藻
细菌有不同的下限浓度要求，只有达到或者超过这
个浓度时才有明显的溶藻效果［9］。在本研究讨论菌
液浓度对溶藻效果的影响中，溶藻菌滤液浓度越高，
除藻效果越好，而且溶藻细菌对不同的藻有不同的
除藻率，要想达到明显的溶藻效果，不同的藻对菌
的浓度要求也不一样。
目前，有关溶藻细菌的研究还处在试验室研究
阶段，在试验阶段的溶藻效果是否能在实际水体中
得到实现还是个未知数。如何得到具有实际应用价
值的溶藻细菌以及如何把它们实际应用到水华和赤
潮防治当中，尚需更深入的调查研究。
4 结论
NP23菌株生长曲线显示，停滞期在0-12 h左右，
在 12 h 后进入对数生长期，培养至大约 21 h 后可达
到稳定期，24 h 后开始进入消亡期。NP23 菌株对小
球藻、惠氏微囊藻、栅藻和蛋白核小球藻的溶藻率
分别为 64.1%、53.1%、87.2% 和 84.4%。NP23 菌对
惠氏微囊藻是直接溶藻，对小球藻、栅藻和蛋白核
小球藻是间接溶藻 ；并且溶藻活性物质对栅藻具有
热不稳定性的蛋白类物质，对蛋白核小球藻具有热
稳定性的非蛋白类物质。研究显示，溶藻菌滤液浓
度越高，除藻效果越好，而且不同的藻对菌的浓度
要求也不一样。
参 考 文 献
［1］ 刘大银 , 毕亚凡 , 李庆新 , 等 . 皂素生产废水综合治理技术研究
（1）——实用治理技术框架 . 武汉化工学院学报 , 2003, 25（4）：
33-36.
［2］ 周瑞 . 高效溶藻细菌混合溶藻特性的初步研究［D］. 武汉 ：华
中师范大学 , 2006 ：5.
［3］ Lee SO, Kato J, Takiguchi N, et al. Involvement of an extracellular pro-
tease in algicidal activity of the marine bacterium Pseudoalteromonas
sp. strain A28. Appl Environ Microbiol, 2000, 66（1）：4334-4339.
［4］ 中国科学院微生物研究所细菌分类组 . 一般细菌常用鉴定方
法［M］. 北京 ：科学出版社 , 1978.
［5］ 汪辉 , 刘兆普 , 魏微 , 等 . 一株溶藻菌的分离、鉴定及其溶藻物
质的研究 . 中国环境科学 , 2008, 28（5）：461-465.
［6］ 姜欣欣 . 浮游植物叶绿素 a 测定方法的改进 . 海峡科学 , 2010,
42（6）：134-135.
［7］ 吴叶玲 . 测定叶绿素 a 方法的改进 . 福建分析测试 , 2006, 15
（2）：38-39.
［8］ 安鑫龙 , 李豫红 , 赵艳珍 , 等 . 溶藻微生物的研究方法 . 水利渔
业 , 2005（2）：17-18.
［9］ 彭越 , 吴刚 , 席宁 . 3 株溶藻细菌的分离鉴定及其溶藻效应 . 环
境科学研究 , 2003, 16（1）：37-40.
［10］ Yamamoto Y, Suzuki K. Ultrastructural studies on lysis of blue-
green algae by a bacterium. Faculty of Agriculture, 1977, 23（3）：
285-295.
［11］ Caiola MG, Pellegrini S. Lysis of Microcystis aeruginosa by
bdellovibrio-like bacteria. J Phycol, 1984, 20（4）：471-475.
［12］ Lovejoy C, Bowman JP, Hallegraeff GM. Algicidal effects of a
novel marine Pseudoalteromonas isolate （class Proteobacteria,
gamma subdivision） on harmful algal blooms species of the
genera Chattonella, Gymnodinium and Heterosigma. Applied and
Environmental Microbiology, 1998, 64（8）：2806-2813.
［13］ 赵以军 , 刘永定 . 有害藻类及其微生物防治的基础 - 藻菌关系
的研究动态 . 水生生物学报 , 1996, 20（2）：173-181.
（责任编辑 马鑫）