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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 : 2011-09-21
基金项目 : 福建省青年人才科技创新基金资助项目（2002J060）
作者简介 : 杨湘越 , 男 , 副主任技师 , 硕士 , 研究方向 : 自身免疫检测 ; E-mail: yangxy3737@163.com
通讯作者 : 兰小鹏 , 男 , 教授 , 主任技师 , 硕士生及博士生导生 , 研究方向 : 自身免疫检测 ; E-mail: lanxp@sina.com
人自身抗原 SSA52的酵母重组分泌表达及其
斑点免疫金渗滤法的建立
杨湘越 宋涛 兰小鹏
（南京军区福州总医院解放军临床检验医学研究所，福州 350025）
摘 要： 人自身抗原 SSA52通常采用组织提取法或原核表达获得，存在诸多问题。通过基因克隆技术，在毕赤酵母中表
达人自身抗原 SSA52，并建立斑点免疫金渗滤法。采用 RT-PCR扩增 SSA52基因，与酵母表达载体 pPIC9k重组，构建表达质粒
pPIC9k-SSA52。用电穿孔法转化酵母菌 SMD1168，在 MD平板上筛选重组克隆，用 G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇
诱导表达后，培养上清液用十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blot）鉴定，并建立斑
点免疫金渗滤法（dot immuogold filtration assay, DIGFA），进行初步临床应用对比研究。结果显示，RT-PCR产物约为 1 400 bp，与
预期 1 428 bp接近，pPIC9k-SSA52重组阳性克隆测序结果与基因库核酸数据库报道完全一致 , 双酶切鉴定正确，表达产物 SSA52
的相对分子质量约 52 kD。Western blot法证实表达产物具有天然 SSA52分子的免疫原性，阴性对照菌未见目的表达条带。DIGFA
与欧蒙酶免疫斑点法的阳性符合率为 95.2%（120/126），阴性符合率为 94.0%（47/50），总符合率为 94.9%（167/176）；两种方法
检测结果无统计学显著差异（P > 0.05）。说明 SSA52在毕赤酵母中分泌表达成功，建立的 DIGFA简便、快速、准确。
关键词： 自身抗原 SSA52 克隆 表达 巴斯德毕赤酵母 斑点免疫金渗滤法
Secreted Expression of Recombinant Human Autoantigen SSA52 in
Methylotrophic Yeast Pichia pastoris and Establishment of Dot
Immunogold Filtration Assay
Yang Xiangyue Song Tao Lan Xiaopeng
（Clinical Laboratory Medicine Research Institute of People’s Liberation Army, Fuzhou General Hospital, Fuzhou 350025）
Abstract: Human autoantigen SSA52 was obtained by tissue extracting or expression in E.coli. We cloned and expressed human
autoantigen SSA52 in methylotrophic yeast Pichia pastoris and established a new dot immunogold filtration assay （DIGFA）. The gene SSA52
was cloned by RT-PCR. The PCR product was inserted into the vector pPIC9k. The recombinant plasmid pPIC9k-SSA52 was transformed into
yeast SMD1168 by electroporation. The positive clones were screened in MD plates. The high copy number transformants were rapidly selected
using G418 and induced by methanol. Supernatants after induction were analyzed by SDS-PAGE and Western blot. The clinical specimen for
SLE, SS, RA, SSc and healthy individuals were detected by DIGFA and enzyme immunodot. The PCR product was about 1 400 bp in size, which
was in accordance with predicted 1 428 bp. The pPIC9k-SSA52 showed the same sequencing result with GenBank’s report and restriction
enzyme analysis confirmed prediction. The pPIC9k-SSA52 positive clone produced a 52 kD protein which had natural immunogenicity of human
autoantigen SSA52 by SDS-PAGE and Western blot. The positive and negative concordance of DIGFA were 95.2%（120/126）and 94.0%
（47/50）, respectively. There was no significant statistical difference between DIGFA and enzyme immunodot（P > 0.05）. Successfully cloning
and expression of human autoantigen SSA52 in methylotrophic yeast Pichia pastoris were obtained, which proved that DIGFA is simple, rapid
and accurate.
Key words: Autoantigen SSA52 Cloning Expression Pichia pastoris DIGFA
2012年第4期 177杨湘越等 ：人自身抗原 SSA52 的酵母重组分泌表达及其斑点免疫金渗滤法的建立
SSA52, 又称 Ro52，是干燥综合征（Sjögren’s
syndrome, SS）患者血清中存在的一种分子量为 52
kD大小的自身抗原，抗SSA52自身抗体在SS的诊断、
治疗和预后判断中具有重要价值［1］。包括抗 SSA52
自身抗体在内的可提取性核抗原（ENA）自身抗体
谱检测方法的建立，需要获得大量均一并具有抗原
活性的自身抗原。迄今为止，国内外均使用组织提
取法，从动物（小牛、猪、兔等）胸腺或人脾脏中
提取纯化天然自身抗原作为检测相应自身抗体的配
体，存在产量少、纯度低、批间差异大且成本高等
缺点。因此，应用基因工程技术克隆表达重组自身
抗原势在必行。虽然国内已在大肠杆菌中表达了
SSA52 融合蛋白［2］，但包涵体蛋白的变复性处理及
纯化过程十分不便。甲醇营养型酵母表达系统是一
种适宜表达外源基因的真核表达系统，近 10 年来的
应用研究获得较大成功［3］。本研究利用该表达系统，
将 SSA52 基因在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）
中获得分泌表达，并初步建立 DIGFA 快速检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 人白血病淋巴细胞株 HL-60 由
福建省血液病研究所陈英玉硕士惠赠，大肠杆菌
JM109、巴斯德毕赤酵母菌 SMD1168（his4pep4）和
酵母分泌型表达载体 pPIC9k 本室保存。各种限制
性内切酶、T4 DNA 连接酶、HS DNA Polymerase with
GC Buffer PCR 扩增试剂盒、pMD18-T 载体、DL2000
DNA 分子标志物（大连宝生物有限公司），蛋白分
子量标准（美国 Generay Biotech 上海公司），质粒抽
提和 DNA 回收试剂盒、G418、蛋白质检测试剂盒
（上海华舜生物工程有限公司），3S 柱离心式酵母基
因组制备试剂盒（上海申能博彩公司），小牛血清
白蛋白（BSA）、生物素、酵母氮源（yeast nitrogen
base, YNB）和硝酸纤维素膜（上海生工公司），ENA
自身抗体谱酶免疫斑点法检测试剂盒（欧蒙杭州医
学实验诊断有限公司），抗 SSA52 标准血清（德国
IMTEC 公司）。电穿孔仪、紫外分光光度计（美国
Bio-Rad 公司），PE 2400 型 PCR 扩增仪（美国 ABI
公司），蛋白半干电转移装置（瑞典 Pharmacia 公司），
GSG-2000 凝胶图像分析系统（珠海黑马医疗仪器
公司）。细菌培养基 LB、LBA（LB 加 100 μg/mL 氨
苄青霉素）、酵母复合培养基 YEPD、MD、BMGY、
BMMY 自制。以 SSA52 编码序列两端自行设计引物，
正向引物 ：5-CCTACGTAATGGCTTCAGCAGCACGC
TTGAC-3（下划线为 SnaB I 限制性酶切位点）、反
向引物 ：5-CCGCGGCCGCTCAATAGTCAGTGGATCC
TTGTGA-3（下划线为 Not I 限制性酶切位点）由上
海英骏生物技术公司合成。
1.1.2 血清来源 患者总数为 126 例，包括经 ENA
自身抗体谱酶免疫斑点试剂盒检测抗 SSA52 阳
性且临床确诊为系统性红斑狼疮（systemic lupus
erythematosus，SLE）患者 82 例，其中，女 54 例，
男 28 例，平均年龄 34 岁 ；抗 SSA52 阳性且临床确
诊为 SS 患者 14 例，其中，女 8 例，男 6 例，平均
年龄 29 岁 ；抗 SSA52 阳性且临床确诊为类风湿关节
炎（rheumatoid arthritis，RA）患者 8 例 , 其中，女
5 例，男 3 例，平均年龄 26 岁 ；抗 SSA52 阳性且临
床确诊为系统性硬化病（systemic sclerosis，SSc）患
者 22 例，其中，女 13 例，男 9 例，平均年龄 36 岁；
健康体检者 50 名，女 25 名，男 25 名，平均年龄
32 岁。常规静脉采血，分离血清，-20℃保存。
1.2 方法
1.2.1 RT-PCR 扩增基因 HL-60 细胞在 5% CO2 孵
箱培养 24-48 h，至 106/mL 收获（最大细胞数 <1×
107），4 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，总 RNA
提取和重组鼠白血病病毒逆转录酶（M-MuLV RT）
第一链 cDNA 合成按试剂盒说明操作。以 HL-60
cDNA 为 模 板 扩 增 U1RNP 70K， PCR 扩 增 条 件 ：
98℃ 10 s、56℃ 5 s、72℃ 90 s，30 个循环。取 10 μL
在 1.0% 琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
1.2.2 PCR 产物的 TA 克隆、鉴定及测序 将胶回
收后的 PCR 产物按 pMD18-T 载体试剂盒操作说明
进行，重组克隆质粒用 SnaB I 和 Not I 双酶切鉴定，
并交上海生工公司测序。
1.2.3 pPIC9k-SSA52 的构建 分别将酶切鉴定、测
序正确的 TA 克隆抽提的质粒和酵母分泌型表达质
粒 pPIC9k，用 SnaB I 和 Not I 双酶切后，电泳回收
所需片段，定向连接，重组质粒经 CaCl2 法转导入
宿主菌 E. coli JM109，挑取转化子，双酶切鉴定并
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期178
交上海生工公司测序。
1.2.4 pPIC9k-SSA52 对毕赤酵母的转化及高拷贝阳
性转化子的筛选 用 Sal I 线性化 pPIC9k-SSA52，以
线性化 DNA 电穿孔法（1 300 V，25 μF，200 Ω）
转化组氨酸合成缺陷型宿主酵母 SMD1168，经组氨
酸缺乏的 MD 平板筛选重组转化子，未重组的组氨
酸缺陷型酵母宿主细胞在 MD 平板上不生长。用含
不同浓度 G418 的 YEPD 平板从转化子中筛选 G418
高抗性的高拷贝转化子。
1.2.5 高拷贝转化子的 PCR 鉴定 按 3S 柱离心式
酵母基因组制备试剂盒操作说明提取高拷贝酵母转
化子 DNA，用 PCR 试剂盒扩增鉴定。
1.2.6 SSA52 的诱导表达 将两株高拷贝转化子分
别接种于 100 mL BMGY 增菌培养基中，30℃振荡过
夜至吸光度 A600 值为 3-6。菌液 5 000 r/min，离心
5 min 弃上清液。沉淀重悬于 25 mL BMMY 诱导培养
基中。30℃振荡培养，持续 3 d，每天补加体积百分
数为 0.5% 的甲醇，离心后弃沉淀，上清液经 80%
硫酸铵沉淀后复溶，置 -20℃保存。无外源基因的空白
载体 pPIC9k 转入宿主菌作为阴性对照，同样条件诱
导表达。
1.2.7 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-
PAGE） 取 -20℃保存的表达产物 20 μL 与 2× 上样
缓冲液等体积混合后上样，电泳后考马斯亮蓝 R250
染色。
1.2.8 蛋白质印迹法（Western blot）鉴定 利用半
干电转移仪将 SDS-PAGE 凝胶上的蛋白转移至硝
酸纤维素膜上，5% 脱脂奶粉为封闭试剂，一抗为
抗-SSA52 标准血清，二抗为鼠抗人的辣根过氧化物
酶复合物，在 DAB、H2O2 下显色。
1.2.9 表达产物的纯化 表达产物经 80% 硫酸铵沉
淀后复溶，用 Sephacryl-100 凝胶层析柱过滤纯化，
收集并鉴定目的蛋白峰。
1.2.10 建立 DIGFA 将初步纯化的毕赤酵母重组人
自身抗原 SSA52，用 pH7.4 PBS 缓冲液溶解至浓度
约0.5 g/L，取1 μL点加在硝酸纤维素膜上，37℃烘干，
用 10 g/L BSA 封闭，烘干后，装于自制的渗滤盒中。
在反应孔内加 100 μL 被检血清，待其完全渗入，滴
加 A 试剂（金标 SPA ） 3 滴，待渗入，再滴加 B 试
剂（0.01 mol/L，pH7.4 PBS） 2 滴，待渗入后观察结果。
在反应孔内出现红色斑点为抗 SSA52 抗体阳性 ；不
出现红色斑点为阴性。
1.2.11 DIGFA 与欧蒙酶免疫斑点法的对比分析 用
两种方法检测搜集的各类标本血清，根据检测结果
进行方法学评价。
1.2.12 统计学分析 采用 SAS8.1 进行校正配对 χ2
检验。
2 结果
2.1 SSA52基因的扩增
RT-PCR 显示（图 1）一条约 1 400 bp 扩增条
带，其大小与 SSA52 编码序列 1 428 bp 相符。
2.2 pMD18-TA克隆及pPIC9k-SSA52重组子的双酶
切鉴定图谱
经 SnaB I 和 Not I 双酶切后，得到 2 条片段（图
2），符合预期结果。
M.DL2000 分子标准带 ；1.SSA52 基因
RT-PCR 扩增产物
图 1 SSA52基因 RT-PCR扩增产物电泳图
A:M.DL2000 分子量标准 ; 1-3. 经 SnaB I 和 Not I 双酶切 pMD18-TA-SSA52 ；
B: M.DL2000 分子量标准 ; 1-3. 经 SnaB I 和 Not I 双酶切 pPIC9k-SSA52
图 2 重组质粒酶切电泳图
2012年第4期 179杨湘越等 ：人自身抗原 SSA52 的酵母重组分泌表达及其斑点免疫金渗滤法的建立
2.3 pMD18-TA克隆及pPIC9k-SSA52重组子的序
列测定
测序图谱与美国 GenBank 核酸数据库报道的
人 SSA52 基因编码序列完全一致。部分测序图谱见
图 3、图 4。
2.6 DIGFA检测
抗-SSA52 阳性、阴性血清各一份经 DIGFA 检
测后仅前者呈红色斑点（图 7），证明表达产物具有
天然 SSA52 蛋白的免疫原性。
划线处为 5端 SnaB I 酶切位点
图 3 pMD18-TA-SSA52重组质粒 5端测序
划线处为 5端 SnaB I 酶切位点
图 4 pPIC9K-SSA52重组质粒 5端测序图
2.4 高拷贝SSA52酵母重组菌的PCR鉴定
PCR 产物（图 5）符合预期。
M.DL2000 分子标准带 ；1-3. 酵母重组菌 PCR 扩增产物
图 5 高拷贝 SSA52酵母重组菌 PCR电泳图
2.5 SDS-PAGE和Western blot分析
高拷贝阳性表达菌表达了一条相对分子质量约
52 kD 的仅能被抗 SSA52 标准血清识别的特异性蛋
白条带（图 6）。
M. 蛋白质分子量标准；1, 2. 高拷贝阳性表达菌；3.pPIC9k 空载体阴性对照；
4. Western blot 结果
图 6 表达产物的 SDS-PAGE和Western blot结果
1. 阳性点样 ；2. 阴性点样
图 7 表达产物的 DIGFA分析
2.7 两种方法检测抗-SSA52 抗体结果比较
用 DIGFA 法对欧蒙 ENA 酶斑点法抗 -SSA52 抗
体阳性且临床确诊的 126 例患者和 50 例健康体检
者标本检测，有 6 例患者为阴性，有 3 例健康体检
者为阳性，后者可能是由于酵母重组 SSA52 蛋白纯
化不彻底，而该受检者体内存在抗酵母抗体所致。
DIGFA 的阳性符合率为 95.2%（120/126），阴性符合
率为 94.0%（47/50），总体符合率为 94.9%（167/176）。
采用 SAS8.1 进行校正配对 χ2 检验，显示两种方法检
测结果差异无统计学意义（χ2 =0.44，P>0.05），见表 1。
3 讨论
自身免疫性疾病广泛存在致病机制复杂，迁延
不愈，诊断困难等特点，而患者体内的自身抗体确
实早于自身免疫性疾病发生多年，可作为早期诊断
的分子标志物［4］。目前，在实验室检测方面，自身
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期180
抗体是诊断自身免疫性疾病的唯一手段。抗 SSA52
抗体、抗 SSA60 抗体以及抗 SSB 抗体是判断 SS 的
三个主要指标，但抗 SSA52 抗体较为特殊，在其他
自身免疫性疾病和感染性疾病中也常出现，似无疾
病特异性，其阳性率为 5%-81% 不等，如原发性
SS（40%-80%）、SLE（30%-40%）、原发性胆汁性
肝硬化（PBC）（20%）、自身免疫性肝炎（AIH）、
多发性肌炎（PM）、SSc、RA 等，该抗体还可经胎
盘传给胎儿引起炎症反应和新生儿先天性完全房室
传导阻滞（congenital complete atrioventricular block，
CAVB）［1］。
人自身抗原 SSA52 为真核蛋白，在其产生过
程中，蛋白翻译后修饰加工是其特征之一，而原核
表达系统缺乏于此，为获取和保留 SSA52 天然蛋白
的完整抗原信息，人源真核基因在真核系统表达较
原核系统更为适宜［5］。巴斯德毕赤酵母真核表达系
统的表达产物在乙酰化、糖基化、磷酸化、二硫键
空间折叠等方面已接近天然蛋白水平，尤其在免疫
原性上明显增强，适合表达蛋白疫苗及诊断用重组
抗原［5, 6］。
本研究首次成功用酵母分泌表达人源 SSA52 蛋
白，该重组蛋白背景简单、易于纯化且完整保留天
然蛋白的免疫原性。我们以此作为配体，初步建立
了检测抗 SSA52 抗体的 DIGFA，虽然在 126 例阳性
标本中检出 6 例阴性，可能是敏感性稍低所致，但
与较为可靠的欧蒙 ENA 酶斑点法比较，总体符合率
还是达到一致要求。总之，建立的 DIGFA 不仅克服
了欧蒙 ENA 酶斑点法耗时且操作繁琐的缺点，而且
更为简便快速且结果准确，不需任何仪器设备，对
环境无特殊要求，只需 3-5 min，肉眼即可观察结果。
此外，欧蒙 ENA 酶斑点法不能单独检测抗 SSA52 自
身抗体，本法可单独检测，标本随到随测，方便临
床应用，可望成为临床常规检测方法之一。
4 结论
本研究采用巴斯德毕赤酵母分泌型表达系统，
成功实现了人自身核抗原 SSA52 的重组表达，并以
此为配体建立了简便快速的 DIGFA 检测方法，经与
欧蒙酶免疫斑点法比较，阳性符合率为 95.2%，阴
性符合率为 94.0%，总符合率为 94.9%，两种方法的
检测结果无统计学显著性差异（P>0.05），可以替代
进口试剂，为临床自身免疫病诊断提供新的可选方
法。
参 考 文 献
［1］ Defendenti C, Atzeni F, Spina MF, et al. Clinical and laboratory
aspects of Ro/SSA-52 autoantibodies. Autoimmun Rev, 2011, 10 （3）:
150-154.
［2］ 邓安梅 , 仲人前 , 黄超 , 等 . 自身抗原 Ro 52 kd 多肽分子 cDNA
表达克隆的构建及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达 . 中国免疫
学杂志 , 1998，14（1）：54-56.
［3］ 娄瑞娟 , 罗利龙 , 张霞 , 等 . 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究
进展和前景展望 . 生物学杂志 , 2010, 27（5）：73-76.
［4］ Scofield RH. Autoantibodies as predictor of disease. Lancet, 2004,
363: 1544-1546.
［5］ 章如安 , 杨晟 , 邱荣德 , 等 . 巴斯德毕赤酵母表达体系研究及进
展 . 微生物学通报 , 2000, 27（5）:371-373.
［6］ 杨湘越 , 兰小鹏 , 颜宏利 , 等 . 毕赤酵母重组猪囊尾蚴抗原 cC1
的特征研究 . 中国人兽共患病杂志 , 2004，20（3）:241-243.
（责任编辑 李楠）
表 1 两种方法检测抗 SSA52 抗体结果比较（例数）
DIGFA
欧蒙 ENA 酶斑点法
合计
阳性 阴性
阳性 120 3 123
阴性 6 47 53
总计 126 50 176