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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
传统化石能源储量的日益减少，温室气体排放
的加剧及油价的飙升使得全球对寻找可再生燃料的
关注度越来越高［1］。生物柴油可减少 57%-86% 的
温室气体排放，被广泛研究及开发。至今，生物柴
油的原料主要来自油料作物（如大豆、玉米、麻疯
树等）、动物脂肪和餐饮废油［2］，由这些原料生产的
生物柴油成本较高，且远远不能满足运输所需。微
藻作为高光合生物有其特殊的原料成本优势，以微
藻作为载体生产的可再生生物柴油可以满足全球需
求［3］。微藻发酵具有生长速度快、油脂含量高、不
与粮争田、环保等优点［5］。并且，微藻生物燃料无毒，
收稿日期 ： 2014-02-10
基金项目 ：四川大学青年教师科研启动基金项目（2014SC011058）
作者简介 ：孙远，女，硕士研究生，硕士，研究方向 ：微生物发酵 ；E-mail ：suny88@163.com
通讯作者 ：张永奎，博士，教授，博士生导师，研究方向 ：应用微生物 ；E-mail ：zhangyongkui@scu.edu.cn
Fe3+ 对小球藻的生长及油脂含量的影响
孙远  刘文彬  周铁柱  谢通慧  梁斌  张永奎
（四川大学化学工程学院制药与生物工程系，成都 610065）
摘 要 ： 传统化石能源储量日益减少，生物柴油因其环保可再生性成为优质的石化柴油替代品。利用小球藻生产生物柴油
速度快、油脂含量高，受到了广泛关注。为进一步提高小球藻生产生物柴油效率，分别探究了 Fe3+ 的浓度及添加时间对自养和
异养小球藻生长及产油的影响，获得最优 Fe3+ 培养条件为 ：自养小球藻延滞期添加 10-3 g/L Fe3+，生物量及油脂含量达 2.80 g/L 及
30.90% ；异养小球藻指数期添加 10-5 g/L Fe3+，生物量及油脂含量达 3.30 g/L 及 29.05%。经脂肪酸分析，以上条件获得的微藻油脂
均可作为生物柴油生产原料。
关键词 ： 小球藻 Fe3+ 自养 异养 生长 油脂
Effects of Fe3+ on the Growth and Oil Content of Chlorella vulgaris for
Biodiesel Production
Sun Yuan Liu Wenbin Zhou Tiezhu Xie Tonghui Liang Bin Zhang Yongkui
（Department of Pharmaceutical & Biological Engineering，School of Chemical Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065）
Abstract:  Biodiesel is a clean renewable energy as the high quality substitute for traditional diesel. Chlorella vulgaris, used for biodiesel
production, has been gaining the attention of the society because of its fast growth and high oil content. Iron ion could improve the growth and oil
content of C. vulgaris. Effects of the concentration of Fe3+and the time to add Fe3+on the growth and oil content of autotrophic and heterotrophic
C. vulgaris were explored in this study. The best conditions of Fe3+ were as follow ：（1）10-3 g/L Fe3+ added in the lag phase of autotrophic C.
vulgaris, biomass of 2.80 g/L and oil content of 30.90% were obtained, （2）10-5 g/L Fe3+ added in the exponential phase of heterotrophic C.
vulgaris, biomass of 3.30 g/L and oil content of 29.05% were obtained. And the oil produced by C. vulgaris under autotrophic and heterotrophic
conditions was an ideal feedstock for biodiesel production.
Key words:  Chlorella vulgaris Fe3+ Autotrophy Heterotrophy Growth Oil content
可生物降解［6］。
微藻细胞可进行自养和异养生长，自养微藻利
用 CO2 进行光合作用，可在一定程度减少温室气体
的排放，利于环境保护。但自养微藻产量较低［7］，
对光照及空气含量具有依赖性。异养微藻可同时实
现高细胞浓度及油脂含量［8］，并且不依赖于光照和
空气。但其昂贵的原料成本制约着异养微藻生产商
业化［9］。在自然条件下微藻中的油脂含量，一般是
生物量的 14%-30%（W/W）［9，11］。
大量研究表明，众多无机元素，如氮、磷、钾、
镁、钙、硫、铁、铜、锰及锌等都对微藻生长有
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期182
着一定的影响。此外，氯、钼等微量元素对微藻
的生命活动也起着重要作用，常常被包括在藻类
的微量元素配方之中。经过 12 年的现场试验研究，
Behrenfeld 等［12］发现在高氮低叶绿素及贫营养水域
中，铁对浮游植物的生长与油脂积累起到了关键作
用。很多科学家也对其机理做了研究，但遗憾的是
至今科学界还没有得出一个公认的结果，但普遍认
为可能是铁离子在脂质积累过程中调节了某些与脂
质合成相关的酶的表达，主要是 Fe3+ 能影响细胞色
素氧化酶的铁卟啉的合成。因此，本研究主要进行
Fe3+ 对小球藻自养和异养生长及产油影响的分析，
获得利于小球藻自养和异养生长及产油的最优 Fe3+
浓度及添加时间，旨在为进一步提高小球藻生产生
物柴油效率奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试样藻种 本课题组前期从水样中筛选获得
的普通小球藻（Chlorella vulgaris）［4］。
1.1.2 培养基 种子液培养在添加了 10 g/L 葡萄糖
的 SE 培养基中，其组成如下：0.75 g/L NaNO3，0.025
g/L CaCl2·2H2O，0.075 g/L MgSO4·7H2O，0.075 g/L
K2HPO4·3H2O，0.175 g/L KH2PO4，0.025 g/L NaCl，
0.005 g/L FeCl3·6H2O，1 mL/L Fe-EDTA，1 mL/L
A5，40 mL/L Soil extract。发酵培养基为改良的 SE
培养基，根据试验设计含有不同铁离子浓度（Fe-
EDTA）。自养培养基中不含有葡萄糖，异养培养基中
含有 10 g/L 葡萄糖，接种量均有 10%（V/V）。
1.1.3 培养条件 取新鲜培养基装入 100 mL/250 mL
三角瓶中，高压灭菌后（115℃，30 min），接入种子
液，转速 180 r/min，温度 28℃。
1.2 方法
1.2.1 生长情况测定
1.2.1.1 光密度法 利用紫外 / 可见分光光度计测定
680 nm 处藻液的吸光度值（OD 值），蒸馏水作参比。
根据藻液的 OD680 值监测微藻细胞的生长状况。
1.2.1.2 细胞干重法 发酵结束后，取一定体积藻
液将藻液于 4 800 r/min 下离心 10 min，水洗 3 次，
去除上清液。烘干下层藻体至恒重，获得微藻细胞
的生物量（g/L）。
1.2.2 油脂含量及脂肪酸含量测定 发酵结束后，
对干藻粉进行传统的氯仿-甲醇提取［13］，细胞内部
油脂被提取出来，从而获得小球藻油脂产量（g/L）。
并根据下列公式计算得到小球藻油脂含量 ：
油脂含量（%）= 油脂产量（g/L）/ 生物量（g/L）
提 出 的 微 藻 油 脂 甲 酯 化 后 进 行 气 质 联 用
（GC/MS-QP2010，Shimadzu，Japan）分析其脂肪酸
成分［4，13］。
1.2.3 统计学分析 所有试验设有 3 个平行样，计
算平均值后绘制曲线进行分析，误差通过平行样
与平均值 的偏差获得。 试 验结果进行 Origin 8 的
ANOVA 显著分析。
2 结果
2.1 Fe3+对小球藻自养生长及产油的影响
2.1.1 Fe3+ 浓度对小球藻自养生长及产油的影响
为探究 Fe3+ 对小球藻自养培养条件下的生长及产油
的影响情况，小球藻在含有 10-1、10-3、10-5 和 10-7
g/L Fe3+ 的 SE 培养基中的自养生长被监测，结果（图
1）显示，低浓度的 Fe3+（10-3、10-5 和 10-7 g/L）有
利于小球藻的生长，并且 Fe3+ 对小球藻生长的促进
作用在此浓度范围内（10-7-10-3 g/L）随浓度的增加
而增强。当 Fe3+ 浓度达到 10-3 g/L 时，对小球藻生
长的促进作用不再增强，反而出现抑制作用，小球
藻在 10-3 g/L Fe3+ 培养条件下的生长甚至低于培养基
中无 Fe3+ 的情况。
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10-1 g/L
10-3 g/L
10-5 g/L
10-7 g/L
图 1 Fe3+ 浓度对小球藻自养生长的影响
发酵结束后，比较不同 Fe3+ 浓度培养条件下小
球藻的生长及油脂含量可知，微藻细胞密度、生物
量及油脂含量均在 10-3 g/L Fe3+ 培养条件下取得最大
2014年第4期 183孙远等 ：Fe
3+ 对小球藻的生长及油脂含量的影响
值（表 1）。此培养条件下，小球藻生物量达到 2.80
g/L，约为不含 Fe3+ 培养条件下小球藻生物量的 1.04
倍。关于小球藻的油脂含量，在 10-3 g/L Fe3+ 自养培
养条件下高达 30.90%，较不含 Fe3+ 培养条件下其油
脂含量提高了 42.66%。Fe3+ 浓度不同，小球藻油脂
含量出现了显著的区别，而且 Fe3+ 对小球藻油脂含
量的增强幅度大于 Fe3+ 对小球藻生物量的增加幅度，
说明 Fe3+ 对小球藻的油脂积累有较大的影响作用。
表 1 不同 Fe3+ 浓度培养条件下自养小球藻的细胞密度、
生物量及油脂含量
Fe3+ 浓度
（g/L）
细胞密度
（×106 个 /mL）
生物量
（g/L）
油脂含量
（%）
0 9.08±0.11 2.68±0.01 21.66±0.09
10-1 8.45±0.30 2.04±0.32 4.12±0.26
10-3 11.02±0.21 2.80±0.11 30.90±0.03
10-5 10.01±0.17 2.78±0.19 26.66±0.21
10-7 9.22±0.18 2.72±0.27 17.70±0.12
2.1.2 Fe3+ 的添加时间对小球藻自养生长及产油的
影响 根据上述试验结果，选定 10-3 g/L 作为 Fe3+
的添加浓度，分别在小球藻的延滞期、对数期及稳
定期时添加 Fe3+，对小球藻的生长及产油情况进行
监测，结果（图 2，表 2）显示。延滞期添加 Fe3+
后的第 1 天，小球藻快速生长，相对于稳定期添加
Fe3+ 小球藻的生长具有一定程度的提高（34%）。进
入第 2 天后，小球藻的生长显著加快，进入稳定期
后其细胞密度约高于指数期及稳定期时添加 Fe3+ 获
得细胞密度的 1.5 倍（图 2）。
发酵结束后，对比 Fe3+ 不同添加时间获得的小
球藻的生物量及油脂含量可知，延滞期添加 Fe3+，
小球藻的生物量及油脂含量均高于其他两个时期添
加 Fe3+ 获得的生物量及油脂含量。
表 2 不同时间添加 Fe3+ 对自养小球藻细胞密度、生物量
和油脂含量的影响
Fe3+ 添加
时间
细胞密度
（×106 个 /mL）
生物量
（g/L）
油脂含量
（%）
延滞期 11.02±0.21 2.80±0.11 30.90±0.03
指数期 8.00±0.15 2.60±0.17 24.03±0.21
稳定期 7.13±0.23 2.55±0.19 21.70±0.14
2.2 Fe3+对小球藻异养生长及产油的影响
2.2.1 Fe3+ 浓度对小球藻异养生长及产油的影响
如图 3 所示，培养基中 Fe3+ 浓度不同，小球藻的生
长差异较大。较高浓度的 Fe3+ 不利于小球藻的生长，
10-1 和 10-3 g/L Fe3+ 条件下小球藻的生长状况甚至低
于不添加 Fe3+ 时小球藻的生长。而低浓度的 Fe3+（10-5
和 10-7 g/L）有利于小球藻的生长。发酵结束后，根
据小球藻的生物量及油脂含量（表 3）得出，低浓
度 Fe3+ 条件下（10-5 和 10-7 g/L）小球藻的生长大大
优于高浓度 Fe3+ 条件下（10-1 和 10-3 g/L）小球藻的
生长，前者约为后者的 2.8 倍。小球藻油脂含量在
10-1 g/L Fe3+ 的培养条件下最低，其他 Fe3+ 浓度条件
下小球藻的油脂含量差异不大。结合小球藻的异养
生长，则 10-5 g/L Fe3+ 培养条件较优。
表 3 不同 Fe3+ 浓度培养条件下异养小球藻的细胞密度、
生物量和油脂含量
Fe3+ 浓度
（g/L）
细胞密度
（×106 个 /mL）
生物量
（g/L）
油脂含量
（%）
0 16.92±0.17 2.73±0.26 19.60±0.18
10-1 1.02±0.22 1.02±0.07 7.68±0.14
10-3 1.48±0.09 1.06±0.31 28.80±0.06
10-5 17.83±0.13 2.98±0.11 27.41±0.14
10-7 17.82±0.15 2.81±0.18 21.02±0.23
2.2.2 Fe3+ 的添加时间对小球藻异养生长及产油的
影响 分别对进入延滞期、对数期及稳定期的小球
藻培养基中添加 10-5 g/L Fe3+，小球藻的生长及产油
情况如图 4 和表 4 所示。延滞期及对数期添加 Fe3+，
小球藻的生长约为稳定期添加 Fe3+ 时小球藻生长的
2 倍。这表明，小球藻生长的前期对 Fe3+ 的促进作
用较敏感，待到小球藻生长至稳定期后，利用 Fe3+
来促进小球藻的生长则较为困难。对比延滞期与对
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培养时间d
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图 2 Fe3+ 添加时间对小球藻自养生长的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期184
数期添加 Fe3+ 时小球藻的油脂含量，对数期添加
Fe3+ 获得的小球藻的油脂含量略有优势，达到了生
物量的 29.05%，约为延滞期添加 Fe3+ 获得的小球藻
的油脂含量的 1.06 倍。综合考虑小球藻的异养生长
及产油，Fe3+ 的最佳浓度及添加时间分别为 10-5 g/L
和指数期。
2.3 脂肪酸组成
分别对自养小球藻在延滞期添加 10-3 g/L Fe3+
培养条件下获得的油脂及异养小球藻在指数期添加
10-5 g/L Fe3+ 培养条件下获得的油脂进行脂肪酸组成
测定，结果如图 5 所示。自养及异养小球藻脂肪酸
组成主要为 C16 和 C18 类脂肪酸。本试验中，自养
及异养条件下 C18 ：1 占总脂肪酸的比例相当，异养
条件下 C16 ：1 含量较自养条件下 C16 ：1 含量多。
根据经验公式计算［14］，得到自养及异养条件下生
长的小球藻生产出的油脂十六烷值分别为 68.29 和
63.41。根据 Pétursson［15］的研究，计算得到自养及
异养条件下小球藻油脂的碘值分别为 54.59 I2/ 100 g
和 71.78 I2/ 100 g。
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图 3 不同 Fe3+ 浓度对小球藻异养生长的影响
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图 4 Fe3+ 添加时间对小球藻异养生长的影响
㜲㛚
䞨ਜ਼
䟿%

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0 㠚ޫ ᔲޫ
C 16:3
C 16:2
C 16:1
C 16:0
C 18:3
C 18:2
C 18:1
C 18:0
图 5 自养及异养培养条件下小球藻脂肪酸的主要成分
表 4 不同时间添加 Fe3+ 对异养小球藻细胞密度、生物量
和油脂含量的影响
Fe3+ 添加
时间
细胞密度
（×106 个 /mL）
生物量
（g/L）
油脂含量
（%）
延滞期 17.83±0.13 2.98±0.11 27.41±0.14
指数期 19.91±0.17 3.30±0.05 29.05±0.19
稳定期 14.46±0.22 1.87±0.14 19.36±0.18
3 讨论
小球藻自养生长时，Fe3+ 可以促进了与微藻生
长繁殖有关的基因表达，从而提高微藻的细胞密度
及生物量［16］。因此，当培养基中添加了 Fe3+ 后，小
球藻的生长优于其在不含 Fe3+ 的培养环境下的生长。
此外，Fe3+ 对小球藻的油脂合成途径中某些关键基
因的表达也具有影响，如 Fe3+ 可以影响 rbcL、accD
和 PAP1 等基因的表达，从而诱导小球藻的油脂生
成［12， 17］。因此，小球藻在含有 Fe3+ 的培养环境中生长，
有利于其油脂积累。Liu 等［18］以小球藻为研究对象，
也发现了同样的结果。但是，并非 Fe3+ 在加入培养
基以后，便立即对小球藻的生长发挥促进作用。而
是在 Fe3+ 加入培养基中一定时间后，其促进作用才
得到充分发挥。因此，在小球藻生长的稳定期添加
Fe3+，有利于 Fe3+ 更好地发挥其对小球藻生长的促
进作用。Fe3+ 对小球藻油脂积累的作用类似于其对
小球藻生长的促进作用。在小球藻生长的稳定期向
培养基中添加 Fe3+，则有较为充裕的时间使 Fe3+ 对
小球藻的油脂合成途径中关键基因的表达发生作用，
从而生成更多的油脂。综合以上因素，利于自养小
球藻生长及产油的最佳 Fe3+ 条件为 ：在小球藻生长
的延滞期添加 10-3 g/L Fe3+。
2014年第4期 185孙远等 ：Fe
3+ 对小球藻的生长及油脂含量的影响
小球藻异养生长时，Fe3+ 对小球藻发生促进作
用具有一定的浓度限制，并非 Fe3+ 浓度越高对小球
藻生长的促进作用越好。如本实验的结果，培养基
中 Fe3+ 浓度为 10-5 g/L 和 10-7 g/L 时，小球藻的生长
优于高浓度 Fe3+ 培养条件下小球藻的生长。并且，
当小球藻生长至稳定期时利用 Fe3+ 来促进小球藻的
生长较为困难，可能由于此时小球藻的生长已达到
一定水平，细胞的活跃程度不高，对 Fe3+ 的敏感度
不高，使得 Fe3+ 无法较好地发挥其促进作用，因此
得到小球藻的生物量及油脂产量较低。综合考虑得
到利于异养小球藻生长及产油的最佳 Fe3+ 条件为 ：
在小球藻生长的指数期添加 10-5 g/L Fe3+。
自养及异养小球藻油脂的主要成分为 C16 和
C18 类脂肪酸，此类脂肪酸是生物柴油生产利用的
主要脂肪酸，与贾彬等［19］报道的结果一致。其中，
十八碳三烯酸（C18:3）为细胞结构的主要构成成
分［20］。C18:1 和 C16:1 两类脂肪酸有利于生物柴油
的氧化稳定性及寒冷环境下的性能稳定性［21］。考虑
生物柴油的品质，试验获得油脂十六烷值及碘值均
符合欧洲的 EN 14214 标准。由此可知，实验获得的
微藻油脂可以作为优质的原料用于生物柴油生产。
4 结论
探究了 Fe3+ 对小球藻生长及产油的影响，获得
利于自养和异养小球藻生长及产油的最佳 Fe3+ 浓度
及添加时间分别为 ：延滞期添加 10-3 g/L Fe3+ 和指数
期添加 10-5 g/L Fe3+。最优 Fe3+ 培养条件下，获得的
自养及异养小球藻的生物量分别为 2.80 g/L 和 3.30
g/L，油脂含量分别为 30.90% 和 29.05%。经过对微
藻油脂的脂肪酸组成分析，得出自养及异养小球藻
在最优 Fe3+ 培养条件下生产的油脂均可作为生物柴
油的生产原料。
参 考 文 献
［1］ Aubert S, Gout E, Bligny R, et al. Multiple effects of glycerol on
plant cell metabolism. Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance
studies［J］. Int J Biol Chem, 1994, 269（34）：21420-21427.
［2］ Lin J, Shen H, Tan H, et al. Lipid production by Lipomyces starkeyi
cells in glucose solution without auxiliary nutrients［J］. J Biotech-
nol, 2011, 152（4）：184-188.
［3］ 宋东辉， 侯李君， 施定基 . 生物柴油原料资源高油脂微藻的开
发利用［J］. 生物工程学报 , 2008, 24（3）：341-348.
［4］ Chisti Y. Biodiesel from microalgae［J］. Biotechnol Adv, 2007, 25
（3）：294-306.
［5］ Xie T, Sun Y, Du K, et al. Optimization of heterotrophic cultivation
of Chlorella sp. for oil production［J］. Bioresour Technol, 2012,
118 ：235-242.
［6］ McPhee WA, Boucher M, Stuart J, et al. Demonstration of a liquid-tin
anode solid-oxide fuel cell（LTA-SOFC）operating from biodiesel
fuel［J］. Energy Fuels, 2009, 23（10）：5036-5041.
［7］ 缪晓玲 , 吴庆余 . 微藻生物质可再生能源的开发利用［J］. 可
再生能源 , 2003, 3（109）：13-16.
［8］ Qiao H, Wang G. Effect of carbon source on growth and lipid
accumulation in Chlorella sorokiniana GXNN01［J］. Chin J
Oceanol Limnol, 2009, 27 ：762-768.
［9］ Hoque ME, Singh A, Chuan YL. Biodiesel from low cost feedstocks ：
The effects of process parameters on the biodiesel yield［J］.
Biomass Bioenergy, 2011, 35（4）：1582-1587.
［10］ Spolaore P, Joannis-Cassan C, Duran E, et al. Commercial
applications of microalgae［J］. J Biosci Bioeng, 2006, 101（2）：
87-96.
［11］ 蒋汉明 , 高坤山 . 氮源及其浓度对三角褐指藻生长和脂肪酸组
成的影响［J］. 水生生物学报 , 2004, 28（5）：545-551.
［12］ Behrenfeld MJ, Worthington K, Sherrell RM, et al. Controls on
tropical Pacific Ocean productivity revealed through nutrient stress
diagnostics［J］. Nature, 2006, 442（7106）：1025-1028.
［13］ Wang W, Zhou W, Liu J, et al. Biodiesel production from
hydrolysate of Cyperus esculentus waste by Chlorella vulgaris［J］.
Bioresour Technol, 2013, 136 ：24-29.
［14］ 陈林 , 王忠 , 李铭迪 , 等 . 生物柴油组分与十六烷值关系研
究［J］. 中国油脂 , 2012, 37（1）：53-56.
［15］ Pétursson S. Clarification and expansion of formulas in AOCS
recommended practice Cd 1c-85 for the calculation of lodine value
from FA composition［J］. J Am Oil Chem Soc, 2002, 79（7）：
737-738.
［16］ 陈莉 , 梁文艳 , 王金丽 , 等 . 铁对铜绿微囊藻生长活性及产毒
的影响［J］. 安全与环境学报 , 2009, 9（4）：21-24.
［17］ Michel KP, Pistorius EK. Adaptation of the photosynthetic electron
transport chain in cyanobacteria to iron deficiency ：the function of
IdiA and IsiA［J］. Physiol Plant, 2004, 120（1）：36-50.
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期186
［18］ Liu Z, Wang G, Zhou B. Effect of iron on growth and lipid
accumulation in Chlorella vulgaris［J］. Bioresour Technol, 2008,
99（11）：4717-4722.
［19］ 贾彬 , 王亚南 , 何蔚红 , 等 . 生物柴油新原料——微生物油
脂［J］. 生物技术通报 , 2014（1）：19-26.
［20］ Garcí MC, Sevilla JF, Fernández FA, et al. Mixotrophic growth of
Phaeodactylum tricornutum on glycerol ：growth rate and fatty acid
profile［J］. J Appl Phycol, 2000, 12（3-5）：239-248.
［21］ Pinzi S, Garcia I, Lopez-Gimenez F, et al. The ideal vegetable oil-
based biodiesel composition ：a review of social, economical and
technical implications［J］. Energy Fuels, 2009, 23（5）：2325-
2341.
（责任编辑 李楠）