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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第5期
TGF-β 超家族包括 40 个结构相关成员，它们
参与细胞的增殖、分化、粘附、迁移和凋亡等生物
学效应［1，2］。这些成员通过与具有丝氨酸 / 苏氨酸
激酶活性的两种膜受体（Ⅰ型和 II 型）结合和装配
收稿日期：2013-10-31
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30972280），四川省教育厅自然科学基金资助项目（11ZA241）
作者简介：曾凡才，男，博士，研究方向：肿瘤分子生物学；E-mail ：zfcai@sina.com
通讯作者：周红，男，教授，研究方向：比较免疫学和肿瘤分子生物学；E-mail ：zhouhongzh@uestc.edu.cn
针对 ALK4 基因的 TALEN 质粒构建与活性鉴定
曾凡才1，2  顾洪2  王轲2  周红1
（1. 电子科技大学生命科学与技术学院，成都 610054 ；2. 泸州医学院生物化学与分子生物学实验室，泸州 646000）
摘  要：  旨在利用类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技术构建具有活性的
敲除类激活素激酶受体 4（Activin receptor-like kinase 4，ALK4）的 TALEN 质粒。利用 TALEN 在线设计工具，根据 TALEN 设计原
则和 ALK4 剪接异构体的共同序列确定基因敲除的靶位点、TALEN 识别序列和用于活性验证的限制性酶切位点。利用质粒文库试
剂盒快速构建 TALEN 质粒，并通过酶切、测序和 BLAST 比对加以验证。应用脂质体转染法将构建质粒导入 HEK293T 细胞，通过
共转染的 pEGFP-N1 质粒判断转染效率。利用嘌呤霉素进行阳性筛选后提取基因组 DNA，PCR 扩增靶序列，Hha Ⅰ酶切纯化后的
PCR 产物。结果显示，来自转染 TALEN 质粒细胞基因组的 PCR 产物的酶切效率明显下降，提示部分细胞的 ALK4 基因发生了突变。
首次成功构建了在 HEK293T 细胞中有活性的 TALEN 质粒。
关键词：  类激活素激酶受体 4  类转录激活因子效应物核酸酶  基因敲除  HEK293T 细胞  质粒构建
Construction and Activity Assay of Transcription Activator-like
Effector Nuclease（TALEN）Plasmids for ALK4 Gene Knock-out
Zeng Fancai1，2 Gu Hong2 Wang Ke2 Zhou Hong1
（1. School of Life Science and Technology，University of Electronic Science and Technology of China，Chengdu 610054 ；
2. Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology，Luzhou Medical College，Luzhou 646000）
Abstract:  The plasmids of transcription activator-like effector nuclease（TALEN）to knock out Activin receptor-like kinase 4（ALK4）
was obtained. Firstly, using a TALEN design tool online, the target sites of gene knock-out, TALEN recognition sequence and the restriction
site for evaluating TALEN activity were defined according to the design rule and the common sequence of ALK4 variants. Secondly, the TALEN
plasmids were constructed using a TALEN construction kit, and then confirmed by enzyme cutting, sequencing and BLAST analysis. Thirdly, the
plasmids were transfected into HEK293T cells by lipofection and the transfection efficiency was assessed by observing the expression of pEGFP-
N1 plasmid. After positive screening by puromycin, the genomic DNA of cells was extracted as the template, and the PCR products containing
target sequence were digested by Hha I. The results showed that the cleavage efficiency of this enzyme for PCR products from genomic DNA of
cells tranfected with TALEN plasmids was significantly lower than that from the cells without TALEN, suggesting that ALK4 genes may undergo
mutation due to TALEN activity. These TAELN plasmids provide a valuable basis for constructing various cell lines with ALK4 knock-out and
understanding the function role of ALK4.
Key words:  Activin receptor-Like kinase 4 Transcription activator-like effector nuclease Gene knock-out HEK293T cell Plasmid
construction
发挥作用，一般是配体分子先与 II 型受体结合后
招募和激活Ⅰ型受体，激活的Ⅰ型受体促使下游信
号分子 Smads 磷酸化，磷酸化的 Smads 从胞质穿梭
到核并调节靶基因的转录［3，4］。至今，已发现 5 种
2014年第5期 211曾凡才等：针对 ALK4 基因的 TALEN 质粒构建与活性鉴定
哺乳动物 II 型受体（TβR-II、ActR-IIA、ActR-IIB、
BMPR-II 和 AMHR-II）和 7种 I型受体（Activin rec-
eptor-like kinase 1-7，ALK1-7）［5］，其中Activin 的
II 型受体（ActRIIA 和 ActRIIB）和Ⅰ型受体（ALK4）
除与 Activins 形成复合物外，还结合 GDF1、GDF3、
GDF8（myostatin）和 Nodal 等家族成员，同时这
些配体也激活 ALK4 以外的其它受体信号［6］。因
此，为了更好地研究这些配体和受体的功能及其相
互关系，敲除该信号通路中起关键作用的Ⅰ型受体
ALK4，对阐明这些复杂的信号通路具有重要意义。
类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription
activator-like effector nuclease，TALEN）是一种设计
简便、特异性好和毒性低的基因敲除技术。自 2010
年底应用于基因敲除［7］，目前已在大鼠、小鼠、斑
马鱼、酵母、植物和人类细胞等多种生物体中成
功应用［8］。TALEN 的设计理念主要来自类转录激
活因子效应物（Transcription activator-like effector，
TALE）和另一基因敲除技术锌指核酸酶（Zinc-finger
nuclease，ZFN）的研究成果。TALE 是主要存在于
植物病原体黄单胞菌的一类高度保守的蛋白家族［9］。
TALE 的结构主要由 N 末端的转移结构域（TS）、中
间 DNA 结合结构域、C 末端的核定位信号（NLS）
和转录激活结构域（AD）组成。TALE 的不同主要
在于 DNA 结合结构域中重复片段的数量和重复可
变的双残基（Repeat variable di-residue，RVD）［10］。
RVD 是指每个重复单位中 +12 和 +13 位的氨基酸残
基，它们是实现靶向特异识别 DNA 碱基的关键位点，
随靶点核苷酸序列的不同而异。2009 年，两个研究
小组分别阐明了 TALE 蛋白中 RVD 与靶序列碱基的
对应关系，最常见的 4 种 RVD 与碱基的识别关系分
别是 NI（Asn Ile）-A、NG（Asn Gly）-T、HD（His
Asp）-C 和 NN（Asn Asn）-G［11，12］。 通 过 TALE 蛋
白的氨基酸识别碱基规则，结合锌指核酸酶的研
究成果将 TALE 中的转录激活结构域（AD）替换
成核酸内切酶（Fok Ⅰ）的切割结构域，即构建为
TALEN。人们只要将 TALEN 的 DNA 结合结构域替
换为设计的靶点识别域，即可对基因组的特定靶点
进行切割，从而实现基因打靶。因此，TALEN 技术
的关键步骤是 TALEN 靶点识别域的构建。本试验采
用改进后的质粒文库快速直接构建法，只需一步即
可完成构建反应。鉴于 ALK4 在 TGF-β 超家族信号
通路中的重要性和信号通路本身的复杂性，本研究
详细介绍用于敲除 ALK4 基因的 TALEN 质粒构建过
程，并进一步鉴定其活性，为建立不同的 ALK4 基
因敲除细胞系，研究 ALK4 基因的功能及其与不同
配体之间的关系做准备。
1  材料与方法
1.1  材料
1.1.1 细胞 HEK293T 细胞购自中国科学院上海细
胞库。
1.1.2 试剂和引物 嘌呤霉素购自 Sigma 公司；
Taq DNA 聚合酶、基因组 DNA 提取试剂盒、高纯
度中抽质粒提取试剂盒、核酸分子量标准购自天根
生物有限公司；BamH I、EcoR I 和 Hha I 核酸内切
酶、小抽质粒提取试剂盒购自宝生物（大连）公司；
PCR 产物纯化试剂盒购自罗氏公司；卡那霉素购自
上海生工；LipofectamineTM 2000、DMEM 高糖培养基、
Opti-MEM 液体培养基购自 Invitrogen 公司；pEGFP-
N1 质粒由本实验室保存；TALEN 试剂盒购自上海
斯丹赛生物技术有限公司；测序和引物合成由上海
英骏生物技术有限公司完成。本研究所用引物序列
如表 1所示。
表 1  测序及 PCR 扩增所用引物序列
引物名称 序列（5-3） 用途
305 CTCCCCTTCAGCTGGACAC 测序
306 AGCTGGGCCACGATTGAC 测序
R.W1F CGACCTGCTCTGGGGTAAGG 测序
ALK4-TALEN-F CGCACCTGCATCCCCAAAGTG PCR 扩增
ALK4-TALEN-R GCTAAGCCACTACTCTAAACAC PCR 扩增
1.2  方法
1.2.1 确定 ALK4 基因的靶位点和识别序列 从美
国国家生物技术信息中心（NCBI）搜索到 ALK4 基
因序列。利用TALEN设计专业网站（https：//tale-nt.
cac.cornell.edu/），根据天然TALEs识别序列的特征
和 TALEN 靶点的选择原则［13］，并综合考虑 ALK4
的不同剪接异构体序列，最终确定一个作用靶点和
TALEN 左右臂识别序列。
1.2.2 根据识别序列构建质粒 采用上海斯丹赛生
物技术有限公司的 TALEN 试剂盒构建 TALEN 质粒。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第5期212
这种方法基于含有 TALEN 的 DNA 结合重复序列的
172 个质粒文库模块（图 1），将左、右臂识别序列
的最后一位 T 去除，以 1 个或 2 个碱基组合为一个
模块，首个标记为 1，最后一个标记为 9，依次类推
进行标记。每次必须选择 9 个模块，最后两个模块
必须为双模块。左右臂标记情况见图 1，其中以右
臂为例，模块选择情况见图中粗体加下划线显示，
左臂按照相同方法构建。
据酶切后片段大小，选择符合条件的单克隆测序。
1.2.4 BLAST比对 在网址http：//blast.ncbi.nlm.
nih.gov/Blast.cgi中选择tblastx（使用氨基酸比对），
勾选Align two or more sequences（两序列或更多序列
比对），将拼接好的标准核苷酸序列和测序序列分别
输入到上、下文本框中，在 BLAST 比对结果中查找
比对正确的结果。比对正确的质粒进行反向测序，
其中右臂 TALEN 表达质粒由于插入片段较长，除正
反方向测序外，还在中间设计引物以便测序完整（测
序引物见表 1）。经 BLAST 比对完全正确的单克隆，
用中抽质粒提取试剂盒提取质粒。
1.2.5 最低嘌呤霉素浓度的确定 TALEN 质粒带
有抗嘌呤霉素基因，可利用嘌呤霉素筛选转染阳性
细胞，其最低浓度由以下试验确定：取对数生长期
HEK293T 细胞，生长于 24 孔板（1×105 个/孔），24
h 后分别加入含 0、0.5、1、2、3 和 4 μg/mL 嘌呤霉
素的新鲜筛选培养基，每天更换筛选培养基且监测
存活细胞数量，最终确定 3-4 d 能杀死所有细胞的
最低嘌呤霉素浓度。
1.2.6 转染试验 取对数生长期 HEK293T 细胞，
以 1×106 个/孔的密度接种于 6 孔板中，24 h 后
转染。转染体系如下：左臂 TALEN 质粒 2 µg，右
臂 TALEN 质粒 2 µg，pEGFP-N1 质粒 0.5 µg，Opti-
MEM 2×250 µL，LipofectamineTM 2000 13.5 µL；对
照组细胞不转染。24 h 后观察 GFP 表达并替换成
含 2 μg/mL 嘌呤霉素的筛选培养基。每天更换筛选
培养基，观察到对照细胞全部死亡后，收集试验组
细胞，一半细胞继续培养，一半细胞用于提取基因
组 DNA。对照组不进行细胞转染和不加筛选培养基，
直接提取基因组 DNA。
1.2.7 PCR 扩增和酶切鉴定 提取 HEK293T 细胞基
因组 DNA，定量后进行 PCR 扩增，反应体系为：基
因组 DNA 2 µL、10 mmol/L dNTPs 1 µL、2.5 mmol/L
Mg2+ 4 µL、10 pmol/L ALK4-TALEN-F 和 ALK4-
TALEN-R 各 1 µL、Taq DNA 聚 合 酶 1 µL、10×PCR
Buffer 5 µL 和 ddH2O 35 µL。扩增程序为：95℃ 5
min；94℃ 30 s，60℃ 30 min，72℃ 30 s，共 30 个
循环；72℃ 10 min。取 5 µL PCR 产物电泳鉴定，剩
余 PCR 产物纯化后 Hha Ⅰ内切酶处理：Hha Ⅰ 1
µL，10×M Buffer 2 µL，PCR 产物 12 µL，ddH2O 5
图 1  TALEN 左右臂的模块选择
每个模块取 1.5 µL，9 个模块共 13.5 µL。连
接反应体系如下：9 个模块 13.5 μL，左臂或右臂
TALEN骨架载体 1.5 μL，溶液3 2.0 μL，溶液1 1.0
μL，溶液2 1.0 μL，ddH2O 1.0 μL。总体积为20 μL。
混匀后在 PCR 仪中连接，反应程序如下：37℃ 5
min，16℃ 10 min，15 个循环；80℃ 10 min；12℃
1 min。取出PCR管并加入1 μL溶液4和0.5 μL溶
液 5，混匀，37℃孵育 1 h，转化后涂板于含卡那霉
素的 LB 琼脂平板，37℃培养过夜。其中，溶液 1-5
为 TALEN 试济盒中所配。
1.2.3 酶切鉴定 从平板中挑取 15 个单克隆菌落，
在含卡那霉素的 LB 琼脂平板上划线培养，同时接
种于 5 mL 含抗卡那霉素的 LB 培养液中，37℃ 250
r/min培养16 h。用常规质粒小抽试剂盒提取质粒进
行酶切：ddH2O 8 µL，10×K Buffer 2 µL，Plasmid 8
µL，BamH I 1 µL，EcoR I 1 µL；总体积 20 µL。置于
37℃水浴中孵育 1 h。在 1% 琼脂糖中电泳鉴定，根
2014年第5期 213曾凡才等：针对 ALK4 基因的 TALEN 质粒构建与活性鉴定
µL ；总体积 20 µL。37℃水浴中孵育 3 h，3% 琼脂
糖凝胶电泳 30 min，凝胶成像系统拍照和灰度分析。
2  结果
2.1   ALK4基因的靶位点及TALEN识别序列的确定
根据 Bogdanove 和 Voytas 描述的 TALEN 靶位点
选择原则，在 ALK4 基因的 TALEN 靶位点左右臂识
别序列 5 端的前一位（第 0 位）碱基都为胸腺嘧啶
（T），且靶序列的最后一个碱基（3 端碱基）也都是
胸腺嘧啶（T）（对应于最后的 0.5 个 TALE 重复单
元）。左臂识别序列的长度为 15 bp，右臂识别序列
的长度为 18 bp，中间间隔序列的长度为 21 bp，间
隔序列中有 Hha Ⅰ酶切位点，可用于判断 TALEN
质粒的活性（图 2）。90% 人类基因都有剪切异构体，
目前发现至少有 3 种可编码蛋白的 ALK4 剪接异构
体，本试验设计的 TALEN 质粒可作用于 ALK4 基因
的 3 种剪接异构体的第二外显子（图 3）。为了避免
SNP 影 响 TALEN 的 识 别 效 果，PCR 扩 增 HEK293T
细胞基因组中的靶序列并测序，发现靶序列与设计
识别序列完全一致（图 4）。
识别序列，除最后一个碱基胸腺嘧啶（T）设计在
载体骨架上外，还需插入 14 个碱基的识别序列，每
个碱基的识别序列由 102 bp 核苷酸组成，因此需在
骨架载体中插入 1 428 bp 的核酸片段。如果构建正
确，TALEN 左臂表达质粒经上述双酶切和电泳分离
后应观察到 4 254 bp 和 2 231 bp 的两条片段，据此
图 2  ALK4 基因的靶位点和 TALEN 识别序列
图 3  靶位点存在于 ALK4 基因的 3种剪接异构体
图 4  HEK293T 细胞基因组中靶位点序列测序结果
2.2  TALEN质粒构建及酶切鉴定
构建的左右臂 TALEN 质粒均挑取 15 个单克隆
菌落，抽提质粒进行酶切鉴定（图 5）。TALEN 左
臂骨架载体为 5 057 bp，其中 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ两
酶切位点之间的片段为 803 bp。构建敲除 ALK4 基
因的 TALEN 左臂质粒在 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ酶切位
点之间插入识别重复单位，左臂质粒插入 15 bp 的
M：DNA Marker ；C ：未酶切质粒对照；L1-15 ：TALEN 左臂质粒
经 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ双酶切产物 ；R1-15 ：TALEN 右臂质粒经
BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ双酶切产物
图 5  左右臂 TALEN 质粒的酶切鉴定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第5期214
分析判断 L7 最符合此条件（图 5），用于测序。右
臂骨架质粒缺少抗嘌呤霉素基因，只有 3 792 bp 大
小，双酶切位点之间的片段也为 803 bp，右臂应插
入 18 个碱基的识别序列，除最后一位 T 设计在载体
骨架上外，还需插入 1 734 bp 的核酸片段。如果构
建成功，TALEN 质粒经双酶切和电泳分离后应观察
到 2 989 bp 和 2 537 bp 的两条片段。结果发现 R7、
R9、R10、R12、R13、R14 和 R15 编号质粒均可能
构建正确（图 5），将它们测序。
2.3  BLAST比对分析
由于识别 4 种碱基的重复单位仅在 +12 和 +13
位的氨基酸残基不一致，因而不论是拼接的标准序
列还是测序序列都是一些相似度很高的序列重复，
它们的 BLAST 比对结果会有很多，需要从中找到正
确的比对结果。根据左臂插入的标准核苷酸序列长
度为 1 428 bp 和 L7 质粒的测序结果，正向测序比对
正确的结果应选择标准核苷酸序列从第 1 位，测序
序列从第 64 位碱基开始进行比对，且两序列一致性
为 100% 的结果（图 6-A）；反向测序比对正确的结
果应选择标准核苷酸序列是以第 1 428 位碱基比对
结束，且对应的反向测序序列应在第 28 位碱基，两
序列的一致性为 100% 的结果（图 6-B）。L7 质粒正
反向测序比对正确的结果中有 327 个核苷酸所编码
的氨基酸重叠且序列完全一致（图 6），说明 TALEN
左臂质粒 L7 构建成功。其它质粒以相同方法分析，
结果与 L7 质粒类似（图略）。右臂质粒正向测序结
果表明 R13 存在一个位点的突变，其它质粒序列正
确。选择其中 R9 和 R12 进行完整测序，BLAST 比
A：正向测序比对结果；B：反向测序比对结果
图 6  L7 质粒序列 BLAST 比对结果
对确认右臂 R9 和 R12 质粒构建成功。
2.4  TALEN质粒的活性鉴定
通过共转染 24 h 的 pGFP-N1 质粒，荧光显微镜
观察到至少 60% 的转染效率（图 7）。同时利用嘌呤
霉素进行筛选，以最低嘌呤霉素浓度试验确定的 2
µg/mL嘌呤霉素在加药3 d时可致未转染细胞全部死
亡，而转染 TALEN 质粒的 HEK293T 细胞还剩余至
少 50%，一定程度反映了转染效率。用 ALK4 基因
靶序列两端设计的 PCR 引物扩增 HEK293T 细胞基
因组 DNA，电泳结果表明无论是否转染 TALEN 质
2014年第5期 215曾凡才等：针对 ALK4 基因的 TALEN 质粒构建与活性鉴定
粒都可获得与预期 371 bp 一致的特异带（图 8）。此
PCR 产物纯化后经 Hha Ⅰ内切酶酶切，未转染组的
PCR 产物完全被切开，生成与预期 297 bp 和 74 bp
一致的两条带，而转染 TALEN 质粒的一部分 PCR
产物未被切开，灰度分析大约占总条带的 10%，说
明其 Hha Ⅰ内切酶位点已发生突变，部分 HEK293T
细胞的 ALK4 基因被敲除（图 9）。此外，L7+R9 和
L7+R12 两个质粒组合因为识别序列一样，作用于靶
点的活性也基本相同（图 9）。
M：DNA Marker ；1 ：转染 L7 和 R9 TALEN 质粒组的细胞基因组 PCR 产物
经 Hha Ⅰ酶切产物；2：转染 L7 和 R12 TALEN 质粒组的细胞基因组 PCR 产
物经 Hha Ⅰ酶切产物；3：未转染 TALEN 质粒组的细胞基因组 PCR 产物经
Hha Ⅰ酶切产物；4：未酶切的细胞基因组 PCR 产物
  图 9   HEK293T 细胞基因组中涵盖靶序列的 PCR 产物酶
切分析
图 7  pEGFP-N1 质粒的共转染效果
M ：DNA Marker ；NC ：Negative control ；1：转染 L7 和 R9 TALEN 质粒组的
细胞基因组 PCR 产物；2：转染 L7 和 R12 TALEN 质粒组的细胞基因组 PCR
产物；3：未转染 TALEN 质粒组的细胞基因组 PCR 产物
图 8  HEK293T 细胞基因组中涵盖靶序列的 PCR 结果
3  讨论
本研究综合考虑靶点选择原则和 ALK4 剪接异
构体的共同序列，最终将靶点确定在 ALK4 基因的
第二外显子，确保如果 ALK4 基因被敲除后，ALK4
功能不会被其剪接异构体所补偿。靶序列中间有
一 Hha Ⅰ酶切位点以方便判断质粒活性［14］。如果
识别序列中只要有一个碱基出现错配就有可能较大
幅度地降低 TALEN 的活性。因此，通过 PCR 扩增
HEK293T 细胞基因组中的靶序列并测序，比对后发
现该段序列在 HEK293T 细胞基因组中不存在 SNP
现象。通过一步法构建 TALEN 质粒，用酶切鉴定
和测序，最后通过 BLAST 序列比对成功获得敲除
ALK4 基因的 TALEN 质粒，并用酶切鉴定的方法证
明在 HEK293T 细胞中有一定活性。
与其它基因敲除技术相比，TALEN 简便实
用，理论上可作用于基因组中的任何位点［15］。目前
TALEN 的构建方法包括 DNA 序列直接合成、Golden
Gate 克隆、PCR 与 Golden Gate 克隆结合、Toolbox
组装、基于同尾酶的单元组装、FLASH 组装和 LIC
组装等，它们各有特点［14，16-18］。例如，北京大学张
博［19］课题组开发的基于同尾酶的单元组装法已在
斑马鱼的基因敲除中取得很好的效果，该方法费用
较低，但步骤较多。如果构建 TALEN 较多，积累了
较多不同重复单元的模块后，效率也比较高。本研
究采用改进后的质粒文库快速直接构建，可通过一
步连接反应构建识别序列为 12-19 bp 之间任意长度
的 TALEN 质粒。一般挑选 15 个克隆即可筛选到构
建正确的质粒，而且在 TALEN 载体质粒上设计有嘌
呤霉素抗性基因，可用嘌呤霉素提高筛选效率。
TGF-β 超家族信号通路中存在一个配体作用于
多个受体，一个受体也可接受多个配体信号这一复
杂现象。为揭示这种复杂的关系，敲除其中的重要
基因是一个不错的选择。ALK4 作为多种 TGF-β 超
家族成员的受体分子，在这一复杂的关系中处于关
键位置，但早期研究表明敲除 ALK4 基因导致胚胎
死亡［20］，因此限制了对 ALK4 基因功能的研究。最
近发展起来的 TALEN 基因敲除技术方便快捷，希
望能利用该技术建立敲除 ALK4 基因的不同细胞系，
以研究 ALK4 的功能。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第5期216
本研究成功构建了敲除 ALK4 基因的 TALEN 质
粒，并证明在 HEK293T 细胞中有一定的活性。虽
然通过观察共转染的 GFP 表达以及嘌呤霉素的筛
选都证明 TALEN 质粒的转染效率较高，但 TALEN
的切割效率可能并不高，导致发生基因组突变的
HEK293T 细胞并不多。这说明 TALEN 技术虽在多
个物种已取得成功，但不能保证每个位点都有高活
性。这是因为 TALEN 这一新兴技术还没有完全被认
识，但其有效性是肯定的。我们下一步将通过大量
筛选细胞得到敲除 ALK4 基因的细胞系或者在同一
位点设计多条左右臂 TALEN 质粒，组合使用这些质
粒以筛选到更高活性的 TALEN 质粒。
4  结论
本研究成功构建了敲除 ALK4 基因的 TALEN
质粒，并采用脂质体法导入 HEK293T 细胞，且
TALEN 质粒有一定的活性。
参 考 文 献
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