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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第3期
小菜蛾颗粒体病毒（Plutella xylostella granulosis
virus，PlxyGV）属于杆状病毒科、β-杆状病毒属，
是一类特异性感染小菜蛾的病毒。其宿主小菜蛾
（Plutella xylostella）属于鳞翅目菜蛾科，对十字花科
植物具有较大的危害，严重影响甘蓝、花椰菜、白菜、
油菜、芥菜及萝卜等十字花科蔬菜的生产。PlxyGV
对小菜蛾有高度致病性，其制剂已被应用于小菜蛾
的防治，具有杀虫持续时间长、无生物安全隐患、
不易产生抗药性等优点。
收稿日期 ：2012-07-03
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30770088）
作者简介 ：王思民，男，硕士研究生，研究方向 ：分子病毒学 ；E-mail ：wangsimin0724@sina.com
通讯作者 ：黎路林，男，教授，研究方向 ：分子病毒学 ；E-mail ：lilulin@mail.ccnu.edu.cn
小菜蛾颗粒体病毒 PP31 蛋白的原核表达及
多克隆抗体制备
王思民  张鸿杰  黎路林
（华中师范大学生命科学学院 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，武汉 430079）
摘 要 ： 杆状病毒 PP31 是一种磷酸化的 DNA 结合蛋白。pp31 基因存在于所有已完成测序的鳞翅目昆虫杆状病毒。 用 PCR
方法从小菜蛾颗粒体病毒基因组扩增 pp31 基因，将其克隆至原核表达载体 pET28a，转化大肠杆菌 BL21（DE3）菌株。经 IPTG 诱导，
在被转化菌株中表达产生出携带 6×His 标签的 PP31 蛋白。用 ProBondTM 树脂纯化的 His-PP31 融合蛋白大小约 29 kD 左右。用该
融合蛋白免疫新西兰大白兔，获得 PlxyGV PP31 蛋白抗血清。Western blot 分析显示，所获得的抗血清具有较强的特异性和高效价，
可应用于 PlxyGV PP31 蛋白分析。
关键词 ： 小菜蛾颗粒体病毒 PP31 原核表达 多克隆抗体
Expression and Antibody Preparation of Plutella xylostella
Granulovirus PP31
Wang Simin Zhang Hongjie Li Lulin
（Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology，College of Life Sciences，Central China Normal
University，Wuhan 430079）
Abstract:  Baculovirus PP31 is a phosphoprotein that could combine with DNA. The pp31 gene presents in all of the genomes of
lepidopteran baculoviruses sequenced to date. In this study, Plutella xylostella pp31 gene was PCR-amplified and cloned into an expression
vector pET28a, and transformed into the E. coli BL21（DE3）. In the transformed bacterial cells, induced by IPTG, a His-tagged PP31 protein
with a size of 29 kD was expressed, which was purified using ProbondTM resin. Polyclonal antibodies against PlxyGV PP31 were prepared
by immunizing a New Zealand rabbit with the purified his-tagged PP31. Western blot analysis showed that the antiserum had high titer and
specificity and could be used in study of PP31.
Key words:  Plutella xylostella granulovirus （PlxyGV） PP31 Prokaryotic expression Polyclonal antibody
PlxyGV 基因组为单一双链环状 DNA，大小约
为 101 kb，G+C 含量为 41%，预测有 120 个开放阅
读 框（Open reading frame，ORF）。 其 中 有 74 个 基
因与杆状病毒代表种苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒
（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus
AcMNPV）基因具有同源性，pp31 基因是其中的一
个［1］。pp31 基因存在于已完成测序的所有鳞翅目杆
状病毒基因组中。AcMNPV pp31 基因的编码产物是
一种磷酸化的 DNA 结合蛋白，可以非特异性地与
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期130
DNA 结合［2，3］。AcMNPV PP31 蛋白具有至少 4 个磷
酸化位点，其中 3 个已经确定，其磷酸化由宿主激
酶和病毒编码（或诱导）的激酶催化［4］，但目前尚
不清楚哪种宿主激酶作用于 PP31。在受感染细胞中，
AcMNPV PP31 定位于病毒发生基质，占核蛋白总量
的 5%［3］。在瞬时表达试验中，如果不包含 pp31 基因，
晚期报告基因的表达水平会下降 90%-98%［5，6］，因
此将其归类于杆状病毒晚期表达因子。然而，最新
的研究显示，从 AcMNPV 基因组中敲除 pp31 基因后，
缺失 pp31 基因的 AcMNPV 突变体在 Sf9 细胞中仍然
能够进行复制，但病毒滴度降低 ；pp31 基因的缺失
导致 99 个病毒基因转录水平下降［7］。关于 PP31 蛋
白在病毒复制过程中的功能还不清楚。
PlxyGV pp31 的预期编码产物是一个由 252 个
氨 基 酸 残 基 组 成 的 多 肽， 与 AcMNPV PP31 的 序
列相同度仅 13%［1］。本实验室之前的研究发现，
PlxyGV PP31 蛋白可以与宿主细胞的细胞激酶 C 受
体（RACK）以及甲硫氨酰氨肽酶 2（MetAP2）发生
相互作用［8］。本研究对 PlxyGV PP31 蛋白进行原核
表达，制备 PlxyGV PP31 多克隆抗体，以期为进一
步研究 PlxyGV PP31 的分子生物学特征和功能属性
之用。
1 材料与方法
1.1 材料
pET28a 载 体 以 及 E.coli 菌 株 BL21（DE3）、
DH5α 均为本实验室保存。限制性内切酶均购自
Fermentas 公司，T4 连接酶为 TaKaRa 公司产品，蛋
白纯化使用的 ProBondTM Resin 购买自 Invitrogen公司。
多克隆抗体制备所使用的新西兰大白兔由中国科学
院武汉病毒所提供。
1.2 方法
1.2.1 PlxyGV pp31 基因的克隆 根据 PlxyGV 全基
因组序列设计 pp31 基因（36120-36878 nt）引物进
行 PCR 扩增。上游引物 ：5-CTGCCATGGATACTGC-
CGAAAGCGT-3 ；下游引物 ：5-AGCGGTCGACATC-
AGATTTTATTAAATCGC -3。 下 划 线 标 注 的 为 限
制性内切酶酶切位点，上下游引物分别为 NcoⅠ和
SalⅠ。上游引物中，pp31 基因第二个密码子第一
个碱基由“T”改为“G”。为了使 pp31 基因 3 端融
合的 6×His 标签序列可以表达，设计下游引物时去
掉了基因的终止密码“TAA”。使用上述引物，以
PlxyGV DNA 为模板进行 PCR 扩增，所得产物用 1%
的琼脂糖凝胶电泳分离并进行回收纯化。
1.2.2 重组表达质粒的构建 用 Nco Ⅰ和 Sal Ⅰ双
酶切回收的 pp31 基因片段以及 pET28a 载体 ；回收
酶切后产物，用 T4 连接酶在 16℃水浴连接过夜 ；
将连接产物转化至 DH5α 菌株并筛选阳性克隆，获
取重组表达质粒 pET28a-pp31。
1.2.3 融合蛋白诱导表达 将重组表达质粒 pET28a-
pp31 转化至 BL21（DE3）菌株中，挑取单菌落至 3
mL LB 中，37℃、250 r/min 摇菌过夜 ；取 200 μL 过
夜摇菌菌液至 20 mL LB 中，37℃、250 r/min 摇菌
至 OD600 到达到 0.6 ；菌液于冰上放置 15 min 后，加
入 100 mg/mL 的 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L，37℃、
250 r/min 诱导表达 ；分别在诱导 3 h 以及 8 h 时取 1
mL 菌液 ；8 000 r/min 离心 5 min 集菌 ；去上清，用
50 μL ddH2O 悬浮菌体，加相应蛋白上样缓冲液，沸
水中煮 10 min ；12 000 r/min 离心 10 min ；取上清进
行 SDS-PAGE 电泳分析。
1.2.4 融合蛋白的大量表达及纯化 挑取一个含
有 pET28a-pp31 重组表达质粒的 BL21（DE3）单菌
落于 10 mL LB 培养基中，37℃、250 r/min 摇菌过
夜 ；取 3 mL 过夜摇菌菌液至 200 mL LB 培养基中，
37℃、250 r/min 摇菌至 OD600 到达到 0.6 ；取出菌液，
冰上静置 15 min ；加 IPTG（100 mg/mL）至终浓度
为 1 mmol/L，37℃、250 r/min 诱导 3 h ；将菌液富集
至 50 mL 离心管中，使用 Invitrogen 公司 ProBondTM
树脂进行非变性纯化。
用 20 mL 预冷的裂解缓冲液（300 mmol/L NaCl；
50 mmol/L NaH2PO4 ；10 mmol/L 咪唑）重悬菌体，加
入 200 μL 100 mmol/L 的 PMSF 后，高压破碎菌体 ；
10 000×g、4℃离心 10 min ；上清转移至干净的 50
mL 离心管中，加入 200 μL ProBondTM 树脂，水平摇
床上冰浴轻摇孵育 1 h ；将孵育好的溶液过重力柱，
收集少量流出液，记为 FT ；用预冷的漂洗缓冲液Ⅰ
（300 mmol/L NaCl ；50 mmol/L NaH2PO4 ；20 mmol/L
咪唑）洗柱，收集开始和最后的少量流出液，分别记
为 W1 和 W2 ；用预冷的漂洗缓冲液Ⅱ（300 mmol/L
NaCl ；50 mmol/L NaH2PO4 ；40 mmol/L 咪唑）洗柱，
2013年第3期 131王思民等 ：小菜蛾颗粒体病毒 PP31 蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
收集少量流出液，记为 W3；用预冷的漂洗缓冲液 Ⅲ
（300 mmol/L NaCl ；50 mmol/L NaH2PO4 ；60 mmol/L
咪唑）洗柱，收集最后的少量流出液，记为 W4 ；
用 1 mL 预冷的洗脱缓冲液（300 mmol/L NaCl ；50
mmol/L NaH2PO4 ；250 mmol/L 咪唑）洗脱目的蛋白，
记为 E1 ；再取 0.5 mL 预冷的洗脱缓冲液洗脱目的蛋
白，记为 E2 ；各取 15 μL 样品，加入相应蛋白上样
缓冲液后，电泳进行 SDS-PAGE 电泳。
1.2.5 多克隆抗体制备 试验所用的免疫动物为新
西兰大白兔。取 400-600 μg 纯化的 PP31 蛋白，与
等体积的弗氏完全佐剂混匀乳化后，在新西兰大白
兔颈部、背部、四肢等部位皮下多点注射进行第一
次免疫。两周后，以等体积弗氏不完全佐剂与 PP31
蛋白液的混合液注射新西兰大白兔进行第 2 次免疫。
第 2 次免疫两周后以同样的方法进行第 3 次免疫。
第 3 次免疫两周后，颈动脉插管收集血液并分离血
清，分装后 -80℃保存［9，10］。
1.2.6 Western blot 检测抗血清特异性 取纯化的
PP31 蛋白进行 SDS-PAGE 电泳 ；电泳完毕后，凝
胶 中 的 蛋 白 在 湿 转 缓 冲 液（20 mmol/L Tris，190
mmol/L 甘氨酸，20%（V/V）甲醇）中转移至 PVDF
膜上 ；将转好的膜浸入封闭液（含 5%（M/V）脱脂
奶粉的 TBST（10 mmol/L Tris；150 mmol/L NaCl；0.05%
Tween））中，室温轻摇封闭 1 h ；以制备的抗血清为
一抗，用封闭液按 1∶15 000 稀释，室温轻摇孵育 2
h ；弃一抗溶液，TBST 洗膜 4 次，每次室温轻摇孵
育 10 min ；以 HRP 标记的羊抗兔 IgG 为二抗，用封
闭液按 1∶2 500 稀释，室温轻摇孵育 1 h ；弃二抗
溶液，TBST 洗膜 4 次，每次室温轻摇孵育 10 min ；
DAB 显色试剂盒显色。
2 结果
2.1 PlxyGV pp31基因的克隆及重组表达载体的构建
以 PlxyGV 全基因组为模板扩增 PlxyGV pp31 基
因，得到一条约 750 bp 条带（图 1），与预期大小吻合。
得到的产物经过纯化后，经过 Nco Ⅰ和 Sal Ⅰ双酶
切，连接到表达载体 pET28a 上，构建成 pET28a-pp31
重组表达质粒（图 2-A）。pET28a-pp31 中，pp31 基
因序列 3 端与一段亮氨酸 -谷氨酸 -6 组氨酸编码序
列融合。构建的重组质粒分别使用 Xba Ⅰ单酶切以
及 Nco Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切鉴定（图 2-B），Xba Ⅰ单酶
切应切下约 670 bp 条带，Nco Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切应切
下约 750 bp 条带。如图 2-C 所示，酶切鉴定结果与
预期一致。测序结果也显示，PlxyGV pp31 基因成功
插入到了表达载体 pET28a 上。
5000
M 1 2
bp
1000
750
1，2 ：PCR 产物 ；M ：DNA marker DS5000
图 1 PlxyGV pp31 基因 PCR 产物电泳分析
Xba I
Xba I
pp31
Nco I
pET28a
PT7
756 bp
Sal I
pET28a
6 his
5000
M 1 2
bp
1000
750
A
B
2.2 PP31-His融合蛋白的诱导表达及纯化
将 构 建 的 pET28a-pp31 重 组 表 达 质 粒 转 化
至 E.coli BL21（DE3）表达菌株中，用终浓度为 1
mmol/L 的 IPTG 于 37℃诱导 PP31-His 融合蛋白表达，
分别在诱导 3 h、8 h 取菌液检测融合蛋白表达情况。
如图 3 所示，相对于未诱导样品，在诱导 3 h 和 8
h 都得到一条 29 kD 左右的蛋白条带，说明重组的
M. DNA 分子量标准 DS5000 ；1. 用 Xba Ⅰ酶切的 pET28a-pp31 ；2. 用 Nco Ⅰ
和 Sal Ⅰ双酶切的 pET28a-pp31
图 2 重组表达质粒 pET28a-pp31 结构图（A）
及其酶切验证结果（B）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期132
pp31 基因在 1 mmol/L IPTG 诱导 3 h 即获得了高效的
表达。
兰大白兔，第 3 次免疫两周后，颈动脉插管收集血
液并分离血清。将纯化的 PP31-His 融合蛋白转至
PVDF 膜上，以得到的血清为一抗进行 Western blot
分析，抗体用封闭液按 1∶15 000 稀释，结果见图
5，泳道中可以清楚地看到一条较亮且单一的显色条
带。说明制备的抗体具有较高的特异，其效价达到
1∶15 000 以上。
66
kD
M 1 2 3
45
35
25
8.4
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：pET28a-pp31 转化细胞裂解物 ；2 ：用 1 mmol/L
IPTG 诱导 3 h 的 pET28a-pp31 转化细胞裂解物 ；3 ：用 1 mmol/L IPTG 诱导 8
h 的 pET28a-pp31 转化细胞裂解物
图 3 PP31-His 融合蛋白的表达分析
基 于 上 述 结 果， 使 用 终 浓 度 为 1 mmol/L 的
IPTG， 于 37 ℃ 诱 导 E.coli BL21（DE3） 表 达 菌 株
中 PP31-His 融合蛋白表达 3 h。使用 Invitrogen 公司
ProBondTM Resin 对带有 6×His 标签的融合蛋白进行
纯化。如图 5 所示，在破碎细菌后的上清及沉淀中
都存在 PP31-His 融合蛋白，而且在上清中的目的蛋
白量明显大于沉淀中的量。经过 BondTM Resin 亲和
层析纯化得到的主要是约 29 kD 的蛋白条带，与 his-
PP31 的预期大小相符；另外还有少量微弱的蛋白带，
可能是一些没有被洗掉的杂蛋白。
66
66
25
kD
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
45
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：细胞裂解物上清液 ；2 ： 不可溶沉淀 ；
3 ：流出物 ；4-7: 洗出物 ；8 ： 第 1 次洗脱物 ；9 ： 第 2 次洗脱物
图 4 PP31-His 的表达、纯化
116
55
35
25
kD M 1 2 3
70
M: 蛋白质分子量标准 ；1 ：pET28a-pp31 转化细胞裂解物 ；2 ：用 IPTG 诱导
的 pET28a-pp31 转化细胞裂解物 ；3 ：纯化的 PP31-His
图 5 PP31 多克隆抗体的 Western blot 分析
3 讨论
pp31 基因存在于所有已完成测序的鳞翅目杆状
病毒基因组。AcMNPV pp31 编码一种磷酸化 DNA
结合蛋白。该蛋白存在于病毒发生基质，可与 DNA
非特异性结合［2，3］。在 AcMNPV 感染的 Sf 细胞中，
PP31 蛋白高达核蛋白总量的 5%［3］。瞬时表达和基
因敲除试验结果显示 pp31 与 AcMNPV 基因表达调节
有关 ［5-7］。这些研究结果显示 PP31 是一种重要的功
能蛋白。对于颗粒体病毒 PP31 的研究目前鲜见报道。
在前期研究工作中，我们发现 PlxyGV PP31 蛋白与
宿主细胞的细胞激酶 C 受体（RACK）以及甲硫氨
酰氨肽酶 2（MetAP2）发生相互作用［8］。为了进一
步 开 展 对 PlxyGV PP31 的 研 究， 本 研 究 对 PlxyGV
PP31 蛋白进行了原核表达，并制备了多克隆抗体。
该抗体可以用于 PlxyGV PP31 检测和定位。
利用原核表达蛋白免疫动物获得特异性抗体是
一种有效、方便的方法。本研究中，以 PlxyGV 全
基因组为模板，通过 PCR 扩增了 PlxyGV pp31 基因。
将该基因片段连接到 pET28a 载体上。 pET28a 在多
克隆位点上下游各有一段表达 6×His 标签的序列。
在克隆过程中去掉了多克隆位点上游的标签序列，
2.3 Western blot检测抗血清特异性
用纯化的 PP31-His 融合蛋白分 3 次免疫新西
2013年第3期 133王思民等 ：小菜蛾颗粒体病毒 PP31 蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
仅保留了下游的 6×His 标签序列，即在目的基因 3
端融合了一段 6×His 标签序列，方便后期蛋白质
的纯化。pET 系统是一种高效的原核表达系统，在
IPTG 诱导下，T7 RNA 聚合酶被激活，启动目的基
因大量表达 ；而不存在 IPTG 时，目的基因处于沉默
状态，不会进行转录、翻译。在终浓度为 1 mmol/L
的 IPTG 诱导 3 h 后，目的蛋白就有了高效的表达，
并且大部分为可溶性状态。为了获得高纯度、高浓
度的目的蛋白，使用镍柱纯化体系对带有 6×His 标
签的融合蛋白进行纯化。在纯化过程中，开始仅使
用了含有 20 mmol/L 咪唑的漂洗液进行漂洗，发现
最后得到的蛋白液中含有较多的杂蛋白，加大漂洗
液用量仍然没有改善。经过多次试验，使用分别含
有 20、40、60 mmol/L 咪唑的 3 种漂洗缓冲液进行
漂洗，大大减少了最终获得的蛋白液中的杂蛋白。
取纯化得到的目的蛋白液分 3 次免疫新西兰蛋白兔，
每次免疫间隔两周。在免疫注射前，将蛋白液与佐
剂混合，以增强抗原免疫原性。最终获得了多克隆
抗血清。Western blot 试验显示，该血清具有将强的
特异性，效价达到 1∶15 000。
4 结论
将 PlxyGV pp31 基 因 克 隆 至 原 核 表 达 载 体
pET28a 在大肠杆菌 BL21（DE3）菌株中表达产生分
子量为 29 kD 的含组氨酸标签的融合蛋白。用该融
合蛋白制备的 PlxyGV PP31 特异性兔抗血清兼具高
效价和特异性，可以应用于 PlxyGV 的检测和基础研
究工作。
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（责任编辑 李楠）