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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(9):70-78
口蹄疫是一种无国界传播的全球性传染病，可
引起巨大的经济损失和严重的公共卫生问题，故常
被称为“政治经济病”。其一旦暴发，能迅速演变为
生物灾害。大批的动物被扑杀销毁，引发更为严重
的公共卫生问题，容易造成社会的恐慌。对易感动
物进行针对性的疫苗接种是控制口蹄疫传播最有效
的措施［1］。
近年来，随着动物细胞培养技术逐渐应用于兽
收稿日期 ：2015-06-10
基金项目 ：国家自然科学基金项目（21206040，21406066），国家“863”计划项目（2012AA02A303），国家重大专项（2013ZX10004003-
003-003），中央高校基本科研业务费（WF1214035）
作者简介 ：汪梁，女，硕士研究生，研究方向 ：动物细胞的大规模培养 ；E-mail ：aaa098503013@163.com
通讯作者 ：刘旭平，E-mail ：xupingliu@ecust.edu.cn ；谭文松，E-mail ：wstan@ecust.edu.cn
Mixture 与响应面法结合开发 BHK-21 细胞无血清
悬浮培养基
汪梁  刘旭平  谭文松
（华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）
摘 要 ： 采用 Mixture 与响应面实验设计相结合的方法开发 BHK-21 细胞无血清悬浮培养基。在实验室已知配方的 6 种培
养基 A-F 的基础上，通过 Mixture 实验筛选出 BHK-21 细胞无血清培养基的最优组合为 A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。
利用响应面法针对培养基中的几种关键组分进行浓度优化，确定谷氨酰胺、酪氨酸、牛血清白蛋白和钙离子的最优浓度分别为
3 mmol/L、2.5 g/L、0 g/L 和 0 mmol/L。该无血清悬浮培养基能很好地支持 BHK 细胞悬浮生长，培养时细胞最大活细胞密度可达
140.21×105 个 /mL，比商业培养基提高了 1.95 倍。采用 Mixture 试验设计和响应面分析法能够在较短的时间内开发出适合 BHK-21
细胞生长的无血清悬浮培养基，为采用 BHK-21 细胞大规模工业化生产口蹄疫疫苗奠定了基础。
关键词 ： BHK-21 细胞 ；无血清悬浮培养基 ；Mixture 实验设计 ；响应面分析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.009
Optimization of Suspended Serum-free Medium for BHK-21 Cells by
Combining Mixture with Response Surface Analysis
Wang Liang Liu Xuping Tan Wensong
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）
Abstract: This study is to optimize the suspended serum-free medium for BHK-21 cells by combining Mixture experiment design with
response surface analysis（RSA）. Based on 6 media A-F of known formulation in the laboratory, the optimal combination of the medium with A：B：
C ：D ：E ：F = 0 ：0 ：11 ：0 ：9 ：0 was screened by the Mixture test. The contents of several key constituents in the medium were optimized
by RSA, and the optimal concentrations of glutamine, tyrosine, bovine serum albumin（BSA）and calcium ion were 3 mmol/L, 2.5 g/L, 0 g/L and
0 mmol/L respectively. The serum-free medium effectively supported the suspending growth of BHK cells. The maximum viable cell density of
BHK cells in cell suspension culture reached 140.21×105 cells/ml, which was 1.95 times in basal medium. The suspended serum-free medium
for BHK-21 cells was developed by combining Mixture experiment design with RSA, which lays a foundation for the industrial production of foot-
and-mouth disease（FMD）vaccine while using BHK-21 cells.
Key words: BHK-21 cells ；suspended serum-free medium ；Mixture experiment design ；response surface analysis
2015,31(9) 71汪梁等：Mixture 与响应面法结合开发 BHK-21 细胞无血清悬浮培养基
用疫苗的生产，动物细胞悬浮培养成为灭活口蹄疫
（Foot and mouth disease，FMD）疫苗生产的发展方
向［2，3］。凭借对病毒的高敏感性，BHK 细胞自 1962
年建株以来已成为制备 FMD 疫苗所需病毒抗原的理
想细胞系，被广泛应用于 FMD 疫苗生产［4，5］。传统
BHK 细胞大多采用转瓶低血清贴壁的培养方式［6］。
传统的有血清培养基尽管能向细胞提供生长繁殖所
必需的激素、生长因子及其他营养物质，但每个批
次的血清之间存在批间差异，且血清价格昂贵，容
易被病毒和支原体感染［7，8］。此外，血清中大量存
在的成分复杂的蛋白质给疫苗成品后期的分离纯化
带来很大的困难。无血清培养基一般是在传统基础
培养基的基础上添加生长因子、铁转运剂、维生素、
微量元素以及植物蛋白水解物等来替代血清成分［9］。
开发无血清悬浮培养基能够简化纯化和下游加工，
降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染
造成的危害，提高了细胞培养的可重复性和稳定性，
避免了血清批次之间差异的影响。
Mixture 和响应面都是基于合理的实验设计方
法并通过实验得到一定数据进而解决多变量问题的
一种统计学方法，被广泛应用于动物细胞培养技
术［10-13］。本实验在现有 6 种培养基的基础上先采用
Mixture 方法开发适用于 BHK 细胞高密度悬浮培养
的无血清培养基，并针对几种关键成分应用响应面
实验优化其浓度，旨为基于 BHK 细胞无血清悬浮培
养生产口蹄疫疫苗提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 本实验所用的细胞株为叙利亚仓鼠肾
细胞系 BHK-21（Baby Hamster Kidney cell-21）细胞，
由合作企业提供。
1.1.2 培养基 商业培养基 ：由合作企业提供 ；6 种
基础培养基 ：从实验室已知配方的无血清培养基配
方库中挑选出 6 种培养基，配制结束后经 Millipore
公司 0.22 μm 微孔滤膜过滤，并分别命名为 A、B、
C、D、E 和 F。其中 A、B、C 为实验室自主研发的
无血清培养基，专利号分别为 CN201010022834.4、
CN201410513086.8 和 CN200810039305.8。D、E 和
F 为参考国内外与培养基相关的专利文献结合 BHK
细胞的生长状况计算获得的无血清培养基，具体培
养基配方，见表 1。
1.1.3 主要试剂 培养基配制所用的试剂中葡萄糖、
氨基酸和维生素均购自美国生命技术公司 ；各微量
金属盐类物质购自美国 Sigma-Aldrich 公司 ；葡萄糖
和氨含量测定试剂盒购自上海科欣生物技术研究所；
乳酸浓度测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.2 方法
1.2.1 BHK 细胞在实验培养基中的培养 将处于对
数生长期，活性大于 95% 的 BHK-21 细胞移入 50
mL 离心管中，180×g 离心 5 min。弃上清，用实验
培养基重悬后加入摇瓶（125 mL，Corning）中，工
作体积 30 mL，置于 130 r/min 的摇床，在 37℃，5%
CO2 条件下培养。每 24 h 取样，计数后 1 000×g 离
心 5 min。上清置于 -20℃冰箱保存，用于代谢副产
物分析。
1.2.2 基础培养基 Mixture 实验设计 将处于对数生
长期，活性在 95% 以上的 BHK-21 细胞接种于 125
mL 摇瓶，接种方式见 1.2.1，工作体积为 30 mL。摇
床转速为 130 r/min，CO2 浓度 5%，温度 37℃，湿
度 85%。A-F 分别为考察的 6 种培养基，每个实验
组中各培养基对应的数字为这种培养基在工作体积
中所占的体积百分数。实验共设置 35 个实验组，其
中 2 个为对照组。其中除对照组以外的实验组所用
培养基由 6 种培养基混合获得。对照组的编号为
33、34，所用培养基为商业培养基。接种后每 24 h
取样计数，以最大活细胞密度和 IVCC 作为实验的
响应值，考察响应值的大小。实验设计方案，见表 2。
1.2.3 响 应 面 实 验 设 计 与 因 子 最 适 浓 度 的 确
定 Mixture 实验发现前期谷氨酰胺（Gln）在 48 h
基本用尽，同时悬浮细胞存在结团现象。通过查阅
文献，研究发现 Gln 不仅是培养基中重要的碳源，
还是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸［14-16］。同
时钙离子浓度能够显著影响细胞的结团现象，因此
需要考察培养基中 Gln 和钙离子的最优浓度。此外，
牛血清白蛋白（BSA）是血清的重要替代物，酪氨
酸（Tyr）也是培养基中对细胞生长状况有显著影响
的组分［17-20］。为了进一步优化培养基，选取 Tyr、
Gln、BSA 和钙离子，通过在高水平和低水平之间设
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.972
表 1 基础培养基配方表
D 培养基 E 培养基 F 培养基
组分名称 含量 /（mg·L-1） 组分名称 含量 /（mg·L-1） 组分名称 含量 /（mg·L-1）
丙氨酸 300-400 天冬酰胺 300-400 精氨酸 100-300
天冬氨酸 50-85 胱氨酸 30-40 天冬氨酸 600-800
胱氨酸 25-50 半胱氨酸 110-140 谷氨酸 15-35
谷氨酸 100-155 谷氨酸 1500-2000 谷氨酰胺 200-900
谷氨酰胺 300-450 谷氨酰胺 300-450 亮氨酸 200-450
甘氨酸 150-200 组氨酸 30-40 赖氨酸 180-280
组氨酸 155-200 异亮氨酸 35-45 甲硫氨酸 25-50
异亮氨酸 100-150 赖氨酸 20-40 苯丙氨酸 50-70
赖氨酸 150-250 苯丙氨酸 20-25 脯氨酸 40-75
苯丙氨酸 50-75 酪氨酸 80-100 丝氨酸 20-50
脯氨酸 200-300 缬氨酸 24-48 缬氨酸 300-500
丝氨酸 200-250 生物素 0.2-0.4 苏氨酸 100-150
苏氨酸 100-150 维生素 B12 1.5-2 色氨酸 50-70
酪氨酸 100-150 氯化胆碱 8-15 酪氨酸 200-250
缬氨酸 100-135 叶酸 2.8-4 生物素 0.0039-0.024
生物素 0.01-0.03 大豆卵磷脂 12-19 叶酸 5-10
叶酸 5-8 肌醇 15-40 核黄素 0.5-0.8
生育酚醋酸酯 0.02-0.8 烟酰胺 5-10 氯化钠 5000
烟酰胺 10-15 泛酸钙 3-6 硫酸锌 0.5-0.75
吡哆醇 5-10 维生素 0.4-0.8 碳酸氢钠 3000
D-泛酸钙 10-15 核黄素 0.4-0.6 Hepes 4000-4500
肌醇 20-30 维生素 2.3-7.6 氯化钙 75-100
七水硫酸亚铁 0.8-1.6 胸苷 1.5-3 硫酸镁 60-135
棕榈油酸 0.03-0.06 腺嘌呤 0.4-1.2 磷酸氢二钠 75-180
七水硫酸锌 0.3-0.6 腐胺 P 0.25-1.2 磷酸二氢钠 75-200
硫酸镁 50-75 牛磺酸 70-90 丙酮酸钠 100-200
氯化钙 200-250 硫辛酸 0.1-0.25 胆固醇 0.05-0.15
氯化钠 3000-4000 硫酸镁 14-25 氢化可的松 0.01-0.04
磷酸氢二钠 70-100 氯化钠 3000 亚油酸 0.05-0.1
磷酸二氢钠 30-50 磷酸氢二钠 503.2 牛磺酸 40-180
丙酮酸钠 25-35 磷酸二氢钠 112 胸苷 0.4-2.5
胆固醇 1-3 丙酮酸钠 300-380 吐温 80 0.3-0.6
硫辛酸 0.4-1.6 胆固醇 6-9 嵌段式聚醚 F68 1000-2000
腺嘌呤 5-8 EDTA·2Na 7-12 硫酸铜 0.003-0.01
胸腺嘧啶 0.3-0.5 柠檬酸 8-35 硫酸亚铁 0.5-1.5
嵌段式聚醚 F68 700-800 孕酮 0.09-0.18 硝酸铁 0.1~0.5
生育酚醋酸酯 0.01-0.05 硫酸铜 0.015-0.032 EDTA·2Na 5-10
葡萄糖 4000-5000 硫酸亚铁 0.39-0.84 生育酚 3-6
转铁蛋白 25-40 碳酸氢钠 3080 葡萄糖 2000-7000
胰岛素 20-30 葡萄糖 4500-5700 次黄嘌呤 2-20
白蛋白 20-300 白蛋白 100-150 硫辛酸 0.1-0.3
注 ：表中列出的组分仅为 3 种培养基中具有显著差异的组分，未列出全部组分
2015,31(9) 73汪梁等：Mixture 与响应面法结合开发 BHK-21 细胞无血清悬浮培养基
置 5 个浓度梯度，确定 4 种组分的最佳配比及浓度。
利用 Design-Expert 软件对数据进行模型分析，通过
做响应曲面图的方式进行考察。设计表见表 3，其
中各水平值 1-5 分别代表所配制的培养基中各组分
对于相应浓度的倍率。
1.2.4 优化后培养基的验证 用优化后关键组分浓
度配制的无血清悬浮培养基在工作体积为 30 mL 的
摇瓶中培养 BHK-21 细胞，考察并对比细胞在商业
培养基和优化后的无血清培养基中的生长及代谢
情况。
1.2.5 细胞计数 由于细胞存在一定结团的现象，
因此计数前需先用少量胰酶消化 5 min。以台盼蓝染
色消化好的细胞，用血球计数板计活细胞数，并计
算活细胞密度和比生长速率。
1.2.6 葡萄糖、氨和乳酸浓度的测定 采用葡萄糖
氧化酶法测定葡萄糖含量，脲酶 - 波氏比色法测定
氨含量，氧化酶法测定乳酸浓度，均按试剂盒说明
书操作。
1.2.7 数据处理
（1）比生长速率 ：μ=
InXv2Xv1
Δt
（公式 1）
式 中，μ 为 比 生 长 速 率（d-1），Xv 为 活 细 胞 密 度
表 2 基础培养基 Mixture 实验设计
实验编号 A B C D E F
1 0.083 0.083 0.083 0.083 0.583 0.083
2 0 0 0 0 1 0
3 0.583 0.083 0.083 0.083 0.083 0.083
4 0.083 0.583 0.083 0.083 0.083 0.083
5 0 0 0.5 0 0.5 0
6 0 0 0 1 0 0
7 1 0 0 0 0 0
8 0.083 0.083 0.583 0.083 0.083 0.083
9 0 1 0 0 0 0
10 0.083 0.083 0.083 0.083 0.083 0.583
11 0.083 0.083 0.083 0.583 0.083 0.083
12 0 0.5 0 0 0.5 0
13 0 0 1 0 0 0
14 0 0 0 0 0.5 0.5
15 0 0 0 0.5 0.5 0
16 0 0 0 0 0 1
17 1 0 0 0 0 0
18 0.5 0 0 0 0.5 0
19 0 0.5 0 0 0 0.5
20 0 0 0 0.5 0 0.5
21 0 0 0.5 0.5 0 0
22 0.167 0.167 0.167 0.167 0.167 0.167
23 0 0 0 0 0 1
24 0 1 0 0 0 0
25 0 0 0 1 0 0
26 0.5 0 0.5 0 0 0
27 0.5 0.5 0 0 0 0
28 0 0 0.5 0 0 0.5
29 0.5 0 0 0.5 0 0
30 0 0 1 0 0 0
31 0 0.5 0 0.5 0 0
32 0 0.5 0.5 0 0 0
33 0.5 0 0 0 0 0.5
表 3 响应面实验设计
编号 Tyr Gln BSA 钙离子
1 2 2 4 4
2 2 2 2 2
3 4 4 4 2
4 3 3 3 3
5 3 1 3 3
6 4 4 4 4
7 2 4 4 4
8 4 4 2 4
9 3 3 3 3
10 4 2 4 2
11 3 3 1 3
12 2 4 2 2
13 1 3 3 3
14 4 2 2 4
15 3 3 3 1
16 4 2 4 4
17 2 2 4 2
18 3 3 3 3
19 5 3 3 3
20 2 4 2 4
21 3 3 3 3
22 2 2 2 4
23 2 4 4 2
24 4 2 2 2
25 3 3 3 3
26 3 3 5 3
27 3 5 3 3
28 3 3 3 3
29 4 4 2 2
30 3 3 3 5
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.974
（cells/mL），t 为时间（d）。
（2）活细胞密度对时间积分 ：IVCC=∫Xvdt
（公式 2）
式 中，IVCC（Integral of viable cell concentration over
time）为活细胞密度对时间的积分（108 cells·d/L）。
2 结果
2.1 基础培养基Mixture筛选实验
34 种 培 养 基 培 养 的 细 胞 最 大 活 细 胞 密 度 和
IVCC 两组响应值，见表 4。根据响应值的大小分析
6 种培养基的不同配比对响应值的影响，结果表明
培养基 C 对细胞的最大活细胞密度和 IVCC 的影响
显著强于其他几种培养基。利用 Design-Expert 软件
筛选得出 BHK-21 细胞无血清培养基的最优组合为
A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。
分析各组分对 2 个响应值的影响后拟合出的
线性方程为 ：最大活细胞密度 = 23.67A +11.79B+
38.30C+34.33D+23.04E+43.63F+14.61AB+132.47
AC-27.36AD+5.14AE+48.41AF+91.41BC+20.77BD
+42.67BE+24.74BF+79.23CD+166.93CE+46.40CF
+4.09DE+59.57DF+82.07EF ；IVCC=114.33A+52.9
6B+154.99C+130.42D+95.06E+149.33F+66.86AB+
238.42AC-61.05AD-4.23AE+110.29AF+243.46BC+
164.16BD+152.41BE+121.59BF+347.55CD+624.29
CE+77.22CF+32.65DE+100.95DF +170.36EF。
2.2 响应面实验结果
利用响应面分析方法对 Tyr、Gln、BSA 和钙离
子进行定量优化的结果，见表 5，响应面图见图 1
和图 2。以 72 h 内细胞生长获得的最大活细胞密度
和 IVCC 作为考察对象，对培养基中 Gln、Tyr、BSA
和钙离子进行最优化分析得出，其最优浓度分别为
基础培养基中相应浓度的 1 倍、4 倍、1 倍、和 1 倍，
浓 度 分 别 为 3 mmol/L、2.5 g/L、0 g/L 和 0 mmol/L。
拟合得到多元回归模型 ：最大活细胞密度 =17.66Tyr
+54.95Gln+20.60BSA +3.33Ca2+-1.93TyrGln-3.11Tyr-
BSA+2.35TyrCa2+-2.74GlnBSA-2.29GlnCa2+-2.85
BSACa2+-3.78Tyr2-4.63Gln2+1.11BSA2+0.49（Ca2+）2
-62.01 ；IVCC=64.72-15.30Tyr+17.06Gln+5.95BSA-
2.60Ca2+-0.07TyrGln-1.86TyrBSA+2.22TyrCa2+-
0.68GlnBSA-0.44GlnCa2+-1.70BSACa2++0.30Tyr2-
1.66Gln2+1.30BSA2+0.0083（Ca2+）2。
2.3 BHK细胞在优化后培养基中的生长及代谢情况
将优化后的培养基用于培养 BHK 悬浮细胞，并
和商业培养基中细胞的生长和代谢情况进行对比，
结果如图 3 所示。其中图 3-A、图 3-B 两图为商业
培养基中细胞的生长和代谢情况，图 3-C、图 3-D
两图为优化后培养基中细胞的生长和代谢情况。
生长方面，接种后商业培养基中细胞几乎没有
表 4 基础培养基 Mixture 实验结果
试验
编号
最大活细胞密度
（×105 cells·mL-1）
IVCC
（×108cells·d·L-1）
1 45.60 146.77
2 24.40 103.49
3 26.80 117.98
4 26.80 113.71
5 70.25 272.08
6 34.00 144.37
7 23.50 106.91
8 63.50 252.16
9 13.00 53.10
10 77.70 210.16
11 37.00 153.06
12 27.60 111.63
13 39.75 160.37
14 48.00 155.69
15 29.00 119.78
16 41.70 163.72
17 27.50 132.24
18 25.00 105.40
19 29.50 122.27
20 49.25 155.20
21 55.20 219.76
22 63.20 232.79
23 43.00 134.58
24 13.40 61.07
25 37.25 124.08
26 64.25 187.31
27 23.20 101.93
28 46.50 153.66
29 23.75 108.05
30 38.00 149.33
31 29.00 131.42
32 47.20 155.64
33 42.20 152.37
34 71.49 268.58
35 72.35 270.99
2015,31(9) 75汪梁等：Mixture 与响应面法结合开发 BHK-21 细胞无血清悬浮培养基
经过延滞期即进入对数生长期，此时比生长速率最
大，约为 0.75 d-1。随后比生长速率迅速下降，至
108 h 细胞比生长速率下降至 0 d-1，即进入生长稳定
期。稳定期维持时间很短，之后比生长速率持续下
降，即进入细胞衰亡期。
培 养 至 96 h 细 胞 密 度 达 到 最 大 值， 为
71.92×105 cells/mL，之后细胞密度下降。以最优化
的 Tyr、Gln、BSA 和钙离子浓度配制的无血清悬浮
培养基培养 BHK 悬浮细胞同样在 96 h 获得最大活
细胞密度 140.21×105 cells/mL，约为商业培养基的
1.95 倍，较商业培养基提高了 94.95%。此外，优化
后培养基中细胞的稳定期大概能够维持 72 h 左右，
较商业培养基延长了 48 h。因此，优化后的培养基
能够改善后期细胞的维持状况，提高细胞可获得的
最大活细胞密度。
代谢方面，商业培养基中 BHK 细胞生长过程
累积消耗 18.88 mmol/L 葡萄糖，累积产生乳酸 19.47
mmol/L，乳酸对葡萄糖的得率约为 1.03 mmol/mmol，
整个培养过程共产生氨 11.91 mmol/L。而优化后培
养基中细胞生长过程累积消耗葡萄糖 41.16 mmol/L，
累积产生乳酸 25.27 mmol/L，乳酸对葡萄糖的得率
约为 0.61 mmol/mmol，整个培养过程共产生氨 11.09
mmol/L。对比可见，优化后的培养基增加了培养基
中的葡萄糖含量，且乳酸对葡萄糖的得率降为商业
培养基的 59.22%，这说明更多的葡萄糖用于细胞的
生长。
3 讨论
本研究采用了 Mixture 实验和响应面分析相结
合的方法开发适于 BHK 细胞悬浮培养的无血清培养
基。结果显示，该组合方法能快速地利用现有的培
养基开发出适合细胞生长的培养基，并能够针对关
键组分进行浓度优化进而获得理想的培养基配方，
是一种简便高效的培养基开发方法。
通 过 Mixture 实 验 以 最 大 活 细 胞 密 度 和 IVCC
为考察指标初步筛选出能够维持 BHK 细胞生长的
基础培养基，并确定 6 种培养基的混合比例分别
为 A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。 针 对
Tyr、Gln、BSA 和钙离子进行响应面实验设计和分
析确定 4 种物质的最佳添加比例和浓度，并最终确
定一种适合 BHK 细胞悬浮培养的无血清培养基。将
优化后的培养基和商业培养基比较发现，优化后的
无血清培养基培养的 BHK 悬浮细胞最大活细胞密度
较商业培养基提高了 94.95%，且乳酸对葡萄糖的得
率降为商业培养基的 59.22%。表明该培养基优化过
程已成功使 BHK 细胞生长摆脱了对血清的依赖，为
采用 BHK 细胞大规模生产口蹄疫疫苗奠定了数据
基础。
4 结论
本研究通过 Mixture 实验法确定各种培养基的
最优混合方式，并利用响应面法确定关键组分的最
优浓度，最终开发出适于 BHK 细胞悬浮培养的无血
表 5 响应面实验结果
试验
编号
最大活细胞密度
（×105 cells·mL-1）
IVCC
（×108cells·d·L-1）
1 83.70 70.65
2 67.73 70.05
3 53.10 49.68
4 58.05 49.33
5 33.75 38.77
6 53.10 45.92
7 71.55 67.82
8 52.65 43.04
9 72.90 53.08
10 58.50 45.46
11 76.73 63.47
12 86.40 73.03
13 78.30 76.89
14 59.20 46.88
15 72.23 56.52
16 38.95 36.33
17 79.65 78.55
18 71.78 55.15
19 29.95 35.66
20 83.03 71.44
21 70.43 59.28
22 55.58 54.58
23 102.38 85.39
24 36.68 35.62
25 86.63 68.11
26 70.65 57.04
27 67.73 58.08
28 66.60 56.07
29 60.30 48.34
30 70.20 53.67
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.976
清培养基。优化后的培养基能改善细胞的生长状况，
符合大规模生产的需要。
参 考 文 献
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antigenic variants of foot-and-mouth disease virus［J］. J Gen
4
Tyr Gln
5
20
52.5
85
117.5
150
3
2
1 5
4
3
2
1
4
Tyr BSA
5
20
52.5
85
117.5
150
3
2
1 5
4
3
2
1 4
Tyr Ca2+
5
20
52.5
85
117.5
150
3
2
1 5
4
3
2
1
4
Gln BSA
5
20
52.5
85
117.5
150
3
2
1 5
4
3
2
1 4
Gln Ca2+
5
20
52.5
85
117.5
150
3
2
1 5
4
3
2
1
4
BSA Ca2+
5
20
52.5
85
117.5
150
3
2
1 5
4
3
2
1
4Tyr Gln5
20
52.5
85
117.5
150
3
2
1 5
4
3
2
1 4Tyr BSA5
20
52.5
85
117.5
150
3
2
1 5
4
3
2
1
4Tyr Ca2+5
20
52.5
85
117.5
150
3
2
1 5
4
3
2
1
4BSA Ca2+5
20
52.5
85
117.5
150
3
2
1 5
4
3
2
1
4Gln Ca2+5
20
52.5
85
117.5
150
3
2
1 5
4
3
2
1
4Gln BSA5
20
52.5
85
117.5
150
3
2
1 5
4
3
2
1
图 1 四种关键组分对 BHK 细胞最大活细胞密度影响的响应面图
图 2 四种关键组分对 BHK 细胞 IVCC 影响的响应面图
2015,31(9) 77汪梁等：Mixture 与响应面法结合开发 BHK-21 细胞无血清悬浮培养基
80A B
C D
70
60
50
40
30
20⍫㓶㜎ᇶᓖ/×105 cells·mL-1 
10
0
0 24 48 72ษޫᰦ䰤h 96 120 144 -3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.5
0
0.5
1.0
2.0
1.5
80
140
160
60
100
40
120
20
⍫㓶㜎ᇶᓖ/×105 cells·mL-1 ∄⭏䮯䙏ᓖ/d-1 ∄⭏䮯䙏ᓖ/d-1
0
0 24 48 72ษޫᰦ䰤h 96 120 144 -0.200.20.40.60.8
1.0
1.2
1.6
1.4
25.0
20.0
15.0
10.0㪑㨴㌆઼ң䞨⎃ᓖ/mmol·L-1  5.0
0.0
0 24 48 72ษޫᰦ䰤h 96 120 144 02.04.06.08.0
10.0
12.0
14.0
40.0
45.0
50.0
35.0
30.0
25.0
20.0
15.0
10.0㪑㨴㌆઼ң䞨⎃ᓖ/mmol·L-1 ≘⎃ᓖ/mmol·L-1  ≘⎃ᓖ/mmol·L-1 5.0
0
0 24 48 72ษޫᰦ䰤h 96 120 144 0.02.04.06.0
8.0
10.0
12.0
⍫㓶㜎ᇶᓖ∄⭏䮯䙏⦷ ⍫㓶㜎ᇶᓖ∄⭏䮯䙏⦷ң䞨≘㪑㨴㌆ң䞨≘㪑㨴㌆
A，C ：商业培养基中细胞的生长和代谢情况 ；B，D ：优化后培养基中细胞的生长和代谢情况
图 3 BHK 细胞在商业培养基和优化后培养基中的生长和代谢情况
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（责任编辑 狄艳红）