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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）为
十字花科芸薹属叶用蔬菜，原产于我国，营养丰富，
易于储存，因此广受欢迎。大白菜品种繁多，不同
品种的栽培技术、食用价值和经济价值也存在差异，
因此对市售种子品种的鉴别非常关键，尤其是在农
户播种之前利用最短的时间鉴别出种子品种的真实
性，有效地降低劳动成本和经济损失尤为重要。传
统的田间形态学观察是种子品种鉴定较为常用的方
收稿日期 ：2012-07-25
基金项目 ：天津市科技支撑项目（10ZCGYNC00400），天津市应用基础及前沿技术研究计划（10JCYBJC09300）
作者简介 ：赵新，女，硕士研究生，研究实习员，研究方向 ：农产品分子检测技术 ；E-mail ：zhaoxin2008999@126.com
通讯作者 ：王永，男，硕士，副研究员，研究方向 ：农产品安全质量分子检测技术 ；E-mail ：wyzl2007@yahoo.com.cn
复合 EST-SSR 标记在大白菜品种鉴定中的应用
赵新  王永  兰青阔  陈锐  李欧静  余景会  朱珠  郭永泽
（天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津 300381）
摘 要 ： 利用 EST-SSR 分子标记技术，对 12 份大白菜品种鉴定方法进行了研究。通过对 GenBank 数据库中公布的大白菜
EST 序列的分析，合成了 30 对核心 EST-SSR 引物，其中 21 对均可得到有效扩增，10 对具有较高的多态性。为了更加高效的对
大白菜品种进行鉴定，根据这 10 对多态性较高的引物对 12 份市售大白菜品种鉴定的结果及扩增条带的相互位置差异，研制了由
多个引物对组成的 2 套复合 EST-SSR 标记，建立了多重 SSR 的反应体系及反应条件。筛选得到的 2 套标记组合，多态率分别为
88.9% 和 97.0%，多态信息量均为 0.910%，数据表明这 2 套复合标记技术可以表达大白菜品种间的多态性，高效准确的对 12 份大
白菜品种进行鉴定。
关键词 ： 大白菜 种子 品种鉴定 复合 EST-SSR 标记
Cultivars Identification of Chinese Cabbage Using Multiplex
EST-SSR Markers
Zhao Xin Wang Yong Lan Qingkuo Chen Rui Li Oujing Yu Jinghui Zhu Zhu Guo Yongze
（Institute of Tianjin Agriculture Quality Standard and Testing Technology，Tianjin 300381）
Abstract:  In this research, 12 Chinese cabbage cultivars identification method was studied by EST-SSR molecular markers technique.
The results showed that there were 21 pairs of EST-SSR primers showing the amplification and 21 pairs of EST-SSR primers showing the high
polymorphism among 30 pairs of screened SSR primers, which were designed from expressed sequence tags（ESTs）in GenBank. In order
to identify Chinese cabbage high performance, using the identification results and the mutual position difference bands of 10 pairs of highly
polymorphic primers on 12 Chinese cabbage varieties cultivars, make up 2 sets of multiplex EST-SSR markers. The polymorphic rate were 88.9%
and 97.0%, polymorphism information content was 0.910%, and results indicate that the 2 sets of multiplex EST-SSR markers could be used to
indentification 12 Chinese cabbage cultivars high performance.
Key words:  Chinese cabbage Seed Cultivars identification Multiplex EST-SSR Markers
法，但时间较长且易受环境条件的影响，结果可能
存在偏差，因此需要一种更加高效、准确并且操作
简便的分子水平品种鉴定方法［1］。同时新品种的登
记、测试，以及品种间的遗传距离聚类分析也需要
相关的分子辅助手段［2］。
近年来出现了多种分子生物学标记技术，简单
重复序列 SSR 标记（也称微卫星技术）是其中的一
种，与其他分子标记技术相比具有多态信息含量高、
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共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特
点［3，4］，并且在杂交种品种鉴定中得到了大量应用。
随着功能基因组学的迅速发展，GenBank 中积累了
许多重要物种的大量 EST 序列，这些序列获取简便，
没有任何费用，已经成为发展 SSR 标记的重要来源，
因 此 基 于 表 达 序 列 标 签（expressed sequence tags，
EST）的微卫星（simple sequence repeats，SSR）标
记技术不仅保留了 SSR 标记技术的所有优点，而且
凸显了其便捷、花费低、效率高的优势 ；但 SSR 技
术也存在着相对的不足，即一次试验得到的位点较
少，针对这一问题 Tommasini 等［5］发展了多重 SSR
分析技术，并有效地鉴定了油菜品种。
本研究以 12 份大白菜杂交种为试验材料，利用
新型分子标记复合 EST-SSR 进行大白菜品种鉴定研
究，筛选其多态性特异谱带，并以该谱带作为分子
标记对其品种进行区分。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为 12 份市售大白菜杂交种，由天津科
润蔬菜研究所提供，具体信息见表 1。
的相互位置差异，优化组合多个引物对，筛选复合
EST-SSR 标记。
1.2.4 PCR 扩增体系及程序 PCR 扩增反应的总体
积 为 10 μL， 扩 增 反 应 体 系 为 ：2×GoTaq® Master
Mixes 5 μL，上下游引物 10 μmol/L 各 0.25 μL（Ⅰ套
EST-SSR 复合引物中 BC1 上游引物、BC1 下游引物、
BC19 上游引物、BC19 下游引物、BC26 上游引物、
BC26 下游引物均等量混合各 0.25 μL ；或Ⅱ套 EST-
SSR 复合引物中 BC1 上游引物、BC1 下游引物、BC9
上游引物、BC9 下游引物、BC10 上游引物、BC10
下游引物、BC16 上游引物、BC16 下游引物、BC27
上游引物、BC27 下游引物均等量混合各 0.25 μL），
供试品种大白菜基因组 DNA 模板，浓度 50 ng/μL，
1 μL，双蒸水补足 10 μL。PCR 反应程序 ：94℃预变
性 5 min ；94℃ 1 min，53.5℃ 45 s，72℃ 45 s 35 个
扩增循环 ；72℃延伸 7 min，4℃保存。
1.2.5 数据分析及聚类图谱构建 根据聚丙烯酰胺
凝胶电泳图谱，每个样品的特异性谱带按照相互位
置差异在相同迁移率位置上进行有无的“1，0”标注，
根据标注结果计算 2 套引物的多态率和多态信息量
（PIC），分析 2 套引物对 12 份大白菜品种的鉴定结
果，并应用 NTSYS 聚类分析软件构建 12 份大白菜
品种的聚类图谱。
2 结果
2.1 大白菜叶片基因组DNA的提取
利用改良 CTAB 方法提取大白菜叶片基因组
DNA，用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测。结果（图 1）
显示，所提取的基因组 DNA 主带清晰，整齐一致，
无明显降解，可用于下一步 PCR 扩增。
表 1 品种名称及编号
杂交种编号 品种名称 杂交种编号 品种名称
1 秋绿 75 7 秋绿 55
2 津秋 78 8 津夏 3 号
3 秋绿 60 9 津秀 2 号
4 耐抽薹型春绿 1 号 10 津秀 3 号
5 津白 56 11 津秋 606
6 津白 45 12 珍绿 6 号
1.2 方法
1.2.1 EST-SSR 引物的开发 利用 GenBank 上公布
的大白菜 EST 序列，设计合成 30 对核心引物，命
名为 BC1-BC30，引物由上海生工合成。
1.2.2 大白菜基因组 DNA 提取 利用改良 CTAB
法［6］分别提取 12 份大白菜杂交种叶片基因组 DNA，
将获得的植物组 DNA 用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 引物筛选 以大白菜杂交种的基因组 DNA 为
模板，分别对 30 对 EST-SSR 引物进行扩增，扩增
产物用 8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离、染色，
在能够得到有效扩增的引物中筛选多态性高的特异
谱带，同时结合单一引物品种鉴定结果及特异谱带
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1-12 ：12 份大白菜杂交种
图 1 大白菜基因组 DNA 电泳图
2.2 引物筛选结果
利用 SSR 技术对天津科润蔬菜研究所提供的大
2013年第1期 109赵新等 ：复合 EST-SSR 标记在大白菜品种鉴定中的应用
白菜杂交种进行了特异性分子标记分析，共利用 30
对 EST-SSR 引物进行了 PCR 扩增，其中 21 对得到
有效扩增，10 对具有较高的多态率及多态信息量，
根据这 10 对引物扩增条带的相互位置差异，进行优
化组合，确定了 2 套复合引物可对 12 份大白菜品种
进行完全的区分。引物序列见表 2，应用 2 套复合
引物对 12 份大白菜进行品种鉴定的聚丙烯酰胺凝胶
电泳图谱如图 2、图 3 所示。
表 2 引物序列
引物组合 序号 正向引物（5-3） 反向引物（5-3）
Ⅰ BC 1 TTTGTCCCTATTGCTCAGGG CCGAGAACGTCTTCTCCTTG
BC 19 TTGAAACTTGGTTGACGACG TTCTTCTTTGCGGCTGATTT
BC 26 ATAACAACAACCTGCCCGAG GAAGCACAAGAACAGGGCTC
Ⅱ BC 1 TTTGTCCCTATTGCTCAGGG CCGAGAACGTCTTCTCCTTG
BC 9 ACCTTCCGTCTCTGGGTCTT TTTTGAACGAGGTGGAGGAC
BC 10 GAATCCTTTGGAAACGACGA GGGGACACAATTCTCCTGAA
BC 16 CTTGCAAATGACCTGCTTGA GGGAGTTGGAGATGAGGTGA
BC 27 ATCCAAAAGGAAGAATCCCG AAACGAGAATTTTCCTGCGA
M ：Marker ；1-12 ：12 份大白菜杂交种
图 2 Ⅰ套复合 EST-SSR 引物用于 12 份大白菜品种扩增产
物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图谱
M ：Marker ；1-12 ：12 份大白菜杂交种
图 3 Ⅱ套复合 EST-SSR 引物用于 12 份大白菜品种
扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图谱
2.3 复合标记12份大白菜品种的多态性分析及聚
类分析结果
通过分析 EST-SSR 结果，比较 12 份大白菜品种
间多态性位点的差异，确定 2 套复合引物的多态率
及多态信息量；在相同迁移率位置上进行“1，0”标注，
构建 12 份大白菜品种的 SSR 分析谱带数据（表 3），
通过数据分析复合引物是否可对 12 份大白菜品种进
行完全的区分，同时构建 12 份大白菜品种的聚类
图谱（图 4）。
表 3 复合 EST-SSR 引物组合鉴定大白菜品种的多态性分析
引物组合 总条带数 多态性条带数 多态率（%） 多态信息量（%）
Ⅰ 18 16 88.9 0.910
Ⅱ 33 32 97.0 0.91
Coefficient
0.53 0.64 0.75 0.85
བྷⲭ㨌1ਧབྷⲭ㨌3ਧབྷⲭ㨌2ਧབྷⲭ㨌5ਧབྷⲭ㨌6ਧབྷⲭ㨌4ਧབྷⲭ㨌7ਧབྷⲭ㨌9ਧབྷⲭ㨌8ਧབྷⲭ㨌11ਧབྷⲭ㨌12ਧབྷⲭ㨌10ਧ
0.96
图 4 复合 EST-SSR 引物用于 12 份大白菜品种的聚类图谱
保护（Protection of New Varieties of Plant，简称 PVP）
作为知识产权的 10 种内容之一，其重要性越来越突
出。培育和推广新的优良品种是我国蔬菜育种发展
的重要方向，因此新品种的准确鉴定不仅是新品种
审定和保护的前提，也为辨别假冒伪劣种子，保护
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
3 讨论
随着植物育种和种子产业的发展，植物新品种
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期110
自身知识产权，维护育种农家的切身利益提供保障
和科学依据。因此，开发高效、准确的种子品种鉴
定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。
近年来随着分子生物学的发展，遗传标记经过
形态学标记、细胞学标记、蛋白质标记已经发展到
了 DNA 水平的标记。各种 DNA 标记技术在杂交种
品种鉴定中层出不穷，EST-SSR 是近几年建立的新
型分子标记技术，目前已应用于水稻、小麦、高羊
茅、黑杨等［7-10］植物的分子连锁图谱构建和遗传多
样性分析，证明了 EST-SSR 标记进行品种鉴定的可
行性，该技术具有稳定性高、共显性、重复性好等
特点，而且开发成本相对低廉。
为了进一步提高 EST-SSR 的多态性，更加高效
地进行相关物种的品种鉴定，本研究以大白菜为试
验材料，摸索了多重 EST-SSR 的反应体系和反应条
件，构建了 2 套复合 EST-SSR 引物组合可完全对 12
份大白菜品种进行区分。复合引物标记的构建需要
根据单一引物的相互位置差异进行优化组合，使单
一引物的扩增片段处在不同片段大小的区域，避免
复合标记的重叠性。复合 EST-SSR 标记对大白菜杂
交品种具有很好的区分效果，可通过一次反应检测
到高水平的多态性，同时所建立的试验组合、方法
和思路，具有一定的推广性，不仅仅局限于 12 份大
白菜品种的鉴定，通过对 30 对核心引物的组合优
化，可以对更多的大白菜品种进行标记和鉴定的研
究，进而为有效地解决大白菜杂交种的鉴别问题提
供技术参考。本研究的检测方法在不计算 DNA 提
取过程耗时的情况下，PCR 耗时 2 h，EST-SSR 分析
60-90 min，所以本发明的检测方法在 4 h 之内即可
完成对大白菜品种的鉴定工作，具有高效、低成本、
操作方便等优势。
4 结论
本研究仅以 12 份市售大白菜品种为例，通过
EST-SSR 标记的特异谱带进行聚类分析，表明 12 份
大白菜品种两两间的相似系数在 0.53-0.96 之间，平
均值为 0.75，以遗传相似系数 0.96 为标准，复合
EST-SSR 引物组合扩增的特异性谱带数据，能将市
售大白菜的 12 份品种完全区分开。这些研究方法和
结果对建立大白菜新种质、新品种保护以及种苗质
量仲裁检验等都具有重要意义。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）