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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-06-20
基金项目 : 新疆农垦科学院青年基金项目（YQJ201110）, 新疆农垦科学院引导计划项目（YYD201107）
作者简介 : 赵文娟 , 女 , 助理研究员 , 研究生 , 硕士 , 研究方向 : 分子寄生虫学 ; E-mail: zwj-130@163.com
通讯作者 : 康立超 , 男 , 助理研究员 , 研究生 , 硕士 , 研究方向 : 动物传染病的诊断与防治 ; E-mail:klc003@163.com
牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白 OmpH 的
扩增与生物信息学分析
赵文娟1 田亮2 薄新文1 马勋2 康立超1
（1新疆农垦科学院 新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室，石河子 832000 ；2石河子大学动物科技学院，石河子 832003）
摘 要： 旨在扩增牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白 OmpH 的编码基因，并预测 OmpH 蛋白二级结构和 B 细胞抗原表位，从而
探讨牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白 OmpH 在免疫保护中所起的作用。对牦牛多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白 OmpH 基因进行 PCR 扩增
及序列测定。应用生物信息学相关软件和方法，对牦牛多杀性巴氏杆菌 OmpH 蛋白的二级结构和 B 细胞抗原表位进行预测。牦牛
多杀性巴氏杆菌 OmpH 基因全长 1 478 bp,ORF 包含 1 002 bp 编码 333 个氨基酸。二级结构以无规卷曲为主，有少量的 α- 螺旋和延
伸带 ；推测 OmpH 蛋白有 1 个细胞黏附位点、2 个糖基化位点。
关键词： 牦牛多杀性巴氏杆菌 外膜蛋白 H 二级结构 B 细胞抗原表位 功能预测
Amplification and Sequence Analysis of Pasteurella multocida Outer
Membrane Protein OmpH from Yak
Zhao Wenjuan1 Tian Liang2 Bo Xinwen1 Ma Xun2 Kang Lichao1
（1The Breed and Biotechnology Key Laboratory of Sheep in Xinjiang Bingtuan，Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science,
Shihezi 832000; 2College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832003）
Abstract: The aims of this study was to amplify and sequence the OmpH gene of pasteurella multocida, and predict its secondary
structure and B-cell epitopes, which provides a theoretical basis for the study of immune mechanism and Pasteurella multocida subunit vaccine.
The pasteurella multocida OmpH gene was amplified and sequenced. Using bioinformatices softwares and methods, the secondary structure and
B-cell preponderant epitope of pasteurella multocida OmpH were predicted. The results indicated that pasteurella multocida OmpH gene was
1 478 bp, ORF including 1 002 bp, encoding 333 amino acids. Using two methods, prediction of the secondary structure of pasteurella multocida
OmpH indicated that random coils were the main structural type of the flexible region in secondary structure, and contain a small amount of α-helix
and extended strand. The OmpH protein was supposed contain 1 cell attachment sequence and 2 potential glycosylated sites. These results
provide a theoretical basis for the further study of immune mechanisms, monoclonal antibodies preparation and epitope vaccine design.
Key words: Pasteurella multocida OmpH Secondary structure B-cell epitope Function prediction
牦牛巴氏杆菌病又叫牛出血性败血症，是一种
急性、全身性传染病，特征是突然发病，体温升高，
并引起肺炎，有时出现急性胃肠炎和内脏广泛出血，
是危害牦牛养殖业发展的重要疾病之一。本病一年
四季均可发生，主要发生于秋冬二季，死亡率高，
发病后及时抢救，症状较轻的可以治愈。但本病的
流行较快，传播途径多，对牦牛养殖业造成的损害
较大。因此，做好本病的预防和诊治工作是防止此
病流行的关键。
外膜蛋白（outer membrane proteins，Omps）是
革兰氏阴性菌细胞壁的特有成分，镶嵌于细胞膜的
中间，在维持外膜结构、物质转运，以及细菌对宿
主的感染和致病过程等方面起着重要的作用［1］，同
时，作为细胞膜中的一种重要成分具有良好的免
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期140
疫原性，在免疫方面的作用越来越受关注。不同
血清型分离株间的 Omps 具有共同抗原成分，可以
产生交叉保护作用。OmpH 是多杀性巴氏杆菌的主
要外膜蛋白，可以诱导产生高水平的保护性抗体。
Chevalier 等［2］认为 OmpH 位于菌体表面，是一种孔
道形成蛋白，属于非特异性细菌外膜脂蛋白超家族。
Luo 等［3］研究表明，纯化的天然 OmpH 诱导的保护
率与全菌的保护率相当，OmpH 和全菌都能诱导高
水平的 ELISA 抗体。
通过生物信息学的方法预测抗原表位或于抗原
表位相关的信息已经多有报道［4, 5］。本研究对分离
的牦牛多杀性巴氏杆菌 OmpH 基因进行克隆测序，
以氨基酸序列为基础，利用生物信息学的方法，预
测其二级结构和 B 细胞抗原表位，以期为研究其免
疫机理和新型高效疫苗提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 新疆发病牦牛多杀性巴氏杆菌分离株
和 E.coli DH5α，由新疆兵团绵羊繁育生物技术重点
实验室临床分离鉴定并保存。标准牛多杀性巴氏杆
菌 1 株（cvcc393）购自中国兽医药品监察所。
1.1.2 工具酶与主要试剂 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回
收试剂盒购自上海生工，PCR 反应与检测试剂（Taq
DNA 聚合酶 、dNTPs 、10×PCR buffer、DL2000 DNA
Marker）购自天根生化科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 引物合成 用 DNAStar 软件对 GenBank 已发
表的牛多杀性巴氏杆菌的 OmpH 基因序列（PMU50
907）进行比对，用 Premier5.0 设计特异性异物扩增整
个 OmpH 基因。上游引物：5- TTTGGGTGAAGTGAG-
AAATAGAGGC-3 ；下游引物 ：5- GACCGCGTAACG-
ACTTTCAAAATCC-3, 引物由上海生物工程有限公司
合成，预期扩增的 DNA 片段约为 1 500 bp。
1.2.2 牦牛多杀性巴氏杆菌 OmpH 基因的扩增和测
序 用碱裂解法提取细菌基因组 DNA 为模板进行
PCR 扩增反应。PCR 反应程序 ：95℃预变性 5 min ；
95℃变性 40 s、61℃退火 40 s、72℃延伸 90 s，35
个循环 ；72℃延伸 10 min。胶回收目的 DNA 由上海
生物工程有限公司测序。
1.2.3 牦牛多杀性巴氏杆菌 OmpH 蛋白结构预测与
序列分析 将测序正确的核苷酸序列利用 DNAStar
确定其完整编码序列并显示其编码的氨基酸序列。
应用蛋白分析专家系统服务器 ExPASy Proteomics
Server （ http://ca.expasy.org/ ） 所 提 供 的 蛋 白 质 在
线 分 析 工 具， 如 ProtParam tool （ http://www.expasy.
ch/tools/protparam.html ） 预测氨基酸序列的相对分子
质量、等电点、稳定性指数等理化性质 ； MotifScan
（http:// myhits.isb-sbi.ch/cgi-bin/motif_scan） 预测氨基
酸序列中的基序（motif） 和功能域 ； SOPMA（http://
npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_
sopma.html）、GOR（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-
bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html） 预 测 氨 基
酸序列的二级结构 ；Tmpred（http://www.ch.embnet.
org/software/TMPRED_form.html）预测氨基酸跨膜区。
1.2.4 牦牛多杀性巴氏杆菌 OmpH 蛋白 B 细胞表位
预测 采用 Hopp-Woods 亲水性参数［6］、Emini 表面
可及性参数［7］、Jameson-Wolf 抗原性参数［8］、Zimme
rman 极性参数［9］和柔韧性参数（http://www.expasy.
org/cgi-bin/protscale.pl）分别进行单参数预测。对各
个参数的预测结果进行比较，最后进行综合分析以
确定牦牛多杀性巴氏杆菌 OmpH 蛋白的 B 细胞表位。
2 结果
2.1 牦牛多杀性巴氏杆菌OmpH基因的扩增与测序
牦牛多杀性巴氏杆菌 OmpH 基因 PCR 扩增产物
在 1％琼脂糖凝胶电泳中显示约为 1 500 bp，与预期
的片段大小相符，分离株和阳性对照条带大小相近
（图 1）。测序结果显示，OmpH 片段为 1 478 bp，包
含完整的 ORF（1 002 bp）, 编码 333 氨基酸。OmpH
基因的氨基酸序列如图 2 所示。
M. Marker DL2000 ；+. 标准阳性对照 cvcc393 ；1-5. 临床分
离牦牛多杀性巴氏杆菌
图 1 牦牛多杀性巴氏杆菌 OmpH 扩增的电泳结果
2012年第1期 141赵文娟等 ：牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白 OmpH 的扩增与生物信息学分析
2.2 牦牛多杀性巴氏杆菌OmpH氨基酸序列的理
化性质分析
利 用 ProtParam 软 件 对 牦 牛 多 杀 性 多 杀 性 巴
氏杆菌 OmpH 蛋白进行分析，结果显示原子总数
为 5 038， 分 子 结 构 式 为 C1593H2518N440O484S3， 理 论
分子量为 35.6743 kD ，理论 pI 值为 9.26，不稳定
系数 14.39，大于阈值 40 则性质不稳定所以此类
蛋白比较稳定。脂肪系数为 83.15，总平均亲水性
为 -0.229，蛋白总体疏水性较高。此蛋白不含有半
胱氨酸（Cys），280 nm 处的摩尔消光系数为 33 350
（mol ·cm）-1，酸性氨基酸残基 （Asp + Glu） 总数为
36，碱性氨基酸（Arg + Lys）总数为 44。在 N 末端
是甲硫氨酸（Met），在酵母和大肠埃希菌中表达的
半衰期分别大于 20 h 和 10 h ，在哺乳动物网状细胞
体外培养中表达的半衰期为 30 h 。
2.3 牦牛多杀性巴氏杆菌OmpH结构的特征性序列
和二级结构预测
通过 Motif Scan 在线预测 OmpH 基因有 1 个氨
基化位点，位于 248-251 位（EGKK）；2 个 N-糖基
化位点，分别位于碱基的 34-37 位（NGSV），54-57
位（NGSR）；8 个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，分别
位于碱基的 29-32 位（TKVD），87-90 位（TVKE），
93-96 位（SQVE），126-129 位（TIGD），148-151
（SSGE）位，245-248（TNVE）位 ,283-286 位（TTRD）,
303-306 位（TFVE）；7 个 N- 十四（烷） 酰化位点 :55-60
（GSRVSF）位，122-127（GNQLTI）位，141-146（GGI-
NNL）位，225-230（GTELSY）位，232-237（GLALGV）
位，277-282（GSPKGA） 位，322-327（GNVVGV）
位 ；8 个蛋白激酶 C 磷酸化位点 :36-38（SVR）位，
59-61（SFK）位，81-83（STK）位，87-89（TVK）位，
209-211（SQK） 位，278-280（SPK） 位，283-285
（TTR）位，319-321（TTK）位 ；1 个细胞黏附位点，
位于 48-50 位（RGD） （图 3） 。
Tmpred 预测跨膜结构，该蛋白有 1 个跨膜区
域（图 4），位于碱基的 4-24 位，膜外部分为预测
表位的候选区段 ； SOPMA 和 GOR 预测 OmpH 的二
级结构。结果（图 5）显示两种方法对多杀性多杀
性巴氏杆菌的二级结构预测无显著性差异，均显示
图 2 OmpH 基因的氨基酸序列
图 3 OmpH 基因推测的编码蛋白推测位点
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期142
OmpH 二级结构中以无规卷曲为主占到 40％以上，
存在 α-螺旋和 β-片层 , 无规卷曲主要位于氨基酸的
89-94 位，98-101 位，141-145 位 ,175-185 位 ,194-200
位 ,240-244 位 ,275-285 位区段。
2.4 牦牛多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白的B细胞表位
预测
分别对 OmpH 蛋白的亲水性、可及性和柔韧性
参数进行预测，结果（图 6）显示亲水性最低区域
为第 162-173 位，亲水性最高区域为第 40-48 位 ；
可及性最低区域为为第 8-17 位，可及性最高区域
为第 41-49 ；柔韧性最低区域为第 8-14 位，柔韧
图 4 OmpH 基因的跨膜结构预测
H. α- 螺旋 ；e. 延伸带 ；c. 无规则卷曲 ；t. β- 转角
图 5 SOPMA、GOR4 为不同的预测方法
a. 亲水性参数 ；b. 可及性参数 ；c. 柔韧性参数 ；d. 抗原性 ；e. 表面可能性
图 6 各种不同参数对 OmpH 的预测结果
2012年第1期 143赵文娟等 ：牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白 OmpH 的扩增与生物信息学分析
性最高区域为第 177-187 位。应用不同的方法预
测 B 细胞抗原表位的数目及抗原表位可能出现的肽
段有所不同，但均显示在 OmpH 蛋白第 26-30 区
段（QDGTK）、44-49 区 段（ EKNERG ）、87-94
区 段（TVKEGPSQ）、179-185 区 段（QAPRDGR）、
282-288 区 段（ATTRDRS） 和 310-315 区 段
（GREKDA）有较好的亲水性、可及性和较高的抗
原性指数，并在二级结构上含有易形成抗原表位的
转角和无规则卷曲，因此 B 细胞表位可能出现在这
些区域内或者附近（表 1）。
表 1 应用不同方法预测 OmpH 蛋白 B 细胞表位的肽段位置
预测方法 预测结果
二级结构 89-94、98-101、141-145、175-185、194-200、240-244、275-285
亲水性 26-35、39-61、63-69、79-105、130-133、148-156、174-186、194-199、213-223、244-255、261-269、277-290、308-319
可及性 26-36、39-68、79-94、97-107、175-186、195-199、215-223、246-255、261-269、282-289、295-303、308-317
柔韧性 26-32、44-57、87-98、126-133、145-148、179-185、245-249、279-291、308-315
表面可能 24-30、42-49、83-96、175-185、193-198、208-213、217-221、240-244、248-254、261-269、277-288、298-302、310-315
抗原性 25-36、41-61、63-69、80-105、127-136、149-155、158-163、175-187、193-203、208-212、217-224、240-257、261-270、
276-290、296-306、307-323
3 讨论
在同种菌的不同菌株中，孔蛋白的一级氨基酸
序列、二级结构及与抗原性有关的区域相对保守，
因此，OmpH 有望成为一种对所有血清型的 Pm 产生
保护的候选抗原。Vasfimarandi 等 ［10］用 OmpH 特异
的单克隆抗体注射 BLAB/C 鼠后，经皮下和鼻内途
径感染同源多杀性多杀性巴氏杆菌，结果在感染后
48 h，感染鼠肺脏中多杀性巴氏杆菌的数量显著下
降，说明 OmpH 特异的单克隆抗体能抑制多杀性巴
氏杆菌在肺中的增殖。我们此项研究的目的也是为
下一步疫苗的研制和免疫提供理论基础。
本研究联合使用 Hopp-Woods 的亲水性方案、
Emini 的蛋白质表面可能性方案、Jameson-Wolf 和吴
玉章的抗原性指数预测法 , 辅以 SOPMA 和 GOR 方
法对 OmpH 蛋白二级结构的分析 , 预测 OmpH 的 B
细胞表位。推测最有可能的 B 细胞表位位于 OmpH
蛋白 N 端第 26-30 区段、44-49 区段、87-94 区段、
179-185 区段、282-288 区段和 310-315 区段或它们
的附近。上述 6 个区域仅仅是 OmpH 蛋白中 B 细胞
表位优势区段 , 而并不包括所有的抗原表位。本研
究仅是对 OmpH 蛋白的候选表位进行初步筛选 , 但
最终应用效果必须用试验结果来确认。Barlow 等［11］
认为 , 蛋白质序列中的 α-螺旋、β-折叠的主要功能
是作为蛋白质骨架起稳定作用 , 无规卷曲区域则决
定蛋白质的功能 , 而且与抗原表位有关。蛋白质中
的 β- 转角及无规则卷曲多出现在球蛋白表面 , 因为
是突出结构 , 利于与抗体嵌合 , 成为抗原表位的可能
性较大。
本研究基于牦牛多杀性巴氏杆菌 ompH 蛋白的
氨基酸序列，通过对其二级结构、跨膜区、亲水性、
表面可及性与抗原性等多种参数进行综合比较分析，
预测了 ompH 可能的 B 细胞优势表位，为寻找特异
性相关表位用于疫苗的设计、单抗及诊断试剂研制、
免疫机理的研究提供了理论依据，同时也为牦牛多
杀性巴氏杆菌 ompH 蛋白功能研究提供了线索。
4 结论
本研究基于对牦牛多杀性巴氏杆菌 OmpH 蛋
白的氨基酸序列进行分析，得到该片段编码 333
个 氨 基 酸， 原 子 总 数 为 5 038， 分 子 结 构 式 为
C1593H2518N440O484S3，理论分子量为 35.6743 kD ，理
论 pI 值为 9.26，蛋白比较稳定，总体疏水性较高。
通过在线预测得到 OmpH 基因有 1 个氨基化位点 ；2
个 N- 糖基化位点 ；8 个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点 ；
7 个 N- 十四（烷） 酰化位点 ；8 个蛋白激酶 C 磷酸
化位点 ；1 个细胞黏附位点。同时预测到该蛋白有 1
个跨膜区域，位于碱基的 4-24 位 ；B 细胞表位可能
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期144
出现的区域，在 OmpH 蛋白第 26-30 区段（QDGTK）、
44-49 区段（ EKNERG ）、87-94 区段（TVKEGPSQ）、
179-185 区段（QAPRDGR）、282-288 区段（ATTRDRS）
和 310-315 区段。
参 考 文 献
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