全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
现代分子生物学的不断发展除了为生物学领域
带来了革命性的突破之外，也被广泛应用于其他相
关领域，极大地推动了诸如食品、医学、环境等学
科的研究，成为各学科前沿研究中必备的强大工具。
分子生物学方法大多是以 DNA 作为最主要的研究对
象，而很多情况下可供分析使用的 DNA 数量极少，
如 胚 胎 植 入 前 遗 传 学 诊 断（Preimplantation genetic
diagnosis，PGD）可有效避免植入胚胎存在某些疾
病而具有显著的优生学意义，而这一技术的实现仅
收稿日期 ：2014-04-10
基金项目 ：国家青年千人计划，山东省万人计划，山东省自然科学杰出青年基金（JQ201204）
作者简介 ：潘孝明，男，博士研究生，研究方向 ：食品分子生物学 ；E-mail ：pan.xiao.ming@163.com
通讯作者 ：梁兴国，男，教授，研究方向 ：核酸化学与生物技术 ；E-mail ：liangxg@ouc.edu.cn
全基因组扩增技术原理及研究进展
潘孝明  梁兴国
（中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛 266003）
摘 要 ： DNA 芯片及下一代测序等高通量技术的发展极大促进了分子生物学技术在各领域的广泛应用，但此时样品数量与
质量往往是制约研究进行的重要因素，全基因组扩增技术（Whole genome amplification, WGA）则可有效解决这一问题，其可使极
微量目标基因组 DNA 同时得到扩增从而提供满足高通量分析研究所需的起始材料。高效可靠的全基因组扩增技术使基于单细胞水
平的大规模全基因组分析成为现实，且随着研究的不断深入，对全基因组扩增技术提出了更高的要求。对过去常用的以及近期发
展的全基因组扩增技术进行了概述，阐明了各种方法的原理，并对各种方法的特点从原理上进行了分析总结，以期为全基因组扩
增技术的应用提供一定的参考。
关键词 ： 全基因组扩增 单细胞基因组测序 基因型 基因组变异 突变检测
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.008
Principle of Whole Genome Amplification Technology and Its Progress
Pan Xiaoming Liang Xingguo
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003）
Abstract: The rapid developments of DNA array and next generation sequencing technologies had greatly promoted molecular biology
techniques to be used in various fields. However, the limited quantity and quality of sample DNA may affect large scale genetic analyses. To
overcome these problems, the whole genome amplification（WGA）technology was employed to amplify trace amounts of genomic DNA to
sufficient quantity to meet the requirements of high throughput analyses. The highly efficient and reliable WGA methods also helped to realize
large scale of genetic analyses based on even single cell. Moreover, as the single cell level research continues, more efficient WGA approaches
were developed. This paper summarized the general WGA methods frequently used before and newly developed methods on basic principle level
as well as the advantages and disadvantages of each method, which helped to make good use of the powerful WGA techniques.
Key words: Whole genome amplification Single cell sequencing Genotyping Genome variations Mutation detection
仅允许使用 1-2 个胚胎细胞进行分析检测［1］；在法
医鉴定中往往仅能获得痕量 DNA 样品等［2］，此时
下 一 代 测 序（Next generation sequencing，NGS） 与
DNA 芯片技术等高通量分析方法往往受限于样品量
太少而无法发挥其作用［3］，全基因组扩增技术（Whole
genome amplification，WGA）能够实现对整个基因组
的扩增以提供大量可供分析样品，因而为此类研究
提供了强有力的支持，并且高灵敏度 WGA 技术的
不断进步也极大促进了单细胞全基因组测序技术的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期48
发展，使很多针对单细胞的大规模研究分析成为了
可能，在疾病早期诊断、微卫星序列分析、杂合子
丢失（Loss of heterozygosity，LOH）、突变检测以及
生物进化研究中具有重要的意义。近年来应用 WGA
技术的单细胞分析日臻成熟且取得了显著成果［4-8］，
本文将对目前已经广泛应用的以及新出现的 WGA
方法从原理、应用等方面进行介绍，并对各自方法
的优点以及存在的问题进行概括性总结。
1 基于 PCR 技术的 WGA 方法
1.1 引物延伸预扩增法
在所有 WGA 方法中引物延伸预扩增法（Primer-
extension preamplification，PEP）是较早出现的一种，
Zhang 等［9］最早应用 PEP 方法实现了单个单倍体细
胞基因组的全扩增。PEP 法是一种基于 PCR 技术发
展而来的 WGA 方法，主要原理是使用 15 个碱基长
的随机引物（N15，理论上有 4
15 种组合）在 37℃的
低退火温度下进行较长时间的退火，然后缓慢升温
至 55oC 进行长时间的引物延伸，如此反复多个循环
（图 1）。Dietmaier 等［10］对 PEP 方法进行了一定的
改进，包括对模板 DNA 的提取方法、反应循环条件
的优化以及高保真聚合酶的使用等，并成功实现同
时对单个肿瘤细胞的多个突变位点进行分析［10，11］；
Anchordoquy 等［12］通过 PEP 法对口腔细胞基因组全
扩增后进行基因型分析，对多达 1 890 例等位基因
的分析结果表明 PEP 法可提供足量优质的模板满足
高通量基因型分析的要求。但由于 PEP 法使用随机
引物以及较为不严格的 PCR 循环参数，因此可能导
致不均衡的扩增结果产生［13，14］。
1.2 简并寡核苷酸引物PCR
与 PEP 法 类 似， 简 并 寡 核 苷 酸 引 物 PCR 法
（Degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR）
也是一种基于 PCR 技术的全扩增方法（图 2），最早
由 Telenius 等［15］提出，其原理是使用部分简并的引
物进行 PCR 反应（引物中间部分含有 6 个随机碱基），
在最初的几个循环过程中使用较低的温度（~25℃）
进行退火以确保引物与模板的结合，并缓慢升温至
引物延伸温度进行引物延伸，完成最初几个循环后
使用相对较高的退火温度（~55℃）进行多循环常规
PCR 反应，对 DOP-PCR 结果影响较大的是因素是聚
合酶及引物浓度，因此需要进行优化以获得最佳实
验结果［15，16］。Cheung 等［17］应用 DOP-PCR 对不足
1 ng 的人类基因组 DNA 实现了数百倍的扩增，并提
供满足上百次微卫星序列基因型分析所需的模板 ；
Van 等［18］ 对 传 统 DOP-PCR 进 行 了 一 定 改 进， 同
时使用 4 条简并引物进行扩增，且每条引物中间都
含有 8 个随机碱基，从而增加了引物的简并性，并
将 DOP-PCR 产物使用 Roche GS-FLX 平台进行下一
代测序（NGS）从而实现了对研究较少的大豆品种
（Sinpaldalkong 2）的基因组结构分析，表明 DOP-
PCR 法在对未知样品分析中具有一定潜力。DOP-
PCR 法虽然使用相对 PEP 法更为严格的 PCR 反应条
件，但引物与模板间结合的不确定性以及引物间的
相互作用仍可能导致较低的全扩增灵敏度及较高的
错误率［19］。因此，较大程度上限制了该方法的应用，
近年来应用该方法的报道相对较少。
15 mer䲿ᵪᕅ⢙о⁑ᶯสഐ㓴ཊս⛩䲿ᵪ䘰⚛ˈ൘нѕṬⲴᢙ໎ᶑԦлਁ⭏ᕅ⢙ᔦը
新形成的片段与原基因组一起成为接下来循环反应的模板
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5˃3˃3˃
图 1 引物延伸预扩增法原理示意图［9］
ㆰᒦᕅ⢙ ਸᡀㅜаᶑPCR䬮ㅜаᶑPCR䬮ਸᡀㅜҼᶑPCR䬮 ㅜҼᶑPCR䬮
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สഐ㓴DNA
图 2 简并寡核苷酸引物 PCR 原理示意图［15］
2014年第12期 49潘孝明等：全基因组扩增技术原理及研究进展
1.3 连接介导PCR
广 义 上 连 接 介 导 PCR（ligation-mediated PCR，
LM-PCR）指的是一类有接头连接过程参与的 PCR
反应，相对于 PEP 与 DOP-PCR，连接介导 PCR 最
初并非设计用来进行基因组全扩增，其最早是由
Pfeifer 等应用于体内足迹研究（in vivo footprinting）、
甲基化分析、DNA 损伤鉴定等［20-23］，在此基础上对
其稍加改变即可进行基因组全扩增反应［4，24］。总体
而言 LM-PCR 全扩增技术需要通过 3 个步骤来实现：
（1）模板 DNA 的片段化处理 ：可通过物理剪切或限
制性内切酶处理使基因组 DNA 断裂成若干适合 PCR
扩增的片段。使用物理剪切法对 DNA 进行处理时因
无法预测片段末端结构，因此需要对其进行平末端
化处理以满足其与接头进行连接的条件［25］，如使用
限制性内切酶对模板进行剪切，因各片段末端组成
已知，因此大多数情况下无需对片段进行处理［26］；
（2）模板片段与接头连接 ：根据酶切片段类型设计
可与之连接的接头，在 DNA 连接酶的作用下与模板
片段两端连接，接头中含有一段外源通用引物序列，
用作下一步 PCR 反应中的引物 ；（3）全扩增 PCR
反应 ：连接成功的模板片段经引物延伸后两端形成
了通用引物结合位点，因此可以外源引入的通用引
物进行 PCR 反应，包括接头在内的模板片段可同时
得到扩增（图 3）。
对基因组的片段化处理是 LM-PCR 全扩增技术
的关键步骤之一，其对接下来的连接反应及 PCR 反
应具有较大影响，使用物理剪切法可较好保证片
段长度的均一性，但需要进行片段平末端化处理。
Tanabe 等［27］在传统 LM-PCR 的基础上发展了 PRSG
法（Adaptor-ligation PCR of randomly sheared genomic
DNA）对基因组进行全扩增，其使用 HydroShear 仪
将基因组 DNA 随机剪切成 0.5-2 kb 的片段进行接
头连接后扩增，通过对 307 个微卫星序列进行基
因分型以及 287 个基因座进行 CGH 分析的结果表
明 PRSG 法可准确高效的实现全基因组扩增。酶法
剪切无需昂贵的仪器因此可在绝大多数实验室进
行，但使用限制性内切酶对基因组进行酶切时无法
预测其片段长度，尤其是无法完全避免较长片段
的产生，针对这一问题 Liu 等［28］采用 3 种内切酶
（DpnII，HhaI，RsaI）对基因组进行酶切，通过对
石蜡包埋的肿瘤组织的全扩增结果表明 LM-PCR 全
扩增覆盖率可达到 96%，进一步将产物应用于 CGH
以及 PCR-SSCP 分析（PCR-single-strand conformation
polymorphism）验证了其扩增产物的准确性，说明
LM-PCR 全扩增方法在对保存状况较差样品的分析
方面具有巨大的潜力。相对于其他基于 PCR 技术的
全扩增方法（如上述的 PEP 与 DOP-PCR），LM-PCR
法使用较为严格的扩增条件，且使用的是一条通用
引物，所有连接片段间与通用引物结合的能力相同，
因此可在很大程度上保证所有片段得到相同程度的
高灵敏度扩增。目前已有 Sigma 公司应用该技术开
发的 GenomePlex 系列试剂盒产品［4，24，29］。LM-PCR
方法的优点是扩增效率极高，缺点是步骤相对繁琐，
对复杂 DNA 序列（如富含 GC 结构的模板）的扩增
可能出现偏差，并且由于模板片段间具有相同的黏
性末端（或平末端），因此在接头连接过程中这些片
段间会不可避免的发生“无序自连”，导致重组得到
的片段较长而扩增失败。针对这一“自连”问题，
作者所在课题组使用 IIS 型限制性内切酶对基因组
进行酶切产生具有随机碱基黏性末端的片段，配合
使用具有随机碱基黏性末端的接头，可极大减少自
连现象发生的几率。以 BbvI 内切酶为例（识别位点
GCAGC（8/12）↓），其可产生具有 4 碱基随机碱基
的黏性末端 NNNN，因此可将自连概率减少 44=256
࢚࠷สഐ㓴DNA䘎᧕䞦 ᧕ཤ㚊ਸ䞦䙊⭘ᕅ⢙ PCRޘᢙ໎ӗ⢙
图 3 连接介导 PCR 原理示意图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期50
倍，并通过 qPCR 等技术验证了这一改良方法极高
的扩增效率，各目标片段可较为均衡的扩增数百
万倍［30］。
2 恒温全基因组扩增反应
2.1 多重置换扩增反应
基 于 恒 温 核 酸 扩 增 技 术 的 多 重 置 换 扩 增 法
（Multiple displacement amplification，MDA） 的 出 现
相对 PCR 类全扩增方法较晚，其基本原理是使用
一条硫代修饰的六核苷酸随机引物（N6）在恒温条
件下与基因组随机退火，并在具有强链置换活性
的 phi29 DNA 聚合酶的作用下发生链置换扩增反
应，置换产生的单链序列又可与随机引物任意退火
延伸，形成超分支扩增结构［31］，由于 phi29 DNA 聚
合酶具有较强的持续合成 DNA 的能力，因此可持续
合成长达 50-100 kb 的产物（图 4）。Dean 等［32］最
早应用 MDA 法进行全基因组扩增，相对于 PCR 类
方法，MDA 法显示出极高的扩增灵敏度（1-10 基
因组拷贝），且通过对 8 个染色体位点的扩增检测
结果显示各目标间扩增偏差可控制在 3 倍以内，远
远小于 DOP-PCR 等方法 4-6 个数量级的扩增偏差。
此后，有大量成功应用 MDA 法进行 WGA 的报道，
如 Hellani 等［33］将 MDA 法成功应用于 PGD 研究 ；
Kumar 等［34］ 应用 MDA 法实现了对难于培养的伯
纳特氏立克次氏体基因组的全扩增等，均显示出其
极高的 WGA 效率。但其对模板质量的要求相对较
高，在非最佳实验条件下亦可导致非均衡扩增的产
生［35］。由于 MDA 法是一种恒温核酸扩增方法，可
能存在一定的非特异性扩增问题，即体系内不含有
模板时也会产生大量产物，针对这一问题 Marcy 等［36］
使用极微量的 MDA 体系（60 μL）对单细胞基因组
DNA 进行全扩增 ；Pan 等［37］通过向体系中加入一
种特殊的海藻糖进行 MDA 反应，均对非特异性扩增
产生了一定的抑制效果。
MDA 法是目前公认应用最广泛的 WGA 方法，
操作简单且对实验仪器的要求极低，且使用非预变
性的模板时也可取得良好的 WGA 效果，可进一步
简化实验操作及避免污染的产生［32］，可广泛应用
于基因组测序、CGH、SNPs 分析等相关领域，目前
针对该方法开发的产品较为成熟，具有代表性的为
Qiagen 公司的 Repli-g 系列全扩增试剂盒［38-40］。
2.2 基于引物酶的全基因组扩增
由 T7 细菌噬菌体核酸复制方式演化而来的基于
引物酶的全基因组扩增（Primer-based whole genome
amplification，pWGA）是一种恒温全基因组扩增方法，
相对于其他所有 WGA 方法，pWGA 最大的特点是在
扩增过程中不需要使用任何引物，且其不需要对模
板进行预变性处理［41］。pWGA 过程中所需的 T7 gp4
蛋白可同时发挥解旋酶和引物酶的作用，该蛋白的
C 端部分可利用脱氧胸苷三磷酸（dTTP）水解产生
的能量来将 DNA 双链解旋 ；而 N 端则行使引物酶
（primase）的作用，其特异性识别 3-CTGG（G/T）-5
和 3-CTGTG-5 并产生短的 RNA 作为扩增引物。引
物生成后在 T7 DNA 聚合酶全酶的作用下进行持续
的扩增反应，由 T7 gp2.5 基因编码的单链 DNA 结合
蛋白（Single-stranded DNA binding protein）与解旋产
生的单链 DNA 结合并与解旋酶 / 引物酶、聚合酶一
起完成整个全基因组扩增过程（图 5），该扩增模式
与滚环扩增（Rolling circle amplification，RCA）相似
并可以产生长达 40 kb 的产物［42］。
䲿ᵪᕅ⢙ Ø29㚊ਸ䞦
สഐ㓴DNA3˃ 5˃
图 4 多重链置换法全扩增原理示意图［31］
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图 5 基于引物酶全基因组扩增法原理示意图［42］
2014年第12期 51潘孝明等：全基因组扩增技术原理及研究进展
除上述几种蛋白（酶）外，pWGA 反应还需要
核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphokinase）、无
机焦磷酸酶（Inorganic pyrophosphatase）以及由肌酸
激酶（Creatine kinase）和磷酸肌酸（Phosphocreatine）
组成的 ATP 生成系统。其中核苷二磷酸激酶的主要
作用是将 NTPs 中的 γ-磷酸基团转移至 NDPs 以重新
形成 NTPs 而平衡体系中的 dNDP 与 dNTP 的比例，
并可以从一定程度上弥补解旋过程中造成的 dTTP 损
失 ；无机焦磷酸酶可以将扩增反应中产生的无机焦
磷酸分解为磷酸盐，减少因其累积而对 T7 DNA 聚
合酶造成的抑制 ；最终肌酸激酶将磷酸肌酸中的高
能磷酸键转移至 dNTPs，从而合成新的 dNTPs 而提
高全扩增的效率。
与 MDA 法相比，pWGA 法仅需 1 h 即可完成反
应。Schaerli 等［43］发展了使用 T4 噬菌体 gp61 引物
酶的全扩增体系 T4 pWGA，并显示出在基因组测序、
DNA 标记、大规模菌落筛选以及 DNA 定量等方面
的潜力，但相对于其他 WGA 方法，目前对 pWGA
法的报道仍偏少［2］，除该方法面世不久之外，反应
需要较多的蛋白（酶）、试剂组合也可能对其推广普
及产生一定的限制作用。
3 多次退火环状循环扩增技术
美国国家科学院院士谢晓亮教授带领的团队于
2012 年底在 Science 杂志上连续发表了两篇应用其
新发明的一种 WGA 方法进行单细胞测序研究的文
章，引出了“多次退火环状循环扩增技术”（Multiple
annealing and looping-based amplification cycles，
MALBAC） 这 一 全 新 的 WGA 方 法， 并 应 用 该 方
法成功实现了单细胞水平的单核苷酸变异（Single-
nucleotide variations，SNVs）以及拷贝数变异（Copy-
number variations，CNVs）的研究［44，45］。其结合了
MDA 法与 PCR 方法的特点，使用的 35 nt 长的引物
由一段固定的 27 nt 通用引物序列和 8 nt 随机碱基
序列（N8）组成，在 0
oC 时该 8 nt 随机碱基序列可
与模板任意退火，梯度升温至 65oC 后在具有链置
换活性的 Bst 大片段 DNA 聚合酶作用下发生链置换
聚合反应，得到一系列长度不一的（0.5-1.5 kb）半
扩增子（Semiamplicons），在 94℃变性、0℃退火以
及 65℃延伸循环后，上一循环中半扩增子形成了两
端具有互补结构（27 nt）的全扩增子（Amplicons），
随后降低温度至 58℃使得到的扩增子两端互补形成
loop 结构，从而可以避免引物与其进行结合导致全
扩增子倍增导致的不均衡扩增，因此可以很大程度
上保证该循环发生的是线性扩增。在经过 5 个上述
类似线性扩增循环后可得到大量全扩增子并做为接
下来 PCR 反应的模板，并使用该 27 nt 通用引物进
行指数 PCR 反应，因此只有全扩增子才能得到有效
扩增，从而实现对整个基因组的高效而又均衡的全
扩增（图 6）。
PCRᢙ໎58ćᖒᡀloop94ćਈᙗ
94ćਈᙗ
65ćᔦը0ć␜⚛65ćᔦը
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5њᗚ⧟
สഐ㓴DNA
图 6 多次退火环状循环扩增技术原理示意图［44］
MALBAC 法显示出比 MDA 法更为均衡的扩增
结果［44］，但使用单细胞进行基因型分析时 MALBAC
法 的 假 阳 性 率 偏 高， 比 MDA 可 高 出 40 倍， 这
可 能 是 因 为 MDA 法 使 用 的 phi29 DNA 聚 合 酶 比
MALBAC 法应用的 Bst 和 Taq 聚合酶具有更高的保
真度，因此往往需要使用多个细胞以获得更加准确
的结果［46］。由于 MALBAC 法对单细胞全基因组扩
增具有很高的覆盖率（93%）和均衡性，甫一出现
就引起了较多的关注，Ni 等［47］成功应用其对外周
血液中极少数的循环肿瘤细胞（CTCs）进行 CNVs
分析，Hou 等［48］对单个卵母细胞进行基因组测序，
显示出该方法在癌症早期检测以及胚胎移植等领域
的广阔应用前景。
4 结语
综上所述，单细胞基因组测序技术的发展极大
促进了癌症、基因组变异等众多领域研究进展，而
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期52
表 1 主要的 WGA 方法比较
方法 类型 产物长度 优点 缺点 应用
PEP 基于 PCR ＜ 2 kb 操作简单，对模板质量要求低
使用随机引物易产生扩增偏
差及片段丢失
CGH、LOH 分析、STR 分型等
DOP-PCR 基于 PCR ＜ 2 kb 产物产量较高，操作较为简单
实验条件需要较多优化，起
始模板数量少时易产生扩增
偏差
FISH、探针制备、SNP 分型、
SSCP 分析等
LM-PCR 基于 PCR ＜ 2 kb
灵敏度高，使用通用引物扩增均衡，
对模板质量要求低、产物产量高
操作步骤相对繁琐，复杂模
板时易丢失片段
CGH、建立文库、SNP、STR
分型、基因检测等
MDA 恒温扩增法 ＜ 100 kb
产物片段长、忠实度高，不需要特殊
仪器，扩增均衡
对模板质量要求高，可能产
生非特异性产物
NGS、RFLP、单细胞测序、
SNP、STR 分型等
pWGA 恒温扩增法 ＜ 40 kb
不需要使用任何引物以及对模板进行
预变性处理
使用的蛋白（酶）以及试剂
较多，效果有待验证
制备探针、DNA 污染检测、
CGH 等
MALBAC
结合恒温扩
增与 PCR 法
＜ 2 kb
灵敏度高，扩增均衡度高，操作，产
物产量高
模板拷贝数极低时易扩增偏
差，可能出现非特异性扩增
单细胞测序、CGH、SNV、
CNV 分析等
决定这一技术应用成功与否的最关键因素就是全基
因组扩增效果，因此对现有 WGA 方法进行改良或
研发新的高效 WGA 方法是目前研究的热点［46，49-
51］。总体而言现有 WGA 方法各有特点（表 1），需
根据实际情况选择合适的 WGA 方法加以应用。如
PCR 类全扩增方法对样品质量要求相对较低且扩增
效率高，但全扩增产物片段较短，指数反应易导致
所有片段的非均衡扩增 ；而 MDA 法的成功应用的前
提是高质量基因组模板的获得，其扩增产物较为均
衡且更加利于全基因组测序 ；但无论 PCR 类方法或
是恒温全扩增方法，目前都存在一定的非特异性扩
增现象，即使在较为严格的 PCR 反应条件下这一问
题仍无法完全避免［52，53］，因此对现有方法加以改进
抑制非特异性扩增也是当前 WGA 方法研究中需要
解决的问题，如数字微滴 PCR（Digital microdroplet
PCR）的发展可为基于 PCR 技术的 WGA 方法带来
一些新的思路。
目前已有上千种生物基因组被测序，但是相
对于更多的其他物种，已测序的物种数量仅占极少
数［54］，如自然界中绝大多数微生物不可培养且难以
富集，导致针对这类微生物的全基因组测序难度极
大［55，56］。因此，高效而又可靠的 WGA 技术将在更
多相关研究领域中大有可为。
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（责任编辑 狄艳红）