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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-09-05
基金项目 : 国家转基因生物新品种培育科技重大专项（2009ZX08009-062B）
作者简介 : 卫静 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 植物抗逆基因克隆和功能研究 ; E-mail: wei6jing@sina.com
通讯作者 : 张凌云 , 女 , 副教授 , 研究方向 : 植物抗逆基因克隆和功能研究 ; E-mail: lyzhang73@sohu.com
拟南芥转录因子 NF-YC的原核表达及多克隆抗体制备
卫静 李长江 刘亚静 黄桂雪 张凌云
（北京林业大学森林培育与保护教育部重点实验室，北京 100083）
摘 要： 采用 PCR方法扩增 NF-YC基因得到其全长 cDNA序列，并将其克隆至原核表达载体 pET-48b中，在大肠杆菌 BL21
中用 IPTG诱导出分子量约为 45 kD的融合蛋白，SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。利用亲和层析技术对融合蛋白
进行纯化，纯化后的目的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。间接 ELISA检测抗体效价大于 1 62 500，Western blotting结果显示，
该抗体可特异性识别 NF-YC蛋白。
关键词： 拟南芥 转录因子 NF-YC融合蛋白 原核表达 多克隆抗体
Prokaryotic Expression of the Arabidopsis Transcription Factor
NF-YC and Preparation of Its Polyclonal Antibodies
Wei Jing Li Changjiang Liu Yajing Huang Guixue Zhang Lingyun
（ Key Laboratory of Forest Silviculture and Conservation of the Ministry of Education，Beijing Forestry University，Beijing 100083）
Abstract: The cDNA encoding full-length of NF-YC was amplified by PCR and was inserted into prokaryotic expression vector pET-
48b. The recombinant plasmid NF-YC- pET48b was then transformed into E.coli BL21 and the NF-YC recombinant protein of 45 kD was
expressed by induction with IPTG. The expression product was indentified by SDS-PAGE and Western blotting analysis. The fusion protein was
purified by affinity chromatography and then was used to immunize rabbits to generate polyclonal antibody. Indirect ELISA analysis shows that
the titer of the antibody is higher than 1 62 500. Besides, Western blotting analysis indicates that the antibody can detect expressed antigen
NF-YC protein.
Key words: Arabidopsis Transcriptional factor NF-YC fusion protein Prokaryotic expression Polyclonal antibody
植物生长发育过程中，感受内外环境的变化，
都要通过对基因的精确调控产生相应的反应，而许
多基因的表达都是由特定的转录因子与特定的顺式
作用元件相互作用调控的。NF-Y 转录因子是近年来
新发现的具有多种生物功能的植物特异性转录因子，
在植物的生长发育和逆境胁迫方面发挥重要的作用。
NF-Y 的转录因子普遍存在于真核生物体中［1-3］。
它是与基因启动子上游的 CCAAT 框结合以调节基
因转录的反式作用因子，有 HAP2（NF-YA/CBF-A）、
HAP3（NF-YB/CBF-B）、HAP5（NF-YC/CBF-C）3
个亚基组成的异源三聚体，这 3 个亚基都是形成
HAPs-DNA 复合物所必需的。现已从拟南芥和水稻
等高等植物中克隆了编码 NF-YA、NF-YB、NF-YC
蛋白所有基因［4, 5］。目前研究发现在植物中还没
有对完整 NF-Y 复合体进行过报道，但 NF-Y 单个
亚基在植物的胚胎发育、干旱胁迫、ABA 信号转
导、光周期依赖的花期调控起较重要的作用。LEC1
（NF-YB9）是植物中最早克隆的一个 NF-Y 转录因
子，LEC1 在发育的胚中有较强的表达，并且是控
制胚向成熟状态转变所必需的［6, 7］。在对拟南芥花
期调控的研究中发现，AtHAP3b 基因通过提高开花
基因（如 FT）的表达调节拟南芥在长日照条件下的
开花时间，而且 AtHAP3b 基因的表达受渗透胁迫的
诱导，在渗透胁迫条件下，AtHAP3b 基因突变体的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期58
开花时间比野生型植株延迟［8］。AtNF-YA5、AtNF-
YB9 和 AtNF-YC9 组成的复合物参与拟南芥对蓝光
和 ABA 反应的两条不同的信号途径。在对 NF-Y 转
录因子的逆境研究中发现，在拟南芥中过表达 NF-
YA5 降低其对干旱的敏感度，降低叶片花青素含量
和气孔的开度，而相应突变体中表型正好相反［9］。
在玉米中过表达 NF-YB1 及其同源基因 ZmNF-YB2
均可提高玉米的抗旱能力［10］。目前的研究大多集中
在NF-YA和NF-YB上，而对NF-YC功能的研究很少，
NF-YC 与这些亚基密切相关的，它是 NF-Y 家族中
的重要成员之一，在植物花期调控及响应逆境反应
中也可能发挥很重要的作用，有必要对其进行进一
步研究，来揭示 NF-Y 转录因子的作用。
本研究将拟南芥 NF-YC 基因克隆到原核表达载
体 pET-48b 中，利用大肠杆菌系统表达并纯化获得
NF-YC 融合蛋白。将融合蛋白免疫兔子，制备拟南
芥 NF-YC 多克隆抗体，并对多克隆抗体的效价和特
异性进行了分析，为研究 NF-YC 转录因子在植株花
期调控与响应逆境胁迫过程中的功能并寻找与其互
作蛋白及其下游作用的靶基因等奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、蛋
白 Marker、反转录试剂盒均为 Fermentas 公司产品。
RNA 提取试剂盒、Taq 酶、质粒小量提取试剂
盒、DNA Marker 都由北京天根生化科技有限公司
提 供。Ni-NTA-His-Bind Resin 为 Novagen 产 品。
PVDF（聚偏二氟乙烯膜）转印膜、AP 标记的羊
抗兔抗体、His 标签抗体均购自北京亚太恒信生物
技术有限公司。其他常规化学药品均为进口或国
产分析纯。
1.1.2 菌株与载体 大肠杆菌 DH5α 感受态细胞和
表达菌株 BL21（DE3）为北京天根生化科技有限公
司产品。pEASY-T 载体购自北京全式金生物技术有
限公司，pET-48b 表达载体由清华大学生命科学院
张大鹏教授实验室惠赠。
1.1.3 试验动物 2 只 SPF（Specefic pathogen Free）
级的新西兰兔（Nova Zela^ndia），购自北京博尔迈生
物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 NF-YC 基因的 PCR 扩增 按照植物 RNA 提
取试剂盒步骤操作提取拟南芥总 RNA 反转录成
cDNA， 以 cDNA 为 模 板，P1、P2 为 引 物， 通 过
PCR 扩增获得目的片段。根据 tair（The Arabidopsis
Information Resource）数据库中 NF-YC 基因 cDNA
序列号（AT1G56170），用 Primer5.0 软件设计合成
扩增其全长的引物 P1、P2 如下，P1 ：5-CCGGAAT
TCTATGGAGCAGTCAGAAGAGGGTC-3（划线部分
为 EcoR I 酶切位点）；P2 ：5-CCCAAGCTTAGACTC
ATCAGGGTGTTGCTCC-3（划线部分为 Hind Ⅲ酶切
位点）。PCR 的反应程序 ：95℃预变性 5 min ；95℃
变 30 s，58℃退火 40 s，72℃延伸 1 min，循环 30 次；
72℃延伸 10 min。PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电
泳，鉴定扩增产物的大小正确后切胶回收目的片段，
连接到 pEASY-T 载体上（步骤参照载体使用说明
书），转化至大肠杆菌 DH5α 中，涂布于含 Amp+（100
mg/L）的 LB 固体培养基上，37℃培养过夜，筛选
出阳性克隆后，挑取单菌落提取质粒，用 EcoR I 和
Hind Ⅲ限制性内切酶进行双酶切鉴定，将鉴定正确
的含有 pEASY-T-NF-YC 载体的克隆进行测序（上海
英骏生物技术有限公司）。
1.2.2 原核表达载体 NF-YC-pET-48b 的构建及鉴
定 上述重组质粒 pEASY-T-NF-YC 与 pET-48b 质
粒分别用 EcoR I 和 Hind Ⅲ双酶切处理，37℃消化 5
h，在 T4 连接酶的作用下连接，连接产物转化到大
肠杆菌 DH5α 感受态细胞，通过 Kan+（50 mg/L）抗
性筛选阳性克隆，提取质粒，经 PCR 及 EcoR I 和
Hind Ⅲ双酶切验证，送上海英骏生物技术有限公司
测序。得到正向插入的重组质粒 NF-YC-pET-48b。
1.2.3 NF-YC-pET-48b 融合蛋白的诱导表达及表达
产物的 SDS-PAGE 和 Western blotting 鉴定 将测序
正确的 NF-YC-pET-48b 质粒转化到大肠杆菌 BL21
表达菌株中，在含有 Kan+（50 mg/L）抗性平板上筛选，
培养 12-16 h 挑取单菌落，在含有 Kan+（50 mg/L）
的 LB 液体培养基中 37℃过夜培养。然后将此培
养液按 1 100 比例接种到新鲜的 LB 液体培养基
中，37℃、260 r/min 振摇至 OD600=0.6-1.0 时，加入
IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）终浓度为 0.5 mmol/L，
2012年第3期 59卫静等 ：拟南芥转录因子 NF-YC 的原核表达及多克隆抗体制备
25℃诱导培养。分别于加入诱导剂后 2、4、6、8 h
取 1 mL 培养物，12 000 r/min 离心 1 min，沉淀用
100 μL PBS 重悬，加入适量的 1×SDS 蛋白上样缓冲
液煮沸 5 min，离心后取上清 10 μL 用 12% 的 SDS-
PAGE 电泳检测。
Western blotting 鉴定 ：经 IPTG 诱导后的表达产
物经 12% 的 SDS-PAGE 电泳后转移至 PVDF 膜上，
以 6×His Tag 兔多克隆抗体作为一抗，山羊抗兔
IgG AP 标记抗体作为二抗，用 NBT/BCIP 显色，检
测分析 Western blotting 结果。
1.2.4 融合蛋白的可溶性分析及亲和纯化 离心收
集 100 mL 诱导后的菌体用 PBS 重悬，加入蛋白酶
抑制剂和少许溶菌酶，冰上震荡超声破碎，然后加
入 0.1% TritonX-100 离心，分别取上清和沉淀，进
行 SDS-PAGE 电泳，分析融合蛋白是以包涵体还是
可溶蛋白形式存在。
包涵体的可溶性处理 ：用 3 倍体积的洗涤缓冲
液清洗包涵体除去可溶性蛋白，4℃、10 000×g 离
心 10 min，然后将包涵体沉淀溶解于 10 倍体积含有
8mol/L 尿素的裂解缓冲液中，4℃、16 000×g 离心
20 min，将上清载入 Ni-NTA 琼脂糖亲和层析柱中，
用 5 倍柱体积的漂洗缓冲液（0.1 mol/L NaH2PO4，
10 mmol/LTris-Cl，8 mol/L 尿素，pH6.3）洗柱以除
去杂蛋白，最后用 0.5 mL 的洗脱缓冲液（0.1 mol/L
NaH2PO4，10 mmol/LTris-Cl，8 mol/L 尿 素，pH5.9）
洗脱目的 3 次蛋白。收集洗脱组分，利用 12％ SDS-
PAGE 检测融合蛋白的纯度。
1.2.5 NF-YC 多克隆抗体的制备 抗原制备 ：亲和
柱纯化收集到的蛋白超滤浓缩后，然后进行 SDS-
PAGE 电泳，剥胶之后用 1 mol/L KCl 染色，将融合
蛋白所在位置的凝胶用干净刀片切下，液氮研磨并
用一定量的 PBS 溶解备用。
免疫兔子 ：将纯化好的 NF-YC 融合蛋白与等体
积的弗氏完全佐剂混匀后对成年健康家兔进行背部
多点皮下注射（800 μg/10 d），然后用相同的样品与
等体积弗氏不完全佐剂混匀注射家兔，重复 3 次每
次间隔 7 d。最后一次注射一周后，对被免疫的兔子
进行全采血，血液放 37℃温育 1 h，然后放 4℃过夜，
析出的血清加 0.9% 叠氮钠，分装后 -20℃保存。
1.2.6 间接 ELISA 鉴定抗体的效价 用 NF-YC 融合
蛋白包被 ELISA 板，每孔 100 μL，4℃过夜后弃液体，
PBS 洗涤 3 次 ；再用 5%（m/v）脱脂奶粉进行封闭，
37℃孵育 1 h ；PBS 洗涤后分别加入不同稀释度的抗
血清，同时以免疫前血清作为阴性对照，37℃孵育
2 h ；TBST 洗涤 5 次后加入 1 40 000 稀释的 HRP 标
记山羊抗兔 IgG，37℃孵育 1 h ；加底物 TMB 室温显
色 5 min，终止反应后，读取 450 nm 吸光值。
1.2.7 Western blotting 检测抗体的特异性 将诱导
表达的融合蛋白经上样缓冲液处理后，进行 12% 的
SDS-PAGE 电泳后，经电转仪转移到 PVDF 膜上，
将膜用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 溶液封闭 2 h，清洗
后加入按1 3 000稀释于TBST中的兔多克隆抗血清，
在摇床放置 2 h，以 TBST 清洗一抗 3 次，每 5 min
换一次清洗液。再加稀释于 TBST 中的 AP 标记的羊
抗兔 IgG（1 10 000），在摇床放置 2h，TBST 清洗
二抗 3 次，每 5 min 换一次清洗液。洗膜后放入含
有 NBT/BCIP 的缓冲液中显色 5 min 观察结果。
2 结果
2.1 NF-YC基因全长的扩增
通过设计特异性引物，利用 PCR 方法，以拟南
芥 cDNA 为模板扩增，获得长度约为 600 bp 的片段，
如图 1 所示，与预期的片段大小相符。
1.NF-YC 基因扩增产物 ; M.DNA Marker DL2000
图 1 NF-YC基因 PCR扩增结果
2.2 原核表达载体NF-YC-pET-48b的构建及鉴定
将获得的 NF-YC 基因克隆到 pEASY-T 载体上，
经 EcoR I 和 Hind Ⅲ双酶切处理及菌落 PCR 鉴定后，
利用 T 载体的通用引物测序结果表明目的片段与 tair
数据库序列吻合。为了获得大量的 NF-YC 蛋白，采
用原核表达载体 pET-48b 进行蛋白表达试验，因此
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期60
将目的基因克隆入 pET-48b，转化大肠杆菌 DH5α 后
重组质粒用限制性酶切及菌落 PCR 鉴定，电泳后可
以看见一条大约 600 bp 的条带，如图 2 所示。测序
结果表明目的基因 NF-YC 位于正确的读码框中，获
得原核表达载体 NF-YC-pET-48b。
2.4 融合蛋白的可溶性分析及纯化
取诱导后的菌体超声破碎后离心，将上清和沉
淀进行 SDS-PAG 检测。结果（图 5）显示，上清中
基本没有目的蛋白，表明该诱导表达蛋白大部分以
包涵体的形式存在或者是超声波破碎不彻底［11］。将
包涵体溶解于 8 mol/L 尿素溶液中，通过 Ni-NTA 琼
脂糖亲和柱分离，发现 3 次洗脱目的蛋白中仍有部
分杂蛋白，因此采用切胶回收得到较纯的目的蛋白，
最终得到用于制备抗体。
图 2 NF-YC原核表达载体的构建
1. 含原核表达载体 NF-YC-pET-48b 的 DH5α 菌落 PCR 产物 ; 2. 原核表达载
体 NF-YC-pET-48b 的 EcoR I 和 Hind Ⅲ双酶切产物 ; M.DNA Marker DL2000
2.3 NF-YC-pET-48b融合蛋白的诱导表达及鉴定
从图 3 中看出，相同 IPTG 浓度（0.5 mmol/L）
下，诱导 2、4、6、8 h 后均在约 45 kD 处清晰可见
NF-YC 融合蛋白（pET-48b 载体上标签蛋白的分子
量约 22 kD，NF-YC 蛋白分子量约 23 kD，诱导表达
的重组蛋白的分子量约 45 kD），其表达量随诱导时
间的延长而增加，8 h 时融合蛋白 NF-YC 即达到最
大表达量。由于融合蛋白上带有 His 标签，所以用
anti-His 多克隆抗体作为一抗进行 Western blotting 试
验，结果（图 4）显示表达的融合蛋白 NF-YC 能被
anti-His 多克隆抗体特异性结合，证明诱导表达的蛋
白确实是 His 融合蛋白。
1. 重组菌 NF-YC-pET-48b 不加 IPTG 诱导 ; 2-5. 重组菌 NF-YC-pET-48b
加 IPTG 分别诱导 2、4、6、8 h; M. 蛋白分子量标准
图 3 NF-YC在大肠杆菌中不同时间的诱导表达情况
1. 经 IPTG 诱导的 NF-YC BL21 表达的菌体蛋白 ;
2. 未诱导的 NF-YC BL21 表达的菌体蛋白
图 4 Western blotting检测 His-NF-YC融合蛋白的
表达情况
1. 尿素溶解后的包涵体 ; 2. 超声波破碎后的上清 ; 3-5. 分别是过柱
子后第一次 , 第二次 , 第三次的洗脱产物 ; M. 蛋白分子量标准
图 5 SDS-PAGE检测纯化的 NF-YC融合蛋白
2.5 NF-YC多克隆抗体的间接ELISA法检测鉴定
以纯化后的融合蛋白 NF-YC 为包被抗原，抗血
清以 1 100、1 500、1 2 500、1 12 500、1 62 500
倍数稀释，间接 ELISA 法测定免疫后获得的多克隆
抗血清的效价。测定结果 （图6） 显示示，以A450阳/A450
阴＞ 2.1 为标准［12］，当血清稀释到 62 500 倍数时，
2012年第3期 61卫静等 ：拟南芥转录因子 NF-YC 的原核表达及多克隆抗体制备
A450 值为 0.35，而阴性对照 A450 为 0.12，两者比值
为 2.9，呈阳性。表明制备的 NF-YC 兔抗血清效价
在 1 62 500 以上。ELISA 结果表明融合蛋白具良好
的免疫原性。
了 NF-YC 基因，并逐步构建到原核表达载体 pET-
48b 中，IPTG 诱导表达结果显示，NF-YC 融合蛋白
主要以包涵体的形式得到了高效稳定的表达并且诱
导 8 h 时蛋白表达量最多，产生的包涵体是高密度，
不溶性的蛋白表达产物，因此采用尿素溶解包涵体
的方法。先用漂洗缓冲液清洗包涵体以除去可溶组
分和黏附的细菌蛋白，再用含 8 mol/L 浓度尿素的
缓冲液溶解包涵体，这样处理后的包涵体内外源蛋
白被溶解，离心后存在于上清里。用上清液进行亲
和纯化，这样收集的蛋白确保是带有标签的目的蛋
白且能大大减少杂蛋白的干扰。但研究过程中发现
纯化之后仍有杂蛋白，可能是漂洗非特异蛋白不彻
底造成的，但漂洗次数过多相应的结合在亲和层析
柱上的目的蛋白也有损失，而制备抗体又需要获得
很高纯度的目的蛋白。为了达到制备抗体所需的抗
原的纯度，因此采用将亲和纯化后收集的目的蛋白
超滤浓缩后电泳切取凝胶中富集目的蛋白条带的方
法，该法回收的蛋白纯度较高且在免疫注射的过程
中凝胶起到了惰性载体的作用，这样包被的蛋白纯
度高且不易被体内的免疫细胞吞噬或进入溶酶体而
降解［13］，从而得到了满足抗体制备需要的高纯度抗
原。免疫兔后经 ELASA 检测得到了效价较高的抗血
清，对获得的多克隆抗血清经 Western blotting 技术
检测，结果显示制备的抗体与目的蛋白识别良好。
NF-YC 转录因子广泛参与植物胚胎发育、花期
调控、ABA 信号转导以及逆境胁迫等重要的生物过
程。有关 NF-YC 在植物中功能的研究越来越多，并
主要集中于拟南芥、水稻和玉米等植物。研究表
明，NF-YC 参与拟南芥花期调控，调控 FT 基因表
达，酵母双杂技术表明 NF-YC 还能与 CONSTANS
蛋白发生相互作用［14］。拟南芥的 nf-yc突变体在种
子萌发时对 ABA 更敏感［15］，且在拟南芥中过表达
青杆 NF-YC 基因能提高其幼苗的抗旱能力（Lingli L
待发表）。 但 NF-YC 转录因子如何在这些过程中发
挥作用，它在拟南芥中的亚细胞定位和下游作用的
靶基因都尚不清楚。而研究蛋白在细胞中的亚细胞
定位，对于研究蛋白的功能较重要，常用的最有效
的方法是免疫胶体金法［16, 17］，应用这一方法最关键
的是要有和目标蛋白特异性结合的抗体。染色质免
疫共沉淀（chromatin immunoprec ipitation，ChIp）方
图 6 ELISA检测多克隆抗体效价
2.6 Western blotting检测抗体特异性
为检测抗血清识别抗原的特异性，进行了
Western blotting 分析（图 7）。多克隆血清与 AP 标
记的羊抗兔 LgG 杂交显色后在膜上出现清晰的条带，
对比转膜前的 SDS-PAGE 结果以确定该阳性条带分
子量与表达的蛋白一致，可以看出在目的蛋白 45 kD
处有清晰的条带，而没有诱导的菌体在目标位置没
有条带，说明所制备的抗血清 anti-NF-YC 可以识别
NF-YC 蛋白。
1. 纯化后 NF-YC 融合蛋白 ;2. 未经诱导的 NF-YC 蛋白 ;
3. 不含融合蛋白的凝胶为抗原，免疫后兔抗血清孵育
图 7 Western blotting检测 NF-YC融合蛋白
3 讨论
利用原核表达的蛋白免疫动物制备抗体是一种
十分有效的方法。本研究采用分子生物学技术克隆
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期62
法可以用来在体内鉴定 NF-YC 转录因子直接调控的
下游靶基因，但是这一方法也需要特异性很高的蛋
白抗体［18］。本研究中制备的多克隆抗体与目的蛋白
NF-YC 杂交时只有单一条带出现，说明制备的抗体
特异性较强。这就为利用该抗体进行 NF-YC 的组织
和亚细胞定位研究和寻找其下游作用靶基因提供了
工具，从而为研究拟南芥 NF-YC 蛋白在植物花期调
控和逆境胁迫下的功能奠定了基础。
4 结论
本研究通过克隆、酶切、连接等分子生物学手段
将拟南芥 NF-YC 基因克隆到原核表达载体 pET-48 b
中，利用 IPTG 诱导融合蛋白 NF-YC 在大肠杆菌中
表达并采用亲和层析的方法纯化融合蛋白 NF-YC，
用纯化出的融合蛋白作为抗原免疫兔子，制备拟南
芥 NF-YC 多克隆抗体。ELISA 法检测多克隆抗体
的效价在 1 62 500 以上，Western blotting 分析抗体
的特异性良好。多克隆抗体 NF-YC 的制备为研究
NF-YC 转录因子在植株花期调控与响应逆境胁迫过
程中的功能并寻找与其互作蛋白及其下游作用的靶
基因等奠定了基础。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）