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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
HER2胞外段的克隆与原核表达
许银辉1 郭晓芳2 邬仙华3 钱晨旭1 罗磊4 徐莲花3 冯紫雅5 张小影6
（1 新乡医学院第二临床学院，新乡 453003 ；2 新乡医学院微生物教研室，新乡 453003 ；3 新乡医学院临床医学院，新乡 453003 ；4 新乡医
学院医学检验系，新乡 453003 ；5 新乡医学院三全学院，新乡 453003 ；6 新乡医学院护理学院，新乡 453003）
摘 要： 应用 RT-PCR技术从人乳腺癌细胞系 SK-BR-3中克隆出人表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor
receptor 2，HER2）基因的胞外段，并插入到表达载体 pET-30a中，得到重组表达载体 pET30-HER2（Ex）。将该载体转化至大肠杆
菌 BL21（DE3）细胞中，加入 IPTG进行诱导表达，成功获得 HER2胞外段蛋白。分别提取培养液上清、大肠杆菌周质腔、细胞
质可溶性及不可溶性组分蛋白进行 SDS-PAGE电泳分析，确定目的蛋白定位于大肠杆菌细胞质包涵体中。通过改变诱导温度、诱
导物浓度、诱导起始菌体密度和诱导时间，寻找最佳表达条件，使目的蛋白的表达量达到最高。结果表明，在 37℃下，OD600达到 1.0时，
经终浓度为 0.1 mmol/L的 IPTG诱导 4 h，目的蛋白的表达量最高。将重组表达菌进行超声破碎，分离出包涵体组分，经 Ni2+亲和
层析纯化后获得了纯度 >90%的 HER2胞外段蛋白，从而为抗 HER2抗体的制备及肿瘤疫苗的研究奠定了基础。
关键词： 人表皮生长因子受体 2 胞外结构域 原核表达 pET-30a载体
Cloning and Prokaryotic Expression of Extracellular Domain of Human
Epidermal Growth Factor Receptor 2
Xu Yinhui1 Guo Xiaofang2 Wu Xianhua3 Qian Chenxu1 Luo Lei4
Xu Lianhua3 Feng Ziya5 Zhang Xiaoying6
（1College of the Second Clinical Medicine，Xinxiang Medical College，Xinxiang 453003；2Department of Pathogen Biology，Xinxiang
Medical College，Xinxiang 453003；3College of Clinical Medicine，Xinxiang Medical College，Xinxiang 453003；4Medical Identifying
Department of Xinxiang Medical College，Xinxiang 453003；5Sanquan Medical College，Xinxiang 453003；6Nursing College of Xinxiang
Medical College，Xinxiang 453003）
Abstract: Extracellular domain gene of Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 （HER2） was amplified by RT-PCR from human
breast cancer cell line SK-BR-3. The recombinant expression vector pET30-HER2 （Ex） was constructed by inserting the extracellular
domain gene of HER2 into the pET-30a vector, and then was transformed into competent E. coli BL21（DE3） cells. After induced by IPTG,
the expression of HER2 extracellular domain protein was obtained in E. coli. Proteins from culture medium fraction, periplasmic fraction,
soluble cytoplasmic fraction and inclusion body fraction were extracted and analyzed by SDS-PAGE for the localization of HER2 extracellular
domain protein. Result of SDS-PAGE revealed that HER2 extracellular domain protein localized in the inclusion body of E. coli cytoplasm.
Optimum temperature, IPTG concentration, E. coli cell density （OD600） and induction time were determined for the highest production of
HER2 extracellular domain protein. The results showed that when OD600 reached 1.0, induced with 0.1 mmol/L IPTG at 37℃ for 4 h, where the
production of recombinant protein was highest. Recombinant protein in the inclusion body of E. coli was extracted with ultrasonic disruption and
was purified by Ni2+ affinity chromatography. The obtainment of HER2 extracellular domain protein with high purity and high production lays the
foundation for the development of anti-HER2 antibody and the study of HER2 overexpressing tumor vaccine.
Key words: HER2 Extracellular domain Prokaryotic expression pET-30a vector
收稿日期 : 2012-03-21
基金项目 : 新乡医学院大学生科研创新重点支助项目（DXSKYKT2010-001）
作者简介 : 许银辉 , 男 , 本科 , 研究方向 : 神经科学与心理卫生 ; E-mail: xuyinhui88888@126.com
通讯作者 : 郭晓芳 , 女 , 博士 , 研究方向 : 抗肿瘤靶向药物的开发及药理 ; E-mail: guoxiaofang_1981@126.com
2012年第8期 89许银辉等 ：HER2 胞外段的克隆与原核表达
HER2/neu（human epidermal growth factor rece-
ptor 2）是跨膜受体酪氨酸激酶家族的成员之一，分
子量 185 kD。除了 HER2 外，该家族还包含其他 3
个成员 ：HER1/EGFR、HER3 和 HER4。该家族成
员的结构相似，均含有 3 个结构域 ：（1）胞外结构
域（extra cellular domain，ECD）为配体结合结构域，
由 632 个氨基酸组成，其功能是与特异性配体相结
合。当配体如表皮生长因子（epidermal growth factor，
EGF）、转化生长因子 α （transforming growth factor α，
TGF-α）等与 HER1/EGFR、HER3 和 HER4 受体结
合后，可导致受体发生同二聚化或异二聚化，从而
激活受体的酪氨酸激酶活性，将特定的酪氨酸残基
磷酸化，进而活化一系列的胞内信号通路，最终促
进细胞的生长、增值、分化和迁移。与本家族的其
他成员不同，目前并没有发现 HER2 天然的配体，
但在发生二聚化的时候，HER2 受体是其他受体优
先选择的对象。（2）跨膜结构域为强疏水区，含 23
个氨基酸，其功能是将整个蛋白分子锚定在胞膜上。
（3）胞内结构域由 580 个氨基酸组成，为内源性酪
氨酸激酶活性的功能区域［1］。在许多上皮来源的肿
瘤中，HER2/neu 基因通常发生异常扩增或过表达，
如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和鼻咽癌中均
可见到 HER2 的过度表达［2］。而且 HER2/neu 的表
达水平与肿瘤对放、化疗的敏感性呈明显的负相关。
此外，它还参与了抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细
胞存活、上调血管内皮生长因子的表达，从而促进
肿瘤新生血管生成以及增加肿瘤细胞的侵袭力，破
坏机体组织抗侵袭屏障等［3］。因此，HER2/neu 受
体是肿瘤检测的一个重要标志物，也是抗肿瘤靶向
药物的重要作用靶标。本研究从高表达 HER2 受体
的人乳腺癌细胞 SK-BR-3 中扩增出 HER2 基因的胞
外段，将之插入到高效表达载体 pET-30a 后转化到
大肠杆菌中进行诱导表达和分离纯化，并对原核表
达条件进行优化，以获得高产量、高纯度的 HER2
受体胞外段蛋白，旨在为下一步抗 HER2 单克隆
抗体的制备以及肿瘤疫苗的研制提供必要的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
HER2 基因高表达人乳腺癌细胞系 SK-BR-3 由
中国医学科学院医药生物技术研究所甄永苏教授惠
赠；大肠杆菌菌株 DH5α、BL21starTM（DE3）和质粒
pET-30a 由本实验室保存。EcoR I、BamH I 限制性
内切酶、T4 DNA 连接酶、PrimScript cDNA 第一链合
成试剂盒、PrimeSTAR HS DNA 聚合酶以及 pMD18-
T 克隆载体均购自大连 TaKaRa 公司。质粒小量
提取试剂盒、PCR 产物凝胶回收试剂盒为北京天
根生化公司产品。HisTrap HP 亲和层析柱购自 GE
Healthcare 公司。Trizol 试剂为 Invitrogen 公司产品。
异丙基硫化-β-半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素、卡
那霉素为 Merck 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 SK-BR-3 细胞总 RNA 的提取 取 106 个对数
生长期的 SK-BR-3 细胞，用 PBS 洗涤 3 次后，加入
1 mL Trizol 试剂，室温裂解 5 min，之后加入 0.2 mL
氯仿，混匀，室温静置 2 min ；于 4℃，12 000× g
离心 15 min，将上清转移至另一离心管中，加入等
体积的异丙醇，混匀，室温沉淀 10 min ；于 4℃，
12 000×g 离心 15 min，弃上清。用 1 mL DEPC 处理
过的 75% 乙醇轻轻洗涤沉淀，待沉淀稍晾干后加入
适量 DEPC 水，轻轻吹打溶解 RNA ；用紫外分光光
度计测定 OD260 和 OD280 比值及 RNA 含量。
1.2.2 HER2 基因胞外段的克隆 根据 GenBank 中
HER2 基因的序列设计一对引物，上游引物引入
EcoR I 酶切位点，下游引物引入 BamH I 酶切位点（下
划线部分）。上游引物 S1 序列 ：5-GAATTCATGGA-
GCTGGCGGCCTTGTG-3，下游引物 A1 序列：5-GG-
ATCCCACGTCCGTAGAAAGGTAGTTGT-3（引物由
Invitrogen 公司合成）。cDNA 第一链的合成参照说明
书的要求进行，取 SK-BR-3 细胞总 RNA 1 μg、Oligo
dT 引物 1 μL、dNTP mixture （10 mmol/L each） 1 μL、
DEPC 水补至 10 μL，置于 DEPC 处理过的 EP 管中，
于 65℃变性 5 min，并立即插入冰上。之后再依次
加入 4 μL PrimeScript buffer、0.5 μL RNase 抑制剂和
1 μL PrimeScript 反转录酶，并加入 DEPC 水补足体
积 20 μL，将该反应液置于 42℃反应 60 min，之后
95℃加热 5 min 使酶失活，合成好的 cDNA 第一链
保存于 -20℃。
在薄壁 PCR 小管中配置 PCR 反应液 ：cDNA 第
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期90
一链溶液 2 μL，上游引物 S1 1 μL，下游引物 A1 1 μL，
PCR 反 应 buffer 2.5 μL，dNTP mixture （10 mmol/L
each） 1 μL，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 0.5 μL，无
菌水补足体积 25 μL。该反应液混匀后进行 PCR 扩
增，扩增程序 ：94℃预变性 5 min ；之后 94℃ 30 s，
55℃ 30 s，72℃ 1 min，进行 30 个循环。PCR 产物
取 5 μL 进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果并进行目的
条带的回收。
将纯化的目的 PCR 产物（HER2 基因胞外段）
与 pMD18-T 克隆载体连接，并转化至大肠杆菌
DH5α 感受态细胞中。随机挑选白色克隆扩大培养，
小量提取质粒，并进行酶切鉴定以挑选出含有目的
片段的阳性克隆。将该阳性克隆用 EcoR I、BamH I
进行双酶切，从凝胶电泳中回收酶切出的小片段，
并与经同样双酶切的 pET-30a 载体连接，转化至大
肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，挑选克隆进行酶切鉴
定，将鉴定为阳性的克隆命名为 pET30-HER2（Ex），
并送到 Invitrogen 公司进行测序鉴定。
1.2.3 HER2 胞外段在大肠杆菌中的诱导表达 将
重组表达质粒 pET30-HER2（Ex） 转化至大肠杆菌
BL21starTM（DE3）感受态细胞中，从平板上挑取
一个单克隆接种至 LB 培养基（含有卡那霉素 50
μg/mL）中，37℃摇床振荡培养至 OD600=0.8-1.0 ；将
培养物各分成两份，其中一份加入 IPTG 至终浓度为
1 mmol/L，另一份不加 IPTG，37℃摇床振荡培养 8 h。
按照 pET 系统操作手册的说明［4］，分别制备培养液
上清组分、周质腔组分、胞质可溶性组合和胞质不
可溶性包涵体组分进行 SDS-PAGE 分析，以确定目
的蛋白在大肠杆菌中的定位情况。
1.2.4 HER2 胞外段蛋白表达条件的优化 影响目
的蛋白在大肠杆菌中表达量的因素有诱导温度、诱
导物 IPTG 浓度、诱导起始菌体密度及诱导时间。
表达条件的优化采用每次改变其中一个影响因素，
其他条件固定的方法进行，以找出最佳的表达条
件。选取的诱导温度分别为 26℃、30℃和 37℃ ；
IPTG 浓度分别选用了 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0
mmol/L；起始菌体密度 OD600 分别达到 0.4、0.6、0.8、
1.0 和 2.0 时开始诱导 ；诱导时间分别选用了 4、6、
8、10 和 12 h。将不同诱导条件下获得的培养物各
取 1 mL，离心后沉淀用 50 μL PBS 重悬，然后加入
等体积的 2×SDS loading buffer，沸水浴中加热变性
5 min。取上清进行 SDS-PAGE 分析，观察在不同诱
导条件下目的蛋白的表达量变化。
1.2.5 HER2 胞外段蛋白的分离纯化 将重组克隆
接种至 1 L LB 培养基（含有卡那霉素 50 μg/mL）中，
37℃振荡培养至 OD600=1.0 时，加入 IPTG 至终浓度
为 0.1 mmol/L，继续振荡培养 4 h 后离心收集菌体。
将菌体沉淀重悬于 100 mL 20 mmol/L Tris-Cl 缓冲液
（pH7.5）中，超声波破菌。产物于 4℃，10 000×g
离心 10 min，弃上清，沉淀用 20 mmol/L Tris-Cl 缓
冲液洗涤2次。之后将沉淀重悬于binding buffer中（20
mmol/L 磷酸盐、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L 咪唑、
8 mol/L尿素）。将该蛋白样品经0.45 μm滤器过滤后，
经 Ni2+ 亲和层析柱进行纯化。操作步骤参照 HisTrap
HP 亲和层析柱的说明书进行，即首先用 binding
buffer 对层析柱平衡 5 体积，然后将样品过柱，用
binding buffer 洗涤层析柱 5-10 体积，最后用 elution
buffer（20 mmol/L 磷 酸 盐、500 mmol/L NaCl、500
mmol/L 咪唑、8 mol/L 尿素）将目的蛋白从层析柱上
洗脱。将纯化的目的蛋白进行 SDS-PAGE 分析，观
察目的蛋白的纯度。将目的蛋白用超滤管（Millipore
公司）进行浓缩后，用 BCA 蛋白定量试剂盒（Pierce
公司）测定蛋白浓度，计算目的蛋白的表达产量。
2 结果
2.1 HER2胞外段基因的克隆及重组表达载体的
建立
采用 RT-PCR 方法从高表达 HER2 基因的人乳
腺癌细胞系 SK-BR-3 中克隆得到了 HER2 基因的胞
外段，琼脂糖凝胶电泳结果显示在 1 000 bp 左右出
现一条特异性条带，与预期大小 924 bp 相符，并且
经测序证实，扩增得到的目的基因序列与 GenBank
中报道的 HER2 基因胞外段序列完全一致。将该目
的片段与表达载体 pET-30a（+）连接后，挑选出阳
性克隆进行 EcoR I、BamH I 双酶切鉴定，结果显示
同样在 1 000 bp 左右出现酶切条带，表明重组表达
载体 pET30-HER2（Ex）构建成功（图 1）。
2.2 HER2胞外段蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及
定位分析
将含有重组表达载体 pET30-HER2（Ex）的克
2012年第8期 91许银辉等 ：HER2 胞外段的克隆与原核表达
隆接种至 LB 培养基中进行培养，加入 IPTG 进行诱
导后经 SDS-PAGE 分析发现在 31 kD 和 43 kD 之间
出现目的条带，与目的蛋白预期大小（34 kD）相符，
而未经诱导的菌体无此条带。分别提取了培养液上
清组分、周质腔组分、胞质可溶性组分和胞质不可
溶包涵体组分进行了 SDS-PAGE 分析，结果（图 2）
表明目的蛋白主要以包涵体形式存在于大肠杆菌中。
26℃、30℃和 37℃进行诱导表达，之后分别提取胞
质可溶性组分和不可溶性包涵体组分进行 15% SDS-
PAGE 分析。结果 （图 3） 显示，在试验的诱导温
度下，HER2 胞外段蛋白均形成包涵体，因此，对
诱导温度的优化只观察对包涵体蛋白表达量的影
响。，将重组表达菌分别置于 26℃、30℃和 37℃进
行诱导表达后进行 15% SDS-PAGE 分析发现，不
同的诱导温度下目的蛋白的表达量无明显区别，因
此选择了大肠杆菌的常规培养温度 37℃进行诱导
表达。
图 1 HER2胞外段基因的克隆与重组质粒 pET30-
HER2（Ex）的限制性酶切分析
M. DNA 分子量标准 ；1. RT-PCR 产物（HER2 胞外段基因）；2. 重组质粒
pET30-HER2（Ex）；3. 重组质粒 pET30-HER2（Ex） EcoR I 和 BamH I 酶
切产物
M. 低分子量蛋白标准 ；1，3，5，7 分别为 IPTG 诱导前培养液上
清组分、周质腔组分、细胞质可溶性组分和细胞质不可溶性包涵
体组分 ；2，4，6，8 分别为 IPTG 诱导后培养液上清组分、周质腔
组分、细胞质可溶性组分和细胞质不可溶性包涵体组分 ；箭头所
指为目的蛋白（HER2 胞外段）
图 2 SDS-PAGE分析 HER2胞外段蛋白在大肠杆菌
各组分中的表达
2.3 HER2胞外段蛋白表达条件的优化
2.3.1 诱导温度的优化 诱导温度对于外源蛋白的
可溶性有很大影响，因此首先将含有重组表达载体
pET30-HER2（Ex）的转化菌分别置于 16℃、20℃、
M. 低分子量蛋白标准 ；1-3. 重组表达菌 BL21（DE3）/ pET30-
HER2（Ex）分别在 26℃、30℃和 37℃下诱导表达的大肠杆菌
总蛋白 ；箭头所指为目的蛋白（HER2 胞外段）
图 3 不同温度诱导表达 HER2胞外段蛋白的
SDS-PAGE分析
2.3.2 诱导物浓度的优化 接种含有重组表达载体
pET30-HER2（Ex）的转化菌，之后加入 IPTG 至终
浓度分别为 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mmol/L。
15% SDS-PAGE 结果 （图 4） 显示，不同的诱导物浓
度对目的蛋白的表达量影响也不大，因此选择最低
的诱导物浓度 0.1 mmol/L 的 IPTG。
2.3.3 诱导起始菌体密度的优化 接种含有重组表
达载体 pET30-HER2（Ex）的转化菌，37℃振荡培
养至 OD600 分别为 0.4、0.6、0.8、1.0、2.0，之后加
入 IPTG 进行诱导表达。15% SDS-PAGE 分析结果
（图 5）显示，随着起始菌体密度的增加，目的蛋白
的表达量也随着增加，当 OD600 达到 1.0 时，目的蛋
白的表达量开始增加不明显，因此选择诱导起始菌
体密度 OD600 =1.0。
2.3.4 诱导时间的优化 将含有重组表达载体
pET30-HER2（Ex）的转化菌分别诱导培养 4、6、8、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期92
10 和 12 h 后进行 15% SDS-PAGE 分析，结果如图 6
所示，不同的诱导时间对目的蛋白的表达量影响不
大，故选择诱导时间为 4 h。
综上所述，HER2 胞外段蛋白的最佳表达条件
为诱导起始菌体密度 OD600=1.0，诱导物 IPTG 浓度
为 0.1 mmol/L，37℃振荡培养 4 h。
2.4 HER2胞外段蛋白的分离纯化
由前期的定位分析可知，HER2 胞外段蛋白
主要以不可溶的包涵体形式存在于大肠杆菌胞质
中。因此，该蛋白的提取首先采用超声的方法进行
破菌，之后离心将上清中的可溶性蛋白去除，并用
Tris 缓冲液多次洗涤离心沉淀以进一步去除可溶性
蛋白，获得纯度较高的包涵体蛋白。目的蛋白在其
C-末端带有六聚组氨酸标签，因此其纯化方法主要
采用 Ni2+ 亲和层析方法。从图 7 可以看出，由于在
样品中含有 10 mmol/L 的咪唑，因此样品上柱后绝
大部分杂蛋白不与 Ni2+ 亲和层析柱结合。然后使用
binding buffer 对 Ni2+ 柱进行进一步洗涤，最后采用
elution buffer 将目的蛋白洗脱下来，经 SDS-PAGE 分
析发现除了目的蛋白条带外，几乎无杂蛋白条带出
现，表明目的蛋白得到成功纯化。纯化得到的目的
蛋白经超滤浓缩后用 BCA 方法测定其浓度，计算出
目的蛋白的产量，结果显示每升发酵液可获得 120
mg 的高纯度蛋白。
M. 低分子量蛋白标准 ；1-6. 重组表达菌 BL21（DE3）/ pET30-
HER2（Ex）分别在终浓度为 0. 1、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0
mmol/L 的 IPTG 诱导下表达的大肠杆菌总蛋白 ；箭头所指为目
的蛋白（HER2 胞外段）
图 4 不同 IPTG浓度诱导表达 HER2胞
外段蛋白的 SDS-PAGE分析
M. 低分子量蛋白标准 ；1-5. 重组表达菌 BL21（DE3）/
pET30-HER2（Ex）分别在起始菌体密度 OD600 达到 0.4、0.6、
0.8、1.0、2.0 时诱导表达的大肠杆菌总蛋白 ；箭头所指为目
的蛋白（HER2 胞外段）
图 5 不同起始菌体密度诱导表达 HER2胞外段蛋白
的 SDS-PAGE分析
M. 低分子量蛋白标准 ；1-5. 重组表达菌 BL21（DE3）/ pET30-HER2
（Ex）分别诱导 4、6、8、10 和 12 h 后表达的大肠杆菌总蛋白 ；箭
头所指为目的蛋白（HER2 胞外段）
图 6 不同诱导时间表达 HER2胞外段蛋白的
SDS-PAGE分析
M. 低分子量蛋白标准 ；1. 重组表达菌 BL21（DE3）/ pET30-HER2
（Ex）经超声破菌、离心后的上清组分 ；2. 重组表达菌 BL21（DE3）/
pET30-HER2（Ex）经超声破菌、离心后的沉淀组分（即包涵体组分）；
3. 包涵体蛋白过 HisTrap HP 亲和层析柱的穿透液 ；4. binding buffer 洗
脱下的杂蛋白 ；5-9. elution buffer 洗脱下的目的蛋白 ；箭头所指为目
的蛋白（HER2 胞外段）
图 7 Ni2+亲和层析纯化 HER2胞外段蛋白的
SDS-PAGE分析
2012年第8期 93许银辉等 ：HER2 胞外段的克隆与原核表达
3 讨论
HER2 受体与人类癌症的关系较密切，最突出
的一个例子就是在 25%-30% 的乳腺癌病人中均发
现有 HER2 基因扩增的现象并伴随着病人生存期的
缩短［5］。目前，针对 HER2 受体已经开发出了多种
靶向药物，其中最引人关注的是曲妥珠单克隆抗体
（trastuzumab，商品名为 Herceptin）。它可以特异性
的与 HER2 受体胞外段结合，从而阻断受体的二聚
化，并进而抑制一系列的细胞信号转导通路，最终
抑制细胞的生长与增殖［6］。Herceptin 于 1998 年被
美国 FDA 批准上市，用于 HER2 高表达的转移性
乳腺癌的治疗，取得了良好的临床治疗效果。本研
究同样选择了 HER2 受体胞外段（51-358 氨基酸区
域）进行原核表达，以期为下一步抗 HER2 单克隆
抗体的研制及噬菌体展示单链抗体库的筛选提供必
要的基础。除此之外，以 HER2 为靶点的肿瘤免疫
治疗近来也受到越来越多的关注。大量的试验研究
表明，在某些肿瘤病人体内确实存在针对 HER2 蛋
白的特异性免疫反应，如在一些乳腺癌病人血清中
已检测到抗 HER2 抗体，而且抗体的水平与 HER2
的过表达呈正相关［7］。在一些肿瘤患者体内还可检
测到 HER2 蛋白特异性的 CTL 反应［8］。研究显示，
在 HER2 受体胞外段中，可被 MHC-I 提呈并能诱
导出特异性 CTL 反应的抗原肽表位有 48-56 氨基酸
区域、106-114 氨基酸区域以及 369-377 氨基酸区
域［9］，而本研究所获得的 HER2 胞外段蛋白中就包
含其中的两个区域。因此，本研究不仅为下一步制
备抗 HER2 抗体提供了必要的条件，而且也为进一
步研究肿瘤疫苗奠定了基础。
原核表达系统具有操作便利、表达量高、成本
低等特点，因此在外源蛋白的表达上得到了广泛的
应用。本研究采用了 pET-30a 作为表达载体，该载
体不含有信号肽序列，因而目的蛋白不会分泌表达
进入培养液上清或大肠杆菌周质腔中。本研究中目
的蛋白以不可溶的包涵体形式存在，包涵体蛋白为
非正确折叠的蛋白，因而需要后续的变性、复性等
操作以使其形成正确的空间结构。尽管需要额外的
变性、复性操作，但包涵体蛋白同样具有表达量高、
易于纯化、获得的目的蛋白纯度高等优点。本研究
中 HER2 胞外段蛋白的表达量高达每升发酵液 120
mg 蛋白，而且只需一步简单的亲和层析纯化就可以
获得纯度高于 90% 的目的蛋白，大大简化了繁琐的
蛋白分离纯化过程。此外，本研究还对影响目的蛋
白产量的因素，包括诱导温度、诱导物浓度、诱导
起始菌体密度和诱导时间分别进行了优化，获得了
最佳的诱导表达条件，这也是本研究中 HER2 胞外
段蛋白获得高表达的原因之一。
4 结论
本研究从人乳腺癌细胞系 SK-BR-3 中克隆了
HER2 基因的胞外段 936 bp，将之插入到 pET-30a 中
成功构建了重组表达载体 pET30-HER2（Ex），并转
化至大肠杆菌 BL21（DE3）。当重组表达菌生长至
OD600=1.0 时，经 0.1 mmol/L 的 IPDG 在 37℃诱导 4 h，
表达出 34 kD 的 HER2 胞外段蛋白。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）