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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第11期
收稿日期 ：2013-05-15
基金项目 ：国家科技重大专项（2011ZX05024-004）
作者简介 ：王大威，博士，工程师，研究方向 ：微生物采油等三次采油技术研究 ；E-mail ：wangdw3@cnooc.com.cn
外源和内源微生物在营养剂激活过程中丰度变化及
对原油作用研究
王大威1，2  张健1，2  马挺3  齐义彬3
（1. 海洋石油高效开发国家重点实验室，北京 100027 ；2. 中海油研究总院，北京 100027 ；
3. 南开大学生命科学学院分子微生物学与技术教育部重点实验室，天津 300071）
摘 要 ： 旨在研究在油藏环境中，营养剂激活条件下内、外源微生物相互作用过程中的细菌群落和结构的变化，及其对微
生物降解原油能力的影响。利用中海油 NB35-2 油田 A18、B16 井产出液油水样，在地层条件下投放营养剂及外源菌进行富集培养后，
定时取样，样品用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术分析其丰度结构变化 ；同时结合原油黏度测定、四组分分析，分析营养剂激活
过程中外源、内源微生物对原油作用变化，研究营养剂的加入对激活原油降解微生物的作用。通过对内源和外源微生物激活前后
DGGE 条带的数量和亮度变化分析表明，油藏环境中的细菌在种类和数量上并不丰富，激活剂的加入改变了菌群原有的贫营养环境，
从而使一些因营养缺乏生长受抑制细菌得以大量繁殖，菌群结构发生变化。结果显示，单独添加外源菌种不能有效激活内源菌种，
加入营养剂后，内源菌种的数量和种类明显增加，同时外源菌和内源菌复配后对原油的降解作用也明显增强。
关键词 ： 内源细菌群落 选择性激活 变性梯度凝胶电泳 稠油降解能力
Study of Changes in Abundance and Degradation Crude Oil Capacity
of Endogenous Bacteria and Andexogenous Bacteria Activation in
Oilfield Under Injecting Activation Agent Conditions
Wang Dawei1，2 Zhang Jian1，2 Ma Ting3 Qi Yibin3
（1. State Key Laboratory of Offshore Oil Exploitation，Beijing 100027 ；2. China National Offshore Oil Corporation（CNOOC）Research
Institute，Beijing 100027 ；3. Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology，Ministry of Education，College of Life Science，
Nankai University，Tianjin 300071）
Abstract:  It was study the structure change of exogenous and indigenous microbial population during activation of stratal microflora
under injecting activation agent conditions, and the effect on the microbial degradation crude oil capacity. The water sample was from A18、
B16 well produced water in NB35-2 Oilfield. The bacteria in the water sample under injecting activation agent conditions was activated , and
samples at different time intervals were collected. These samples were analyzed by denature gradient gel electrophoresis（DGGE）, and
the effect of addition of activation agent on microbial degradation crude oil capacity were studied through determination of viscosity and four
fractions contents analysis of crude oil. Based on the analysis of the number and lightness of DGGE bands, we studied the change of the microbial
community diversity activation of stratal bacteria. The species number and total quantity of dominant microbial population were not abundant
under oil reservoir conditions. After injecting activation agent, some bacteria grew and reproduced quickly along with the enhancement of
nutrition condition, and the structure of dominant microbial population changed. Exogenous bacteria alone can not effectively activate endogenous
bacteria, and after adding nutrients, the species number and total quantity of endogenous bacteria significantly increased, while the performance
of degradation to crude oil of exogenous bacteria and endogenous bacteria was significantly enhanced.
Key words:  Endogenous bacterial community Selective activation Denature gradient gel electrophoresis Degradation crude oil
capacity
2013年第11期 165王大威等 ：外源和内源微生物在营养剂激活过程中丰度变化及对原油作用研究
油藏环境经过长期水驱后，含有种类丰富的内
源微生物资源，可形成较为稳定的微生物群落，这
其中存在很多对提高原油采收率具有明显作用的菌
种，因此可通过应用针对性激活剂配方，激活内源
微生物，通过微生物降解原油和代谢可降低原油黏
度的产物，降低原油黏度，增加原油流动性，进而
提高原油采收率。针对海上稠油油田中高含水期、
高剩余油饱和度的现状，基于微生物对稠油中的重
组分（胶质、沥青质）降解和表面活性剂可提升微
生物降解稠油能力的原理，研究以微生物降解稠油
为主兼顾生物表面活性剂降黏的稠油微生物单井吞
吐技术。该技术的核心是从不同方面降低稠油黏度，
增加水油流度比，使微生物采油体系针对渤海油田
实际特点，以降解胶质等重组分为核心，配合生物
表面活性剂降黏以及提升微生物降解稠油的速率，
加强稠油降解程度，加快稠油降解速度。但油藏内
部为黑箱环境，如何研究外源菌在地层中生长代谢
受到的影响，包括内源菌、矿化度、pH 值、高温、
缺氧等特点的极端环境，对评估菌种在地层中发挥
作用十分重要。
用传统培养方法所获得的微生物生态信息远
不能反映油藏环境中的实际情况。影响内源微生物
驱油技术深入发展的主要难点是缺乏有效的油藏微
生物群落结构分析及动态变化的监测方法［1，2］。近
年来基因组学和现代分子技术的成熟，逐渐渗透到
有关生命科学的整个领域，也为微生物生态学提供
了新的研究方法和机遇。自 1985 年 Pace 等以核酸
测序技术研究微生物的生态和进化问题以来，对
微生物的多样性研究进入了一个新的阶段，并逐
步发展形成了成型的微生物分子生态学（Molecular
Ecological Technology of Microorganisms）方法和技术。
变性梯度凝胶电泳（Denature Gradient Gel Electroph-
oresis，DGGE）是由 Fischer 和 Lerman 于 1979 年最
先提出的用于检测 DNA 突变的电泳技术，是一种通
过分离微生物基因组 DNA 来研究环境样品中微生物
群落的多样性及物种丰度的一种分子指纹技术［3］，
1993 年 Muzyers 等首次将 DGGE 技术应用于分子微
生物学研究领域，并证实了这种技术在揭示自然界
微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特
的优越性。近年来运用分子指纹技术对油藏微生物
群落的研究已有不少［4-10］，但少有文献报道激活剂
和外源微生物的加入对内源微生物激活的影响。
本研究首先从 NB35-2 油田地层水中分离到两
株稠油降解菌 Y-1、Y-2，同时引入产表面活性剂外
源菌 K-1、K-2，研究模拟 NB35-2 油田的 A18、B16
井油藏条件下，利用 DGGE 技术与原油黏度及四组
分分析方法结合探讨不同激活条件下油藏内微生物
群落和结构的变化，及其对降解原油能力的影响，
旨在分析激活剂、油藏条件对内源菌和外源菌发挥
降解作用的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
地层水、原油样品 ：NB35-2 油田 A18 井原油，
黏 度 523.3 mPa·s， 沥 青 7.79%， 胶 质 20.25% ；
NB35-2 油 田 B16 井， 地 层 黏 度 1 094 mPa·s， 沥
青 6.92%，胶质 22.01%，均取自中海油渤海油田
NB35-2 油田。
培养基（g/L）：玉米粉 1，蔗糖 5，NaNH4HPO4
7.35，Na2HPO4 0.25，KH2PO4 0.75，MgSO4 0.3，
CaCl2 0.01，FeSO4 0.02。
1.2 方法
1.2.1 菌种、营养剂的投放和水样的富集培养 通
过只添加激活剂、只添加外源菌以及同时添加激活
剂与外源菌的 3 组配方对 A18 和 B16 水样中内源微
生物进行激活，分装于经无菌处理的 200 mL 三角瓶
中，模拟地层条件，抽取空气，置于地层温度 55℃
恒温箱内培养 7 d 后，进行 DNA 的提取与纯化。根
据各样品的 DGGE 图谱分析激活前后微生物群落结
构的变化。
1.2.2 基因组 DNA 的提取与纯化 原始水样中菌体
用孔径为 0.22 μm 的混合纤维素酯滤膜抽滤 1 L 水样
来收集，经培养后的菌体直接取 10 mL 培养液高速
离心获得。具体操作步骤与文献［11］相同。基因
组 DNA 提取与纯化使用北京天为时代生物技术公司
的 DNA 纯化试剂盒，按照操作说明进行。
1.2.3 16S rDNA 的 PCR 扩增 细菌扩增其 V9 区序
列，因要进行 DGGE 分析，故此处的引物带 GC 夹子，
细 菌 V9 区 ：1406r-GC ：5-CGC CCG CCG CGC CCC
GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC ACG GGC
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期166
GGT GTG TAC-3 ；1055f ：5-ATG GCT GTC GTC
AGC T-3。
PCR 反应体系：Premix Taq 酶 12.5 μL，引物 1406r-
GC 0.3 μL，引物 1055f 0.3 μL，模板 1 μL，ddH2O 加
至总体系 25 μL。
PCR 程序 ：94℃ 5 min ；94℃ 45 s，60℃ 45 s，
72℃ 90 s，3 个循环；94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 90 s，
3 个循环；94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 90 s，3 个循环；
94 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，3 个 循 环 ；94 ℃
45 s，52℃ 45 s，72℃ 90 s，3 个循环； 94℃ 45 s，55℃
45 s，72℃ 90 s，15 个循环 ；72℃ 10 min ；4℃ 48 h。
琼脂糖凝胶电泳检测，条带在 400-500 bp 左右。
1.2.4 16S rDNA 序 列 的 DGGE 分 析 将 纯 化 好 的
PCR 样品加入制备好的变性胶中，进行电泳分离并
YLN22000 凝胶影像分析系统进行分析，观察每个样
品的电泳图谱并拍照。
1.2.5 原 油 黏 度 测 定 原 油 分 离 后 脱 水， 使 用
BROOK FIELD VISCOMETER LVDV-II+Pro 提桶式旋
转黏度计测定黏度。
1.2.6 原油四组分分析 试验方法见《气相色谱质
谱法测定沉积物和原油中生物标志物（GB/T18606-
2001）》。
2 结果
2.1 样品的DGGE条带
采出液水样中细菌 DGGE 电泳图谱（图 1）中
每一条带代表一种微生物，各条带经回收、克隆、
测序后，在 GenBank 数据库中比对，得到各条带的
最相似种属信息（表 1），不同细菌种类和丰度变化
见图 2。图 1、图 2 显示，A18 井地层水中的细菌种
类较多，检测到的细菌包括多个种属，多种类别，
这是因为 A18 井所处区块由于经过长期的注水和注
聚合物，引入了更多的外源菌种，并形成了稳定的
微生物群落。
A18 地层水无论是只添加营养剂还是只添加外
源菌或者二者同时添加，最后的优势菌群基本相同，
外源菌基本得到保留或增殖，证明外源菌可以较好
的与地层中的内源菌配伍。但不同体系最终对原油
的作用效果差异却比较大 ：在只添加培养基的情况
下（图 1 泳道 2）可以激活地层水中的油杆菌，条
带明显比只添加外源菌多且亮度更高，说明营养剂
的添加改变了菌群原有的贫营养环境，从而使一些
因营养缺乏生长受抑制的细菌得以大量繁殖，菌群
结构迅速发生变化，同时细菌或通过降解或产生降
黏物质对原油发生作用 ；但在只添加外源菌的情况
下（图 1 泳道 3）未出现类似条带，可能是在只添
加外源菌的情况下，原始的微生物群落稳态被打破，
外源菌由于数量的原因在与内源菌争夺营养方面处
于优势地位，能够利用加入时携带的营养剂进行生
存，但由于营养有限，生长同样受到抑制。同时其
代谢产物及所余营养物质不足以激活地层水中的内
源菌，由于有产表面活性剂菌代谢的表面活性剂的
存在，可乳化原油，提升了降解菌群的降解作用，
因而其对原油效果较单独加入营养剂有明显提升 ；
在同时加无机盐营养和外源菌的情况下（图 1 泳道
4），样品对原油的作用效果最好，条带明显增加，
这是因为外源菌数量较多，并不断地利用培养基中
的营养得以强化，而它们及所余营养物质又能进一
步的激活地层水中的功能菌，两者共同作用，使得
最终结果呈现最佳状态。
相比于 A18 井，B16 井水样中细菌的种类相对
较少，这是由于 B18 井一直没有开展注水和注聚合
物施工，无外源菌的引入，地层微生物群落仍保持
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 ：A18 地 层 水 ；2 ：100 mL A18 地 层 水 +2 mL 培 养 基 +2% 原 油 ；3 ：100
mL A18 地层水 +5 mL Y-1+5 mL Y-2+10 mL K-1+10 mL K-2+2% 原油 ；4 ：100
mL A18 地层水 +5 mL Y-1+5 mL Y-2+10 mL K-1+10 mL K-2+2% 原油 +2 mL
培养基 ；5 ：B16 地层水 ；6 ：100 mL B16 地层水 +2 mL 培养基 +2% 原油 ；7 ：
100 mL B16 地层水 +5 mL Y-1+5 mL Y-2+10 mL K-1+10 mL K-2+2% 原油 ；8 ：
100 mL B16 地层水 +5 mL Y-1+5 mL Y-2+10 mL K-1+10 mL K-2+2% 原油 +2
mL 培养基 ；9 ：单菌 K-1（铜绿假单胞菌）；10 ：单菌 K-2（枯草芽孢杆菌）；
11 ：单菌 Y-1（地衣芽孢杆菌）；12 ：单菌 Y-2（白地芽孢杆菌）。图中 25 个
条带，每一条带代表一种微生物
图 1 16S rDNA 扩增产物的 DGGE 电泳图
2013年第11期 167王大威等 ：外源和内源微生物在营养剂激活过程中丰度变化及对原油作用研究
原始状态。但 B16 井地层水激活后情况与 A18 类似，
菌种类型和丰度明显增加，但条带比 A18 井少，作
用原油的结果相同，均是培养基与外源菌同时添加
的情况优于只添加培养基的效果，只添加外源菌的
作用效果最差。
表 1 各条带所代表的微生物种属信息
样品 条带 * 最相似种属 相似性（%）
A18 水样 1 Petrobacter sp. 99
2 Pseudomonas sp. 96
3 Rhodocyclaceae bacterium 96
4 Azospira sp. 92
5 Pseudomonas stutzeri 99
6 Steroidobacter sp. 89
7 Brachymonas sp. 99
8 Uncultured bacterium 99
9 PHaeospirillum sp. 90
A18 水样培养后样品 10 Petrobacter sp. 99
11 Uncultured bacterium 99
12 Petrobacter sp. 99
13 Petrobacter sp. 99
14 Petrobacter sp. 99
15 Uncultured bacterium 95
B16 水样 16 Uncultured bacterium 93
17 Brachymonas sp. 99
18 Petrobacter sp. 99
B16 水样培养后样品 19 Petrobacter sp. 99
20 Uncultured bacterium 99
21 Brachymonas sp. 99
外源单菌 22 Pseudomonas aeruginosa K-1 99
23 Bacillus subtilis K-2 99
24 Bacillus licheniformis Y-1 99
25 Geobacillus pallidus Y-2 99
* 条带中编号与图 1 中对应
2.2 作用前后原油黏度和四组分变化
从图 3 可看出，向地层水中仅加入培养基，可
激活内源微生物，产生一定量乳化剂乳化原油，但
占丰度较高的内源菌本身对原油作用程度有限，难
以有效降解原油中的重质组分，不能大幅度降低原
油黏度，黏度降幅仅为 7.9% ；在地层水中仅加入外
源菌，由于其中含有产表面活性剂菌产生的表面活
性剂可明显降低原油黏度，同时提升原油降解菌的
降解作用，进而改变原油品质，提高原油流动性，
黏度大幅下降，降幅为 66.5% ；在地层水中同时加
入外源菌、营养液可进一步降低原油黏度，黏度降
幅为 75.0%，说明营养液的加入对激活内源菌、提
高外源菌活性具有明显的作用。
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10
20
30
40
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Uncultured bacterium Pseudomonas sp. Rhodocyclaceae bacterium
Uncultured bacterium Uncultured bacterium Bacillus subtilis
Azospira sp. Bacillus licheniformis Geobacillus pallidus
Pseudomonas stutzeri Steroidobacter sp. Uncultured bacterium
Pseudomonas aeruginosa Uncultured bacterium Phaeospirillum sp.
Petrobacter sp.
图 2 激活前后细菌种类及数量变化
1146
1055
384
286
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
ൠቲ≤ ൠቲ≤+ษޫส ൠቲ≤+ཆⓀ㧼 ൠቲ≤+ཆⓀ㧼+ษޫส
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图 3 作用前后原油黏度变化
从图 4 可看出，微生物作用稠油后，与空白相
比较各组分的相对含量均发生了变化，轻质组分如
饱和烃、芳香烃相对含量均有不同程度的上升，重
质组分胶质、沥青质相对含量降低，其中地层水 +
外源菌能使饱和烃相对含量上升 6.9%，芳香烃相对
含量上升 10.8%，胶质相对含量下降 13.8%，沥青
质相对含量下降 1.8% ；地层水 + 外源菌 + 培养基能
使饱和烃相对含量上升 6.9%，芳香烃相对含量上升
14.6%，胶质相对含量下降 23.7%，沥青质相对含量
下降 23.6%，表明稠油经微生物作用后，其化学组
分发生了一定程度的变化，采油菌种对原油具有明
显的降解，这是引起原油黏度降低，流动性增强，
采收率提高的主要原因之一。
3 讨论
一直以来，外源和内源微生物采油是微生物采
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期168
油领域两个最为重要的研究方向，经过长期的室内
研究和现场试验显示，单纯依靠其中任何一种方法
都不能取得较为满意的结果，一方面由于即使是从
目标油藏分离得到的外源菌由于营养、与其他菌种
配伍性问题也不能完全在地层内成为优势菌种，进
而影响其提高原油采收率的作用 ；另一方面，地层
内优势菌种由于其自身在微生物采油中的效能较为
低下，同时地层内营养不足，调控方法滞后，对提
高采收率帮助亦不大。因此如何通过人工手段调控
内源菌和外源菌在激活剂注入下，协同作用，提高
原油采收率是微生物采油目前亟待解决的问题。
油藏微生物群落的结构和功能的多样性信息，
其中包括微生物在基因层次上的多样性和种类组成
上的多样性。通过研究油藏微生物的多样性来确定
油藏中微生物的区系组成，并根据种群的动态变化
探索该变化与原油采收率变化的关系［3］。本试验通
过 DGGE 检测结合原油黏度及四组分分析研究在油
藏环境中，营养剂激活条件下内、外源微生物相互
作用过程中的细菌群落和结构的变化，及其对微生
物降解原油能力的影响。显示水驱油藏地层水中存
在大量内源菌群，并形成了相对稳定的菌落结构，
投加营养剂对其具有一定激活作用，可明显增加其
中可降解原油菌群的种类和丰度，提高微生物利用
原油作为唯一碳源的生存能力，但其降低原油黏度、
改变原油组分能力有限，无法显著改善原油物性 ；
加入外源菌群后，可借助培养时剩余的营养剂继续
生长，但在营养争夺过程中明显抑制了地层中内源
菌的生长，同时由于其中含有产表面活性剂菌种产
生的表面活性剂，因此对原油物性的改变有显著提
升 ；在同时加营养剂和外源菌的情况下，体系对原
油的作用效果最好，同时条带明显增加，说明外源
菌数量较多，并不断利用营养剂强化，而所余营养
物质又能进一步的激活地层水中的功能菌，同时产
表面活性剂菌产生的表面活性剂对原油降解菌的降
解具有明显的提升作用，三者结合使得最终结果呈
现最佳状态。结合微生物分子生态学技术及现有油
藏研究手段，在认清采油菌种、油藏条件、激活剂
三者关系基础上，通过注入不同的外源菌和激活剂，
检测内、外源菌生长过程中类群多样性的动态变化，
可以分析激活剂的激活作用，为进一步优化激活剂
配方提供依据，有针对性的改善驱油体系性能，做
到有的放矢。
类似的微生物分子生态学方法已经在微生物采
油研究中得到应用。胜利油田河口采油厂罗 801 区
块在实施空气辅助微生物驱的基础上，在 2004 年应
用 T-RFLP 技术对注入功能菌在油藏内的丰度和动
态变化进行了监测。监测结果表明，罗 01 区块经过
连续多年的微生物注入，注入功能菌已经成为该区
块油藏内的优势菌，相对含量达到 50%，形成了稳
定的油藏生物场。该生物场的形成改善了油藏的生
物环境，对进一步提高水驱开发效果起到了良好的
作用［12］。胜利油田运用 PCR-DGGE 和 T-RFLP 分子
生态学技术对胜利油田单 12 块注入水和产出水中的
微生物群落进行了研究。DGGE 分析结果表明，单
12 区块油井产出水中检测到的条带数明显多于注入
水中的条带数，一方面说明油藏内源微生物群落的
丰富多样性，另一方面说明激活剂的注入激活了油
藏内源微生物群落 ；T-RFLP 分析结果表明，单 12
块油藏中主要存在脱硫弧菌、假单胞菌、不动杆菌
和梭菌等细菌群落，这些均为采油有益菌类。这从
分子生态学的角度更准确地掌握了油藏微生物生态
变化规律，为内源微生物驱油方案的优化和驱油效
果的提高起到跟踪指导作用［13］。
4 结论
结合 DGGE、原油黏度测定、四组分分析对目
标油藏条件下，激活剂、外源菌投放后对原油黏度
和采收率的影响，结果显示两种组分的加入及对油
藏内源微生物的激活作用对改善原油黏度和提高采
收率具有显著效果，DGGE 技术作为一种微生物生
44.5
21.3
23.2
11
44.9
22 23
10.8
47.6
23.6
20
10.2
47.6
24.4
17.8
8.4
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
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图 4 作用前后原油四组分变化
2013年第11期 169王大威等 ：外源和内源微生物在营养剂激活过程中丰度变化及对原油作用研究
态结构、丰度的检测手段，具有快速、灵敏的特点，
结合现场实际条件，其应用对今后微生物采油中培
养基优化、菌种筛选、配伍性研究、现场跟踪监测
具有重要指导意义。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）