全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期
我国是乙肝高发区，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）
携带率为 7.18%，慢性乙型肝炎病毒感染者约 9 300
万例［1］，每年由于 HBV 引起的肝硬化和肝癌造成
263 000 人死亡［2］。HBV 感染与原发性肝癌之间存在
着密切关系，但由于缺乏有效的体外病毒感染和复
制模型系统，乙肝及相关的原发性肝癌的基础研究
和临床研究进展缓慢［3，4］。目前常用的 HBV 细胞模
型 HepG2.2.15 细胞系，由于其 HBV DNA 已稳定地
整合入肝细胞的基因组并持续表达，这种静态结果
无法反映病毒的天然感染过程，在表达量和表达时
间上不可调控，使得基因功能的研究产生了很大的
收稿日期 ：2012-07-17
基金项目 ：“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项（2008ZX10002-002），国家自然科学基金项目（30901315）
作者简介 ：白荷露，女，硕士研究生，研究方向 ：感染与免疫学 ；E-mail ：luthienbai@yahoo.cn
通讯作者 ：朱乃硕，男，教授，博士生导师，研究方向 ：感染与分子免疫学 ；E-mail ：nzhu@fudan.edu.cn
乙肝病毒 X 基因可调控表达细胞模型的构建
白荷露  刘蕊  朱乃硕
（复旦大学生命科学学院 微生物学与微生物工程系，上海 200433）
摘 要 ： 利用四环素诱导型慢病毒系统（Lentil-XTM Tet-On Advanced Inducible Expression System）构建了含有乙肝病毒 X 基
因（HBx）的可诱导表达载体质粒，利用慢病毒包装细胞系 HEK293T 细胞分别获得含有调控元件 rt-TA 和 HBx 基因的病毒颗粒，
滴度达到 108 LPs/mL。将两种病毒先后感染 HepG2 肝癌细胞系，分别利用 G418 和 Puromycin 抗生素筛选获得整合有 HBx 基因的
稳定细胞株。在体系中加入 Dox 时，应用 RT-PCR 和 Western blot 方法验证了 HBx 基因的可诱导表达。可诱导表达细胞模型构建成
功，为进一步研究 HBx 基因在对宿主感染致病和免疫耐受中的作用提供了一种较理想的试验模型。
关键词 ： 乙型肝炎病毒基因 慢病毒表达载体 四环素调控 可诱导表达
Cell Model Construction of Regulated Hepatitis B
Virus X Gene Expression
Bai Helu Liu Rui Zhu Naishuo
（Department of Microbiology and Microbial Biotechnology，School of Life Science，Fudan University，Shanghai 200433）
Abstract:  An HBx inducible expression plasmid carrier was constructed by Lentil-XTM Tet-On Advanced Inducible Expression System,
and rt-TA gene virus particles and HBx gene virus particles were synthesized by lentiviral packing cell line HEK293T cells, with the titer
reaching 108 LPs/mL. When HepG2 cell lines were infected by the two virus particles and selected by G418 and puromycin antibiotics, stable
cell line with HBx gene could be constructed. After adding Dox into the stable cell line, the inducible expression of HBx gene could be proved by
RT-PCR and Western blot. Our study provides an ideal experiment model for further research on the roles of HBx in HBV infection and the host
immune tolerance.
Key words:  Hepatitis B virus Lentiviral expression system Tetracycline regulation Inducible expression
局限。建立适合的 HBV 感染模型对于探索其感染机
制，寻找有效的防治方法及开展抗 HBV 药物的筛选
都具有重要的意义［5-7］。因此，我们选用受四环素调
控的 Tet-On 慢病毒系统来实现乙肝病毒 X 基因（以
下简称 HBx 基因）的可调控表达［8］，并通过施与诱
导剂的时间依赖性进行精确转录和翻译，从而模拟
HBV 天然感染状态以准确获得靶基因的功能分析。
1 材料与方法
1.1 材料
HBx 基因来源于质粒 H85-T，该质粒为本实验
室构建，含有 C 基因型，adr 亚型的 HBV 病毒 1.2
2013年第2期 141白荷露等 ：乙肝病毒 X 基因可调控表达细胞模型的构建
倍基因组序列。菌株 E. coli DH5α 购自百泰克，人
肝癌细胞株 HepG2 购自 ATCC 细胞库。四环素诱
导 型 慢 病 毒 表 达 系 统（Lentil-XTM Tet-On Advanced
Inducible Expression System， 包 括 调 控 质 粒 pLVX-
Tet-On-Advanced 和表达质粒 pLVX-Tight-Puro），病
毒滴度测定试剂盒（Lentil-XTM p24 Rapid Titer Kit）
购自 Clontech 公司。PrimerStar 高保真聚合酶，EcoR I、
Not I 限制性内切酶，T4 连接酶，逆转录试剂盒购自
TaKaRa 公司。Taq DNA 聚合酶和 dNTPs 购自申能博
彩公司。质粒抽提试剂盒，胶回收试剂盒，PCR 产
物纯化试剂盒购自 Axygen 公司。强力霉素，嘌呤霉
素，Polybrene 购自 Sigma 公司，G418 购自 Gibco 公司。
鼠抗 HBxAg 单抗购自 Abcam 公司，HRP 标记的羊
抗鼠 IgG 多抗、FITC 标记的羊抗鼠 IgG 多抗、鼠抗
GAPDH 单克隆抗体购自上海康成生物公司。引物由
上海英骏生物技术有限公司合成，测序由上海博尚
生物技术有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 PCR 扩 增 HBx 基 因 片 段 HBx 基 因 序 列 共
465 bp。根据实验室已构建的含有 C 基因型，adr 亚
型的 HBV1.2 倍基因组序列的 H85-T 质粒，设计 X
基因引物，由上海英骏生物技术有限公司合成。
乙肝病毒 X 基因扩增引物选用 Not I 和 EcoR I 酶切
位点，引物序列为 XF ：5-ATTTGCGGCCGCATGGC-
TGCTAGGGTGT3，XR：5-CCGGAATTCTTAGGCAG-
AGGTGAAAAAGTTG-3。
应用 PrimerStar 高保真聚合酶扩增 HBx 基因，
PCR 反应条件为 ：98℃ 3 min ；98℃ 30 s，57℃ 40 s，
72℃ 40 s，35 个循环 ；72℃延伸 10 min。采用切胶
回收试剂盒回收 PCR 扩增条带。
1.2.2 HBx 基因慢病毒表达载体的构建 将 HBx 基
因扩增回收产物和 pLVX-Tight-Puro 载体分别用限制
性内切酶 Not I 和 EcoR I 双酶切后纯化回收，T4 连
接酶连接过夜，转化 E.coli DH5α 感受态，氨苄青
霉素筛选培养，挑取阳性克隆扩增后提取质粒进行
PCR，双酶切和 DNA 测序验证。
1.2.3 慢病毒的制备和滴度测定 在 100 mm 的细胞
培养皿中接种 4×106-5×106 HEK293T 细胞，培养
过夜使细胞密度达到 80% 左右，将 3 μg 构建的表达
载体质粒与 15 μL 的慢病毒包装质粒混合物混合后，
应用试剂盒中的磷酸钙转染试剂转染到 HEK 293T
包装细胞系中，8 h 后更换新鲜培养基，48 h 后收集
培养上清，获得包装好的病毒颗粒，离心后分装冻存。
采用病毒滴度测定试剂盒测定病毒 P24 含量
（P24 为 HIV 核心蛋白，其氨基酸序列高度保守，常
用于病毒检测），计算病毒的滴度。将收集的病毒上
清液稀释 100 倍后，与梯度稀释的标准品一起加入
包被有 P24 捕获抗体的 96 微孔板中，依次加入生
物素标记的 P24 抗体，HRP 标记的链霉亲和素，最
终加入显色液显色。测定 450 nm 吸光值（Spectrum
M5 微孔板检测系统，Molecular Device 公司），根据
标准曲线换算 P24 的量（单位为 pg/mL），计算病毒
的滴度。换算公式为 1 ng ≈ 1.25×107 LPs（LP 表示
病毒颗粒数量）。
1.2.4 稳定转染的 HBx 基因的 HepG2 细胞系的构建
和鉴定 将 HepG2 细胞以 2×105 的密度接种于 6 孔
板中，含有四环素调控元件 rt-TA 的病毒感染细胞，
1 200 g 离心 90 min 可提高感染效率。感染 8 h 后换
液用 G418（600 μg/mL）筛选，7-8 d 筛选稳定后扩
大培养，再用含有 HBx 基因的病毒感染，8 h 后换
液用 Puromycin（0.5 μg/mL）筛选，3-4 d 筛选稳定
后扩大培养，获得稳定细胞株 HepG2-HBx（reg）。
提取 HepG2-HBx（reg）细胞基因组 DNA，以
根据载体序列设计的引物进行 PCR 扩增鉴定，四环
素调控元件 rt-TA 序列验证引物 ：upper 5-ACAAGG-
AAACTCGCTCAAA-3，down 5-GGCATAGAATCGG-
TGGTAG-3。乙肝病毒 X 基因重组慢病毒质粒的序
列验证引物 ：upper 5-TAGTGAACCGTCAGATCG-3，
down 5-CAGACTGCCTTGGGAAAA-3。 反 应 条 件 ：
94℃ 3 min ；94℃ 30 s，57℃ 40 s，72℃ 40 s，35 个
循环 ；72℃延伸 10 min。1% 琼脂糖凝胶电泳。
1.2.5 反 向 PCR 鉴 定 HBx 基 因 及 调 控 基 因 的 整
合 我 们 选 用 EcoR I 酶 对 细 胞 基 因 组 进 行 酶 解，
pLVX-Tight-Puro-HBx 和 pLVX-Tet-On-Advanced 质粒
均含有 EcoR I 的酶切位点，分别在靠近慢病毒质粒
的 5 LTR 区和靠近 EcoR I 区分别设计两对上下游
引物。pLVX-Tight-Puro-HBx 第一对引物 ：pEH125 ：
5-TGTACTAGGAGGCTGTAGG-3 ；pEH119 ：5-GA-
TCTTTGTACTAGGAGGCT-3。pLVX-Tet-On-Advanced
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期142
第 一 对 引 物 ：ToE112 ：5-ATGCCCTTGACGACTTT-
G-3 ；ToE41 ：5-ACAGCTAAAGTGCGAAAG-3。
pLVX-Tight-Puro-HBx 和 pLVX-Tet-On-Advanced 第二
对 引 物 ：pEH232 ：5-TTGTCTTCTTTGGGAGTG-3 ；
pEH287 ：5-TCTGCTAATCAGGGAAGTA-3。
选 用 EcoR I 酶 对 细 胞 基 因 组 总 DNA 充 分 酶
解，50 μL 酶切体系中含有 1 μg 基因组和 5 U 限制
性内切酶，37℃酶切 5 h。酶切片段纯化后，溶于
30 μL 无菌水中。将 30 μL 溶解产品于 400 μL 自连
接体系中 16℃连接过夜。连接产品经纯化后溶于
30 μL 无菌水中。半巢式 PCR 一扩的 PCR 引物分
别为 pEH125/pEH119，ToE112/ToE41，PCR 二扩的
引物为 pEH232/pEH287。PCR 反应条件为 ：94℃ 5
min ；94℃ 30 s，57℃ 40 s，72℃ 60 s，35 个循环 ；
72℃延伸 10 min。PCR 产物经凝胶回收后连接到
pMD19-T 载体上，转化大肠杆菌 E.coli DH5α 感受态
细胞，筛选重组质粒后测序克隆片段。
1.2.6 HBx 基因可诱导表达的鉴定 将筛选稳定的
HepG2-HBx（reg）细胞均分为两份，一份加 Dox（1.0
mg/mL）诱导培养，一份不加 Dox（0 mg/mL）培养，
48 h 后收集细胞。
1.2.6.1 RT-PCR 鉴 定 RNA 的 表 达 提 取 细 胞 总
RNA，DNase I 处理后，逆转录为 cDNA，以 HBx 基
因的特异性引物进行 PCR 鉴定，引物为最初基因扩
增的引物，程序同 DNA 鉴定。β-actin 内参引物序列：
F1379 ：5-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3 ；R1663 ：
5-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3。
1.2.6.2 Western blot 鉴 定 HBx 蛋 白 的 表 达 利 用
RIPA 蛋 白 抽 提 液 提 取 细 胞 内 总 蛋 白， 经 过 SDS-
PAGE 电泳后，恒流 300 mA 1 h 电转移到硝酸纤维
素膜上，转膜封闭后，依次加入鼠抗 HBxAg 单抗，
HRP 标记抗 IgG 多抗孵育，NBT/ BCIP 底物显色，
观察蛋白的表达情况。
1.2.7 细胞免疫荧光试验 将筛选稳定的 HepG2-
HBx（reg）细胞以 105 接种于 12 孔板，置于细胞培
养箱中培养过夜。细胞分为 4 组，每组 3 个重复孔，
分组情况如下 ：
自发荧光对照组 ：不加一抗和二抗（都用含 1%
BSA 的 PBS 代替）；空白对照组 ：不加一抗（用含
1% BSA 的 PBS 代替），直接加二抗；未诱导试验组：
未加 Dox（0 mg/mL），加一抗，加二抗；诱导试验组：
加Dox（1.0 mg/mL），加一抗，加二抗。
待细胞已基本铺满盖玻片时，用不完全培养基
继续培养 12 h 后进行细胞免疫荧光试验，以排除小
牛血清中蛋白对试验的影响。
将细胞用预冷的丙酮室温固定于细胞板中，封
闭 2 h 后，在细胞孔内滴入鼠抗 HBxAg 单抗，4℃湿
盒内孵育过夜，随后加入 FITC 标记的羊抗鼠 IgG 多
抗室温孵育 30 min，洗净后于荧光显微镜下观察绿
色荧光情况。
2 结果
2.1 PCR扩增HBx基因片段
HBx 基因大小为 465 bp，PCR 扩增 HBx 基因产
物经琼脂糖凝胶电泳后结果（图 1）显示，其基因
片段大小与预期的相符，表明已成功获取 HBx 基因
片段。
1，2 ：X 基因扩增产物 ；3 ：阴性对照
图 1 PCR 扩增 X 基因片段
1 2 3M
500 465
bpbp
重组质粒 pLVX-Tight-Puro-HBx 经 PCR 扩增验
证，扩增的条带大小相符 ；经限制性内切酶 Not I 和
EcoR I 双酶切验证，酶切条带与目的基因大小相符
（图 2）。
图 2 pLVX-X 基因重组质粒 PCR 及酶切
M ：DNA Marker DL2000 ；1 ：重组质粒 PCR 验证 ；2 ：重组质粒酶切验证
1M 2M
500
250
465
bpbp
2013年第2期 143白荷露等 ：乙肝病毒 X 基因可调控表达细胞模型的构建
2.2 慢病毒的制备和滴度测定
细胞转染后 48 h 收集上清获得重组病毒颗粒，
经病毒滴度试剂盒检测，包装出的病毒滴度约在 108
LPs/mL 左右。
2.3 稳定转染的细胞系HepG2-HBx（reg）的构建
与鉴定
含有四环素调控元件 rt-TA 和 HBx 基因的重组
病毒颗粒先后感染细胞，分别用 600 μg/mL 浓度的
G418 和 1.0 μg/mL 浓度的 Puromycin 筛选细胞，获得
稳定细胞株 HepG2-HBx（reg）。PCR 扩增鉴定结果
如图 3 所示，证明了 HepG2-HBx（reg）细胞中同时
含有四环素调控元件和乙肝病毒 X 基因。
细胞中检测到 X 基因的 RNA 表达，而没有加入 Dox
（0 mg/mL）的细胞中则检测不到 X 基因的 RNA 表
达。Western blot 试验结果显示同上，加入 Dox（1.0
mg/mL）诱导的细胞中检测到 X 基因的蛋白表达，
而未加入 Dox 的细胞中则检测不到 X 基因的蛋白表
达（图 5），HBV X 蛋白大小约为 17 kD，内参 β-actin
蛋白检测条带大小约为 42 kD，试验结果与理论值
基本相符，说明可诱导表达细胞试验模型构建成功。
2.4 反向PCR鉴定HBx基因的整合
应用反向 PCR 对于慢病毒载体介导基因的整合
进行了验证，二轮 PCR 鉴定结果如图 4 及图 5 所示。
对上述挑取的克隆进行测序分析，通过对插入位点
旁侧序列的比对分析，其序列确是人类基因组中序
列，分布于不同染色体中。pLVX-Tight-Puro-HBx 反
向转化子共挑取 10 个克隆进行测序，测序结果经
NCBI 数据库比对，发现了 7 个插入位点（表 1）；
pLVX-Tet-On-Advanced 反向转化子共挑取 8 个克隆
进行测序，经比对，发现了 4 个插入位点（表 2）。
证明慢病毒感染 HepG2 细胞后目的基因的确整合于
细胞基因组中。
2.5 HepG2-HBx（reg）细胞中X基因可诱导表达
的鉴定
RT-PCR 结果（图 4）显示，加入 Dox 诱导的
1 2 3 4 5M
500
2000
465
422
bpbp
M ：DNA Marker DL2000 ；1 ：rt-TA 引物扩增 HepG2-HBx 基因组产物，验证
调控元件 ；2 ：rt-TA 引物扩增阳性对照 ；3 ：pLVX 引物扩增 HepG2-HBx 基
因组产物，验证 X 基因 ；4 ：pLVX 引物扩增阳性对照 ；5 ：阴性对照
图 3 HepG2-HBx（reg）细胞 PCR 鉴定
表 1 pLVX-Tight-Puro-HBx 反向转化子整合位点旁侧
序列分析
染色体 整合位点序列 NCBI 中比对结果
13 DnaJ homolog subfamily C member 15
8 cysteine-rich secretory protein LCCL domain-containing 1
3 protein polybromo-1 isoform 2
3 Membrane-associated guanylate kinase，WW and PDZ domain-c
8 zinc finger protein 34
2 Putative sodium-coupled neutral amino acid transporter 11
11 Oxysterol-binding protein 1
表 2 pLVX-Tet-On-Advanced 反向转化子整合
位点旁侧序列分析
染色体 整合位点序列 NCBI 中比对结果
X Lysine-specific demethylase 6A
X OTU domain-containing protein 5 isoform a
1 Probable histone-lysine N-methyltransferase ASH1L
4 1461386 bp at 5 side ：insulin-like growth factor-binding protein 7
1 2 3 4 5M
250
500 465
bpbp
M ：DNA Marker DL2000 ；1 ：β-actin 内参引物扩增 HepG2-HBx（-Dox）细胞
RNA 逆转录产物 ；2 ：β-actin 内参引物扩增 HepG2-HBx（+Dox）细胞 RNA
逆转录产物 ；3 ：HBx 引物扩增 HepG2-HBx（-Dox）细胞 RNA 逆转录产物 ；
4 ：HBx 引物扩增 HepG2-HBx（+Dox）细胞 RNA 逆转录产物 ；5 ：阳性对照
图 4 HepG2-HBx（reg）细胞 RT-PCR 诱导表达验证
2.6 HepG2-HBx（reg）细胞免疫荧光试验
在放大 400 倍（目镜 10× 物镜 40）的荧光显
微镜下观察，细胞免疫荧光试验结果（图 6）显示，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期144
加入 Dox（1.0 mg/mL）诱导的细胞于荧光显微镜下
观察到绿色荧光，而没有加入 Dox（0 mg/mL）的细
胞中则没有观测到绿色荧光。再次证明可诱导表达
细胞试验模型的构建成功。
上述多种试验方法的结果说明了 HBx 基因在细
胞中实现了蛋白表达的可调控性，将为开展乙肝病
毒持续感染和致病的研究，以及抗 HBV 药物的筛选
提供较为理想的试验模型。
1
Actin
HBx
42
kD
17
2 3
1 ：未感染病毒的 HepG2 细胞提取的蛋白 ；2 ：未加 Dox（0 mg/mL）的细胞
提取蛋白 ；3 ：加入 Dox（1.0 mg/mL）诱导的细胞提取的蛋白
图 5 HepG2-HBx（reg）细胞 Western blot 诱导表达验证
A オⲭሩ➗㓴 B 䱤ᙗሩ➗㓴
C ᵚ䈡ሬ䈅傼㓴 D 䈡ሬ䈅傼㓴
a b a b
a b a b
a ：显微镜可见光下观察结果 ；b ：显微镜绿色荧光下观察结果
图 6 HepG2-HBx（reg）细胞免疫荧光试验
3 讨论
针对病毒性肝炎的研究，抗病毒药物的开发和
评价中的重要环节之一就是建立一种方便有效，且
与人类天然感染近似的试验模型。随着现代科学技
术的发展，有关 HBV 的细胞和动物模型相继建立。
现有 HBV 体外感染的细胞模型主要包括人原代肝细
胞（primary human hepatocytes，PHH）、HepRG 细胞
和 HepG2.2.15 细胞等［9-11］，但其均有各自的缺陷。
PHH 细胞的分离和体外培养较困难 ；HepRG 细胞培
养需 DMSO 化学诱导，可能对 HBV 感染和表达过程
有所影响［11，12］；HepG2.2.15 细胞是目前应用较为
广泛的细胞模型，但由于其 HBV DNA 已稳定地整
合入肝细胞的基因组，无法模拟 HBV 天然的感染过
程［6］。目前，在实验室中构建的多数 HBx 研究模型，
是在外源强启动子（如 CMV 启动子）控制下稳定的
表达，以非整合病毒来源的载体为工具研究其在诱
发肝炎和肝癌形成中的作用，而这并不理想［13］。
慢病毒具有可以有效地整合入宿主细胞并稳
定表达外源基因的优势，并不易诱发免疫反应，适
用于体内基因治疗，是一种较为理想的基因转移载
体［14］。本试验利用已广泛运用的 Tet-On 调控系统，
应用慢病毒感染的途径成功构建了乙肝病毒 X 基因
的可调控表达细胞模型，应用多种方法鉴定了 HBx
基因的诱导表达，实现蛋白表达的可调控性。
实验室同时构建了 HBV 其他基因的可调控细胞
模型，拟在细胞模型的基础上，通过人为控制蛋白
的表达来观察 HBV 蛋白表达前后细胞内的整体变化
趋势，更全面系统地研究 HBV 对宿主的影响。随后，
我们拟通过芯片和蛋白质组学等方法分析这些病毒
组分感染宿主的过程中对宿主的 MicroRNA 及蛋白
质组的影响，特别是一些机体免疫和肿瘤发生相关
分子的变化，进一步对其在宿主内改变表观遗传修
饰及形成免疫耐受的作用机理进行深入研究。
4 结论
本研究应用四环素 Tet-On 调控系统构建了乙肝
2013年第2期 145白荷露等 ：乙肝病毒 X 基因可调控表达细胞模型的构建
病毒 X 基因的诱导表达载体，经 HEK 293T 细胞包
装获得含有调控元件 rt-TA 和 HBx 基因的病毒颗粒，
P24 法测定滴度达到 108 LPs/mL。将两种病毒先后
感 染 HepG2 细 胞 系， 经 G418 和 Puromycin 抗 生 素
筛选获得整合有 HBx 基因的稳定细胞株 HepG2-HBx
（reg），并应用 RT-PCR 和 Western blot 等方法验证了
HBx 基因的可诱导表达。该细胞模型的成功构建为
研究 HBx 基因在对宿主感染致病和免疫耐受中的作
用提供了一种较理想的试验模型。
致谢 ：本实验室博士研究生汤必奎和硕士研究
生孙勇曾对本课题的研究和部分试验内容给予帮助，
在此由衷的表示感谢。
参 考 文 献
［1］ Lu FM, Zhuang H. Management of hepatitis B in China［J］. Chin
Med J, 2009, 122（1）：1-2.
［2］ Goldstein ST, Zhou F, Hadle SC, et al. A mathematical model
to estimate global hepatitis B disease burden and vaccination
impact［J］. Int J Epidemiol, 2005, 34（6）：1329-1339.
［3］ Guha C, Mohan S, Roy-Chowdhury N, et al. Cell culture and animal
models ofviral hepatitis. Part I ：hepatitis B［J］. Lab Anim, 2004,
33（7）：37-46.
［4］ Nassal M, Dallmeier K, Schultz U, et al. Phenotyping hepatitis B
virus variants ：fromtransfection towards a small animal in vivo
infection model［J］. J ClinVirol, 2005, 34（Suppl 1）：S89-S95.
［5］ 冯广义 , 张养生 . 乙型肝炎病毒感染模型研究进展［J］. 中华
实验和临床感染病杂志 , 2009, 3（3）：329-333.
［6］ 王选举 , 黄正明 , 宋建国 . 乙型肝炎病毒感染模型的研究进
展［J］. 传染病信息 , 2009, 2（3）：189-192.
［7］ 卢渝 , 张君 . 乙型肝炎病毒感染模型的研究进展［J］. 中外医
疗 , 2009, 27 ：172-174.
［8］ Gossen M, Freundlieb S, Bender G, et al. Transcriptional activation
by tetracylines in mammalian cells［J］. Science, 1995, 268（5218）：
1766-1769.
［9］ 蔡大伟 , 侯艳 . 原代肝细胞培养技术研究现状及其新药研发中
的应用［J］. 解放军药学学报 , 2009, 25 ：245-246.
［10］ Glebe D, Urban S. Viral and cellular determinants involved in
hepadnaviral entry［J］. World J Gastroenterol, 2007, 13（1）：
22-38.
［11］ 姚永远 , 马立宪 , 赛林涛 , 等 . 新型乙型肝炎病毒细胞感染模
型的建立［J］. 世界华人消化杂志 , 2010, 18（8）：755-760.
［12］ Guillouzo A, Corlu A, Aninat C, et al. The human hepatoma
HepaRG cells ：a highly differentiated model for studies of liver
metabolism and toxicity of xenobiotics［J］. Chem-Biol Interact,
2007, 168（1）：66-73.
［13］ 陈豪 , 李丹 , 林纳 , 等 . 乙肝病毒 X 基因慢病毒载体的构建和
鉴定［J］. 福建医科大学学报 , 2011, 45（3）：187-191.
［14］ Escors D, Breckpot K. Lentiviral vectors in gene therapy ：Their
current status and future potential［J］. Arch Immunol Ther Exp,
2010, 58 ：107-119.
（责任编辑 马鑫）