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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第11期
番茄（Lycopersium esculentum Mill）是被最早进
行基因转化研究的高等植物之一，从 1986 年 McCor-
mick 等［1］首次报道获得番茄转基因完整植株以来，
番茄遗传转化体系得到了不断发展，它已成为基因
工程研究的重要模式植物。外源基因表达调控元件
的研究成为热点，启动子是最重要的元件之一。目
前植物基因工程中常用的组成型表达启动子，使外
源基因在植物内各部分表达，采用基因工程技术对
农作物进行遗传改良过程中，常常期望插入的外源
基因能够限制在特定的组织中表达而使植物获得有
用的性状，这就要求通过有效组织特异性启动子对
收稿日期 : 2012-05-04
基金项目 : 国家科技部转基因生物新品种培育重大科技专项（2009ZX08004-001B, 2009ZX08004-004B）
作者简介 : 崔姗姗 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 植物基因工程 ; E-mail: aicuishanshan@163.com
通讯作者 : 李桂兰 , 女 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 植物分子生物学与基因工程 ; E-mail: lgl63@126.com
黑芥子酶基因 pyk10 根特异启动子在番茄中的验证
崔姗姗  乔亚科  李桂兰  钟磊  刘杰  王林红
（河北科技师范学院植物细胞工程实验室，昌黎 066600）
摘 要 ： 黑芥子酶是一类催化芥子油苷水解的同工酶，pyk10 是一个在拟南芥根和下胚轴中特异表达的黑芥子酶基因。从
拟南芥 Columbia 生态型基因组中克隆的长度为 1 450 bp 的 pyk10 基因启动子片段，以 gus 基因为报告基因构建了植物表达载体
pPykG。通过农杆菌介导法，将 pyk10 的根特异表达启动子以及 gus 基因转入了番茄中蔬 6 号，经 PCR 检测，转化植株中扩增出
pyk10 启动子特异性条带。组织化学法检测及定量分析，显示 pyk10 启动子驱动 gus 基因在番茄的根部特定表达。
关键词 ： 拟南芥 pyk10 启动子 gus 基因 番茄 根特异表达
Functional Analysis of Root Specific Promoter of Myrosinase Gene
pyk10 in Tomato
Cui Shanshan Qiao Yake Li Guilan Zhong Lei Liu Jie Wang Linhong
（Plant Cell Engineer Lab，HeBei Normal University of Science and Technology，Changli 066600）
Abstract:  Myrosinase are a group of isoenzymes catalyzing the hydrolysis of glucosinolates. pyk10 is a root and hypocotyls specific
myrosinase gene from Arabidopsis thaliana. A promoter fragment of 1 454 bp long of pyk10 was cloned by PCR from Arabidopsis thaliana
genomic DNA. The plant expression vector of pPykG was constructed by replaced the 35S promote of vector pBin121 with pyk10 promote
fragment. Gus gene as a repoter gene under the control of myrosinase gene（pyk10）promoter was introduced into Tomato cultivated variety（Zhong
Shu 6）via Agrobacterium transformation. A pyk10 promoter fragment was detected by PCR from transgenenic tomato plants. The result of GUS
histochemical detection and quantitative analysis showed that the pyk10 promoter could drived gus gene specifically expression in the transgenic
tomato roots.
Key words:  Arabidopsis thaliana pyk10 promoter gus gene Tomato Root specific expression
靶基因的表达进行调控，以更经济有效地发挥目的
基因的作用［2］。马铃薯 PGT2 的启动子启动 gus 基
因在马铃薯及烟草的根尖端和表皮部位表达［3］，松
树根特异性启动子驱动 CMO/BADH 基因在水稻中表
达［4］。pyk10 是从拟南芥中分离的一个黑芥子酶基
因，在拟南芥根和下胚轴特异性表达［5-7］，797 bp
和 1 457 bp 启动子片段能够引导 gus 基因在拟南芥
根中表达，并且 pyk10 启动子是目前唯一仅在成熟
根部表现活性的启动子［8］。
本研究目的是克隆 pyk10 启动子，以 gus 基因
为报告基因构建植物表达载体，并采用根癌农杆菌
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期74
介导的转化方法番茄，对 pyk10 启动子在番茄植株
中的功能进行初步研究，旨在为今后 pyk10 启动子
在其他作物抗根部病虫害、提高土壤营养利用率基
因工程中的应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
中蔬 6 号番茄种子购自中国农科院蔬菜研究所，
pMD18-T 载 体 购 自 TaKaRa 公 司（ 大 连 ），E. coli
DH5α，农杆菌 LBA4404，pBin121 载体由本实验室
保存。
1.2 方法
1.2.1 植物表达载体构建 将本研究室克隆的 pyk10
启动子片段 1 454 bp，连接到植物表达载体 pBI121
报告基因 gus 基因的上游，替换原来的 35S 启动子，
构建表达载体，转化根癌农杆菌 LBA4404。
1.2.2 番茄转化
1.2.2.1 培 养 基 无 菌 苗 培 养 基 ：MS+3% 蔗 糖 +
1.0% 琼脂。分化培养基 : MS+ZT 1.0 mg/L+3% 蔗糖 +
1.0% 琼脂。芽伸长培养基 : MS+ZT 0.1 mg/L+3% 蔗
糖+1.0%琼脂。生根培养基: MS+3%蔗糖+1.0%琼脂。
1.2.2.2 茄子叶为外植体，农杆菌介导法进行转化，
将经过共培养的番茄子叶外植体转移到含 50 mg/L
的卡那霉素分化培养基上培养 15 d，随后，每次继
代培养过程中提高选择压力达到 100 mg/L 卡那霉素，
每 15 d 继代转接一次，以保持选择压力和抑制农杆
菌的生长。选择培养 3-4 周后，子叶将陆续分化出
抗性不定芽，待长到 1 cm 后，将芽从外植体上切下，
转入相应的含选择压力的不定芽伸长培养基，继续
抗性筛选。抗性芽在芽伸长培养基上生长到 2 cm 以
上时，将基部老化部分切除，转入生根培养基上。
生根时加抗生素卡那霉素 100 mg/L，10 d 左右长出
不定根，根长达到 4-6 cm 以上，并且长出一些侧根，
对生长健壮的植株进行移栽［9］。
1.2.3 抗性植株 PCR 检测 采用 SDS 法提取基因组
DNA，选用扩增 pyk10 启动子片段检测番茄转化植
株。上游引物 ：5-GCGAAGCTTGGATCCCACTTATT-
ACAAGTTTTA-3，下游引物 ：5-GCGCCCGGGTTT-
GCAGATTATAATTGA-3。 扩 增 程 序 ：95 ℃ 预 变 性
5 min ；94℃变性 1 min，54℃退火 1 min，72℃延伸
1 min，32 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。反应结束
后，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统
拍照。
1.2.4 报告基因 GUS 表达活性检测 对 PCR 阳性植
株幼嫩叶片、新根及成熟老根进行 GUS 组织化学染
色［10］，显微镜及解剖镜下观察，进行拍照。
1.2.5 报告基因 GUS 表达活性定量 取上述 PCR 阳
性植株幼嫩叶片、根系液氮研磨，提取 GUS 待测液，
测定 GUS 提取液的总蛋白含量，应用 GUS 活性比
色法定量测定 GUS 活性，酶单位活力定义为 ：每分
钟水解 PNPG 生成 1 nmol 对消基苯酚的酶的量，gus
基因表达活性以每毫克蛋白的酶活力表示［10］。
2 结果
2.1 pyk10启动子的克隆
pyk10 基 因 启 动 子 序 列 共 计 3 569 个 碱 基，
pyk10 基因起始密码子上游 1 457 个碱基是该启动子
的核心序列，根据此段序列，设计出了上下游引物，
并 分 别 在 上 游 引 物 5 端 加 了 Hind Ⅲ 和 BamH Ⅰ
位点，下游引物 5 端加了 Sma Ⅰ位点。以拟南芥
（Arabidopsis thaliana）Columbia 生态型基因组 DNA
为模板，通过 PCR 扩增获得拟南芥 pyk10 启动子大
约 1 400 bp 的扩增产物（图 1）。回收 1 400 bp PCR
片段，与 pMD18-T 载体连接，获得重组质粒 pMD-
pyk（图 2），将质粒 pMD-pyk 进行测序，所克隆的
启动子片段全长 1 454 bp。
1, 2. pyk10 启动子扩增片段 ；M. λDNA EcoRI / Hind Ш marker
图 1 pyk10 启动子 PCR 扩增片段的琼脂糖凝胶电泳
1 2 M
2027
bp
1548
1375
947
2.2 pyk10启动子表达载体pPykG的构建
以 GUS 基因为报告基因，鉴定所克隆的 1 454
bp 的 pyk10 启动子片段功能。将 pyk10 启动子片段，
连接到植物表达载体 pBI121 报告基因 gus 基因的上
2012年第11期 75崔姗姗等 ：黑芥子酶基因 pyk10 根特异启动子在番茄中的验证
游，替换原来的 35S 启动子。
将 质 粒 pMD-pyk 和 植 物 表 达 载 体 pBI121 分
别用 Hind Ⅲ和 Sma Ⅰ双酶切，分别回收约 1.4 kb
pyk10 启动子片段和 14 kb 载体片段，连接转化，获
得重组质粒 pPykG，构建出表达载体 pPykG（图 3）。
用 冻 融 法 将 质 粒 载 体 pPykG 转 入 农 杆 菌
LBA4404 中。在含有 50 mg/L 链霉素和卡那霉素的
平板上生长 2-3 d 后，长出 10 个左右菌落，用碱裂
解法提取质粒，进行 PCR 鉴定为阳性（图 4）。
结果（图 5）显示，4 株抗性植株和阳性对照质粒均
扩增出了约 1 450 bp 的特异条带，而阴性对照植株
却无相应的特异条带，初步表明目的基因已被转入
番茄中。
图 2 pMD18 和 pyk10 启动子重组质粒 pMD-pyk
pMD-pyk
4.1 kbAmp r
SmaI
ori
BamH I
pyk[1.4 kb]
Hind III
图 3 pPykG 重组质粒
图 4 重组质粒 pPykG 的 pyk10 启动子 PCR 扩增片段
的琼脂糖凝胶电泳检测
M. λDNA/ HindШ marker ；1, 2. pyk10 启动子 PCR 产物
Smal
Km r
RB
NPTII
GUS
LBpPykG
Hind III
pyk
M 1 2
2027
bp
1574
1375
2.3 番茄转化植株的PCR检测
用 pPykG 的工程菌转化中蔬 6 号番茄子叶，获
得卡那霉素抗性植株，提取抗性植株基因组 DNA，
用 pyk10 启动子片段的一对引物进行 PCR 扩增检测。
1-7. 中蔬 6 卡那抗性植株 ；8. 中蔬 6 对照 ；9. 阳性对照质粒 ；
M. 100 bp Ladder Plus DNA Marker
图 5 pPykG 转化番茄植株 PCR 检测
500
1500
1000
2000
bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
M. 100 bp Ladder DNA Maker ；1-7. 中蔬 6 卡那抗性植株 ；
8. 中蔬 6 对照 ；9. 阳性对照质粒
图 6 pBin121 转化番茄植株 PCR 检测
1M 2 3 4 5 6 7 8 9 M
1000
bp
800
700
同时，用含 pBin121 的工程菌转化中蔬 6 号番茄
子叶，获得了卡那霉素抗性番茄植株。根据 npt-Ⅱ基
因序列设计一对引物，上游引物 5-AGACAATCGG-
CTGCTCTGAT-3， 下 游 引 物 5-TCATTTCGAACCC-
CAGAGTC-3，跨度为 740 bp。对 pBin121 转化番茄
植株提取 DNA，进行 PCR 扩增，其中 5 株扩增出约
740 bp 的特异条带（图 6）。
2.4 pyk10启动子和35S启动子特性比较
2.4.1 启动 gus 基因表达部位比较 对 PCR 阳性植
株，进行 gus 基因表达检测，以 X-gluc 为底物，用
组织化学染色法检测 gus 报告基因表达部位。结果
显示，35S 启动子和 pyk10 启动子转化番茄植株根均
显示蓝色，非转基因对照植株均无蓝色出现，表现
为白色（图 7-A）。pyk10 启动子转化番茄植株在叶
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期76
片中边缘和叶脉部分显示蓝色（图 7-B 和 C），35S
启动子转化的植株叶片整体染成蓝色（图 7-D），对
照植株叶片无色（图 7-C）。
3 讨论
pyk10 是从拟南芥中分离的一个黑芥子酶基因，
在拟南芥根和下胚轴特异性表达，并且 pyk10 启动
子是目前唯一仅在成熟根部表现活性的启动子［8］。
Nitz 等［8］将起始密码子上游 263 bp、797 bp、1 457
bp 和 2 242 bp 的启动子片段分别与 gus 基因融合转
化拟南芥，结果表明 797 bp 和 1 457 bp 启动子片段
能够引导 gus 基因在拟南芥根中表达［8］。
本研究根据 Nitz［8］发表的 1 457 bp 启动子片段
序列设计引物，用 PCR 方法从拟南芥 Columbia 生态
型基因组中克隆了 1 454 bp 的 pyk10 基因启动子片
段，在番茄转化植株根系中启动 gus 基因表达的活
性显著高于在叶片中的表达量，并且显著高于 35S
启动子再根系中的表达强度，说明拟南芥黑芥子酶
基因 pyk10 启动子在番茄中表现了根表达特异性。
本研究 pyk10 启动子在番茄叶片中有少量表达，这
和 Nitz 等［8］结果有一定差异，本研的 pyk10 启动
子是从拟南芥 Columbia 生态型基因组 DNA 中获得，
其序列与 Nitz 等［8］发表序列相比，有 25 个 bp 碱基
的差异，二者同源性达到 98%［11］，这种微小差异可
能来自拟南芥不同生态型之间的多态性。本研究所
用拟南芥为 Columbia 生态型，Nitz 等［8］所用拟南芥
为 C24 生态型，这也可能是导致了本研究中 pyk10
启动子在叶片中有微量表达的原因。
仅有较少的报告涉及到拟南芥 pyk10 启动子对
基因表达的调控，并且研究对象只是拟南芥［8］，本
实验室用 pyk10 启动子构建了植酸酶基因 phyA 表
达载体，转入大豆实现了根系分泌植酸酶［12］。说明
pyk10 启动子在拟南芥以外的植物中也具有根表达
特异性，为今后 pyk10 启动子在植物抗根部病虫害、
改善根的质量及提高土壤营养利用基因工程中的应
A：1. 阴性对照，2. 35S 启动子转化植株根，3. pyk10 启动子转化植株根；
B: pyk10 启动子转化植株转化植株叶片 ；C ：1. pyk10 启动子转化植株
转化植株叶片，2. 阴性对照植株叶片 ；D ：35S 启动子转化植株叶片
图 7 gus 基因在中蔬 6 号番茄转化植株根和叶片中
表达的组织化学检测
1 2
1 2 3
A B
C D
2.4.2 启动 gus 基因表达定量分析与比较 应用分
光光度法分别测定 pyk10 启动子和 35S 启动子转化
植株及对照植株叶片和根系的 GUS 活性，结果（图
8）表明，对照植株的根和叶片均有一定的测定值，
分别为 53.76 U/mg 和 26.41 U/mg，这是由于大多数
植物所含的色素与硝基苯酚有相同的最大吸收波长
所致。以对照为基础消除色素的影响，pyk10 启动
子转化植株叶片 GUS 的实际表达量为 34.55 U/mg ；
而 35S 启动子转化植株叶片 GUS 的实际表达量为
119.95 U/mg， 达 到 pyk10 启 动 子 的 3.47 倍。 在 转
化植株根系中，35S 启动子 GUS 的实际表达量仅为
13.13 U/mg，而 pyk10 启动子 GUS 的实际表达量为
252.64 U/mg，达到 35S 启动子的 19.25 倍。pyk10 启
动子在番茄转化植株根系中 GUS 活性比在叶片中提
高 3.14 倍。
图 8 pyk10 和 35S 启动子启动 gus 基因在不同组织
中的表达比较
300.00
200.00
100.00
50.00
0.00
88.31
173.71
53.76
277.25
37.73 24.61
ck
38S
pyk10
150.00
250.00
ਦ⡷leaf ṩroots
gu
s表
达
活
性
U/m
g
2012年第11期 77崔姗姗等 ：黑芥子酶基因 pyk10 根特异启动子在番茄中的验证
用提供了依据。
4 结论
（1）拟南芥黑芥子酶基因 pyk10 起始密码子上
游 1 454 bp 的启动子片段引导 gus 基因在番茄转化
植株根系中特异表达。（2）pyk10 启动子在番茄根
系中的启动强度明显高于 35S 启动子，在叶片中的
启动强度则明显低于 35S 启动子。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）