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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):180-185
L-瓜氨酸是一种游离的氨基酸，是人体尿素循
环的重要中间代谢物，具有多种生理功能。利尿、
护肝，可与 L-鸟氨酸、L-精氨酸等共同治疗高氨血
症［1，2］；参与内源性细胞舒张因子一氧化氮的合成，
有助于扩张血管、抑制动脉硬化，可用于治疗高血
压、冠心病及男性性功能障碍等疾病［3-5］；在肠道
中 L-瓜氨酸通过谷氨酸 - 鸟氨酸代谢途径合成，可
作为检验小肠移植时异体排斥效应程度的指示剂［6］；
L-瓜氨酸与精氨酸结构相似，对体内自由基表现出
高度的活性，可作为天然高效的新抗氧化剂［7］，由
此可见 L-瓜氨酸在医药用品、保健食品以及化妆品
中应用前景广阔。随着人们保健意识的提高，对 L-
瓜氨酸的需求量日益增多，因此生产 L-瓜氨酸具有
重大的意义。
L-瓜氨酸主要是由精氨酸脱亚胺酶（arginine
deiminase，ADI，EC3.5.3.6）催化 L-精氨酸盐酸盐
收稿日期 ：2014-12-10
作者简介 ：马越，女，硕士研究生，研究方向 ：重组酶的制备和应用 ；E-mail ：fionamy0912@sina.com
通讯作者 ：吴丹，男，硕士生导师，研究方向 ：食品与发酵研究 ；E-mail ：bioenwu@aliyun.com
重组精氨酸脱亚胺酶制备 L-瓜氨酸的工艺条件优化
马越1，2  宿玲恰1，2  吴丹1，2  吴敬1，2
（1. 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122 ；2. 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，
无锡 214122）
摘 要 ： 将来源于 Pseudomonas putida ACCC 10185 的 ADI 编码基因克隆到表达载体 pET-24a（+）中，转化 Escherichia coli
BL21（DE3），通过超声波破碎得到粗酶液，酶活检测 ADI 酶活为 26 U/mL 发酵液。对酶转化 L- 精氨酸盐酸盐生成 L- 瓜氨酸的
反应条件进行了优化，结果表明，当底物 L- 精氨酸盐酸盐浓度 650 g/L，反应初始 pH6.0，温度 37℃，加酶量 24 U/g 底物，转速
100-200 r/min，转化时间 7 h，L- 瓜氨酸转化率达到 100%，是目前国内外报道的酶法制备 L- 瓜氨酸的最高水平。
关键词 ： 精氨酸脱亚胺酶 ；L- 瓜氨酸 ；酶转化 ；重组表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.026
Optimization of Preparing L-citrulline by Recombinant Arginine
Deiminase
Ma Yue1，2 Su Lingqia1，2 Wu Dan1，2 Wu Jing1，2
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122 ；2. School of Biotechnology，Key Laboratory
of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract: The arcA gene encoding ADI from Pseudomonas putida ACCC 10185 was cloned into the expression vector pET-24a
（+）. The vector was then transformed into Escherichia coli BL21（DE3）for intracellular production of ADI. The crude enzyme was
obtained by ultrasonic treatment, and activity in the fermentation broth of recombinant E. coli BL21（DE3）was 26 U/mL. Furthermore, the
condition for enzymatic conversion of L-arginine monohydrochloride to L-citrulline by the recombinant ADI was optimized. At 650 g/L of
L-arginine monohydrochloride, pH6.0, 37℃, 100-200 r/min, and 24 U ADI per gram substrate incubated for 7 hours, 100% of the L-arginine
monohydrochloride was transformed into L-citrulline, which was the highest level of preparing L-citrulline by enzyme method in home and abroad
presently.
Key words: arginine deiminase ；L-citrulline ；enzymatic conversion ；recombinant expression
2015,31(8) 181马越等：重组精氨酸脱亚胺酶制备 L-瓜氨酸的工艺条件优化
水解生成 L-瓜氨酸和氨［8，9］。利用 ADI 催化生成 L-
瓜氨酸由于原料易得、工艺简单、产物浓度高等优
点逐渐成为 L-瓜氨酸制备的潜力途径。
本 研 究 将 来 源 于 Pseudomonas putida ACCC
10185［10］的 ADI 基因（arcA）连接到表达载体 pET-
24a（+），获得重组质粒 pET-24a（+）-arcA，将其
转化 Escherichia coli BL21（DE3）并进行摇瓶发酵，
经超声波破碎，检测破壁上清液中的 ADI 酶活。在
此基础上，对酶转化工艺进行研究，旨在获得高效
制备 L-瓜氨酸的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 恶臭假单胞菌（Pseudomonas
putida ACCC 10185）：由 ACCC 菌种保藏中心购买 ；
E.coli JM109、E.coli BL21（DE3）、 表 达 载 体 pET-
24a（+）：为 本 实 验 室 保 藏 ；克 隆 载 体 pMD18-T
Simple vector ：购自 TaKaRa 公司。
1.1.2 培养基 LB 培养基（g/L）：蛋白胨 10，酵母
粉 5，NaCl 10，卡那霉素 0.03，pH7.0。
TB 培养基（g/L）：蛋白胨 12，酵母粉 24，甘油
5，K2HPO4 2.31，KH2PO4 16.43， 卡 那 霉 素 0.03，
pH7.0。
1.1.3 试 剂 限 制 性 内 切 酶、T4 DNA 连 接 酶、
PrimerStar HS DNA 聚合酶、碱性磷酸酶 CIAP、核酸
分子量标准及琼脂糖 ：购自 TaKaRa 公司 ；PCR 产
物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、质粒
小提试剂盒 ：天根生化科技有限公司 ；卡那霉素、
氨苄青霉素、异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、
蛋白质相对分子质量标准、L-精氨酸盐酸盐、瓜氨
酸标样 ：购自生工生物工程（上海）有限公司 ；其
它分析纯试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.4 主要仪器 凝胶成像仪、蛋白电泳仪购自美
国 Bio-Rad 公司 ；DYY-6C 型核酸电泳仪购自北京
六一仪器厂 ；高效液相色谱仪购自 Agilent 公司 ；细
胞破碎仪购自北京科实兴业科技有限公司 ；紫外可
见光分光光度计购自日本 Shimadzu 公司。
1.2 方法
1.2.1 工 程 菌 的 构 建 提 取 Pseudomonas putida
ACCC 10185 的 基 因 组，PCR 扩 增 目 的 基 因 arcA，
将所得片段割胶回收后，连接克隆载体 pMD18-T
Simple vector，将连接产物转入 E.coli JM109 感受态
细胞中，在平板培养基上培养过夜，挑取单克隆至
液体培养基中培养，抽提质粒得到 pMD18-T-arcA，
经 Nde Ⅰ和 Hind Ⅲ双酶切后，将目的基因片段割
胶回收，T4 连接酶将目的基因与经相同酶切处理的
表达载体 pET-24a（+）连接，连接产物转入 E.coli
JM109 感受态细胞中，在平板培养基培养过夜后，
挑取单克隆进行液体培养，抽提得到重组质粒 pET-
24a（+）-arcA。将 pET-24a（+）-arcA 进行双酶切验证，
验证正确后转入 E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，
涂布 LB 平板培养基，挑取单克隆进行液体培养，
保存甘油管，-80℃保存。
1.2.2 摇瓶发酵生成 ADI
1.2.2.1 种子培养 接一定量 -80℃ 甘油管中保存的
菌液至 LB 培养基，37℃、200 r/min，培养 8 h。
1.2.2.2 摇瓶发酵 将种子液以 5% 的接种量转接
至 TB 培养基，37℃培养至 OD600 约为 1.0 时，加入
终浓度为 0.4 mmol/L 的 IPTG［11，12］，置于 25℃、转
速 200 r/min 进行重组蛋白的诱导表达，诱导 18 h
后 离 心 收 集 菌 体， 用 50 mmol/L，pH6.0 Na2HPO4-
NaH2PO4 缓冲液复溶菌体至 5 OD，超声波破碎后
离心，破壁上清即为 ADI 粗酶液，测定粗酶液中的
ADI 酶活，经与发酵液 OD 折算后，即为每毫升发
酵液中的 ADI 酶活。
1.2.3 ADI 活性测定 利用二乙酰一肟 - 氨基硫脲
比色法测定 ADI 酶活［13］。用 50 mmol/L，pH6.0 的
磷酸盐缓冲液配制 0.2 mol/L L-精氨酸盐酸盐溶液作
为底物，取 100 μL 适当稀释的酶液加入 1 mL 底物
中，于 37℃条件下反应 30 min，加入 1 mL 10% 三
氯乙酸终止反应，沸水浴 5 min，稀释一定倍数后测
定瓜氨酸含量，并计算酶活。酶活定义 ：37℃条件
下，每分钟转化 1 μmol L-精氨酸盐酸盐生成瓜氨酸
的酶量定义为 1 U。
1.2.4 L-瓜氨酸的制备及含量测定 以 50 mmol/L，
pH6.0 的磷酸盐缓冲液配制浓度为 650 g/L 的 L-精氨
酸盐酸盐溶液，加酶量为 24 U/g 底物，与一定量的
酶液充分混匀后在 37℃、100-200 r/min 水浴摇床中
反应 7 h。转化后的反应液加入等体积的三氯乙酸后，
静置 2 h，12 000 r/min 离心 10 min，取上清进行分析。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8182
利 用 HPLC 进 行 产 物 分 析 的 色 谱 条 件 是 ：Agilent
1200 HPLC 色 谱 仪，Agilent 自 动 进 样 器， 色 谱 柱
250×4.6 mm 5 μm Inertsil ODS-3 Column，Agilent 紫
外检测器 ；流速 0.8 mL/min ；柱温 40℃。转化率定
义为生成的 L-瓜氨酸的摩尔数 /L-精氨酸盐酸盐的摩
尔数 ×100%。
2 结果
2.1 ADI重组菌的构建
2.1.1 重组质粒 pET-24a（+）-arcA 的构建 提取
Pseudomonas putida ACCC 10185 的 基 因 组，PCR 扩
增目的基因 arcA，将携带目的基因的质粒 pMD18-T
和本实验室质粒 pET-24a（+）分别经 Nde Ⅰ和 Hind
Ⅲ双酶切后，割胶回收目的基因片段和 pET-24a（+），
连接后转入 E.coli JM109 感受态细胞，培养重组菌
并抽提质粒。重组质粒经 Nde Ⅰ和 Hind Ⅲ双酶切验
证，结果（图 1）显示，在大约 5 300 bp 和 1 300 bp
处有条带，分别与载显体及基因大小一致，表明重
组表达载体 pET-24a（+）-arcA 构建成功。
氨酸盐酸盐为底物，加酶量为 24 U/g 底物，pH6.0，
转 速 100-200 r/min， 分 别 在 30℃、37℃、40℃、
50℃、60℃和 70℃水浴摇床中转化 7 h，HPLC 检测
L-瓜氨酸生成量。图 3 表明，高温条件下转化率较
低， 而 低 温 条 件 下 转 化 率 明 显 提 高， 最 高 值 为
100%。这是因为低温有利于酶的稳定，而高温时酶
的热稳定性较差，反应过程中酶易失活，导致转化
率较低，因此 37℃为最佳转化温度。
10000
bp
M1 M21
7000
2000
bp
1000
arcA
pET-24a+
750
500
250
100
4000
2000
1000
500
250
M1 ：10000 bp DNA Ladder Marker ；M2 ：2000 bp DNA Ladder Marker ；
1 ：重组质粒 pET-24a（+）-arcA
图 1 重组质粒 pET-24a（+）- arcA 酶切验证
2.1.2 重组菌 E.coli BL21（DE3）/ pET-24a（+）-arcA
的构建及培养 将重组质粒 pET-24a（+）-arcA 转化
E.coli BL21（DE3）感受态细胞，经 0.4 mmol/L IPTG
诱导培养后收集菌体，处理后得 ADI 粗酶液。经检
测，ADI 酶活为 26 U/mL 发酵液。SDS-PAGE（图 2）
分析显示，ADI 破壁上清液在大约 43 kD 处出现一
条蛋白条带，与理论 ADI 分子量相符，表明 ADI 在
E.coli BL21（DE3）中成功表达。
2.2 重组ADI制备L-瓜氨酸转化条件优化
2.2.1 反应温度对酶转化的影响 以 650 g/L L-精
97.4
kD
M1 1
66.2
ADI43
31
20
14.4
M ：蛋白质 Marker ；1 ：E.coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-arcA破壁上清
图 2 精氨酸脱亚胺酶 SDS-PAGE 分析
100
80
60
40
20
0
30 40 50 60 70⑙ᓖć䖜ॆ⦷%
图 3 反应温度对酶转化的影响
2.2.2 反应初始 pH 对酶转化的影响 以 650 g/L L-
精氨酸盐酸盐为底物，加酶量为 24 U/g 底物，反应
温度 37℃，转速 100-200 r/min，分别在 pH4.0、5.0、
5.5、6.0、6.5、7.0 和 8.0 中转化 7 h，HPLC 检测 L-
瓜氨酸生成量。图 4 表明，当初始 pH 为 6.0 时，L-
瓜氨酸转化率为 100%。pH 的改变可使酶分子上的
侧链基团处于不同的解离状态，影响底物的结合和
进一步的反应，或者影响酶的空间结构，从而影响
酶的活性，因此过酸或过碱对酶促反应都不利，在
2015,31(8) 183马越等：重组精氨酸脱亚胺酶制备 L-瓜氨酸的工艺条件优化
100
110
80
90
70
60
40
50
30
20
4 5 6 7 8
pH
䖜ॆ⦷%
图 4 反应初始 pH 对酶转化的影响
pH 为 6.0 时 L-瓜氨酸转化率最高。
2.2.3 加酶量对酶转化的影响 以 100 g/L L-精氨酸
盐酸盐为底物，加入不同量的 ADI，加酶量分别为
底物 12、24 和 36 U/g，反应温度 37℃，pH6.0，转
速 100-200 r/min，转化 3.5 h，HPLC 检测 L-瓜氨酸
生成量。图 5 表明，随着加酶量的增多，相同时间
内 L-瓜氨酸转化率逐渐增大，但是不同加酶量条件
下，L-瓜氨酸转化率均能达到 100%。考虑到经济性
因素，选择加酶量为底物 24 U/g。
100
120
80
60
40
20
0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5ᰦ䰤h䖜ॆ⦷% 12 U/gᓅ⢙24 U/gᓅ⢙36 U/gᓅ⢙
图 5 加酶量对酶转化的影响
2.2.4 底物浓度与反应时间对酶转化的影响 分别
配制浓度为 50、100、150、200、300、400 和 650 g/L
的 L-精氨酸盐酸盐溶液，加酶量为 24 U/g 底物，反
应温度 37℃，pH6.0，转速 100-200 r/min，定时取样，
HPLC 检测 L-瓜氨酸生成量。图 6 表明，随着 L-精
氨酸盐酸盐浓度的增大，相同时间内 L-瓜氨酸转化
率越来越低，但随着转化时间的延长，L-瓜氨酸的
100
120
80
60
40
20
0
10 2 3 4 5 6 7 8ᰦ䰤h䖜ॆ⦷% 50 g/L100 g/L150 g/L200 g/L300 g/L400 g/L650 g/L
图 6 底物浓度对酶转化的影响
浓度不断增加，最终均能达到 100%，因此将转化时
间定为 7 h。
2.2.5 转速对酶转化的影响 以 650 g/L L-精氨酸
盐酸盐为底物，加酶量为 24 U/g 底物，反应温度
37℃，pH6.0，分别在转速 100、150 和 200 r/min 中
转化 7 h，HPLC 检测 L-瓜氨酸生成量。结果显示，
不同转速对 L-瓜氨酸转化率无影响。
3 讨论
早 在 1971 年， 来 自 日 本 的 Kakimoto 等［14］ 就
利 用 Pseudomonas putida ATCC 4359 ADI 生 产 瓜 氨
酸，以 L-精氨酸盐酸盐为底物，反应 62 h 后转化率
达到 90.5% ；1973 年，Chibata 等［9］ 报道同一来源
的 ADI，以 L-精氨酸或 DL-精氨酸为底物，可生产
瓜氨酸浓度达 80 g/L 以上；1974 年，Yamamoto 等［15］
用聚丙烯酰胺凝胶包埋上述来源的细胞，可将浓度
0.5 mol/L 的 L-精氨酸盐酸盐完全转化为 L-瓜氨酸 ；
2014 年， 王 颖 等［16］ 将 来 源 于 Pseudomonas putida
ATCC 4359 的 ADI 在 E.coli 中克隆表达，利用重组
菌制备的粗酶液可将 20 g/L L-精氨酸有效转化为 L-
瓜氨酸，转化率高于 90%，该酶显示出了与来源于
Pseudomonas putida ACCC 10185 的 ADI 99.76% 的同
源性。
我国对于其他来源的 ADI 转化 L-精氨酸盐酸
盐生成 L-瓜氨酸的研究也有一些报道。2005 年，曹
瑜等［17］利用 Streptococcus faecalis NJ402 游离细胞的
ADI，在 10 L 转化罐中，可将质量浓度 200 g/L 的 L-
精氨酸完全转化成 L-瓜氨酸。2006 年，张鹏等［18］
运 用 海 藻 酸 钠 包 埋 法 固 定 化 Streptococcus faecalis
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8184
CGMCC 1866 细胞生产 L-瓜氨酸，L-精氨酸转化率
高达 99%。2008 年，郑璞等［19］利用填充床反应器
固定化假单胞菌细胞连续制备 L-瓜氨酸，固定化细
胞对底物的摩尔转化率在 95% 以上。同年，姚海
峰等［20］利用 Streptococcus faecalis BT001，作用于浓
度 为 96 g/L 的 L-精 氨 酸， 转 化 率 达 到 98% ；2010
年，赵艳杰等［21］利用海藻酸钠固定化上述细胞，
填充床反应器中连续转化浓度为 100 g/L 的 L-精氨
酸底物，摩尔转化率为 95.1% ；2011 年，屈冉［22］
利用聚氨酯固定化上述细胞，填充床反应器中转化
浓度为 100 g/L 的 L-精氨酸底物，L-瓜氨酸的产量
在 65 g/L 左右。同年，郑雄敏等［23］利用高产 ADI
Streptococcus faecalis BM-2 CGMCC No.4990 菌株，在
30 L 发酵罐上小试发酵，产 L-瓜氨酸量达到 98 g/L。
2012 年，胡延奇［24］利用工程菌中的 ADI 作用于质
量浓度 60 g/L 的精氨酸，瓜氨酸的产量达 55.1 g/L。
本实验在 E.coli BL21（DE3）中成功表达了来
源于 Pseudomonas putida ACCC 10185 的 ADI，酶活
力单位为 26 U/mL。重点考察了该重组酶制备 L-瓜
氨酸的应用，考察了温度、pH、底物浓度、加酶量
等对酶转化的影响，在最优条件下能将 650 g/L 的 L-
精氨酸盐酸盐完全转化成 L-瓜氨酸，均高于上述研
究。下一步的研究重点是将该重组菌在 3 L 发酵罐
中进行优化，获得更高表达量的酶液，为工业化奠
定基础。同时，该工艺流程简单，操作方便，这为 L-
瓜氨酸的工业化生产奠定了坚实的基础，具有广阔
的实际应用前景。
4 结论
本研究成功获得了能够胞内表达 ADI 的重组
E.coli BL21（DE3）菌株，初步实验表明重组菌发
酵液 ADI 酶活可达 26 U/mL。采用该重组 ADI 优化
了酶法制备 L-瓜氨酸的工艺条件。结果表明，底
物 L-精氨酸盐酸盐浓度 650 g/L，反应 pH6.0，温度
37℃，加酶量 24 U/g 底物，转速 100-200 r/min，转
化时间 7 h，L-瓜氨酸转化率可达 100%。
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（责任编辑 马鑫）