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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第11期
鹅副黏病毒病（goose paramyxovirus，GPM）是
由鹅源禽副粘病毒 I 型（avian paramyxovirus-1，APM-
1）引起鹅消化道病变为主要特征的一种急性、病毒
性、烈性传染病。本病于 1997 年 7 月在国内首次发
现［1， 2］，各种日龄和品种的鹅均有高度易感性，发
收稿日期 : 2012-06-08
基金项目 : 贵州大学大学生创新性实验计划项目［贵大创字（2011）077 号］
作者简介 : 鲜思美 , 女 , 博士 , 副教授 , 研究方向 : 预防兽医学的教学与科研 ; E-mail: xiansimei2005@163.com
鹅副黏病毒环介导等温扩增快速检测
方法的建立及应用
鲜思美1，2  韦洪才1  尹强军1  孔维祥1  苏刚1
（1 贵州大学动物科学学院，贵阳 550025 ；2 贵州省动物疫病研究所，贵阳 550025）
摘 要 ： 参照 GenBank 中登录的鹅副黏病毒（gallinacean paramyxovirus，GPMV）序列（AY325797），针对 GPMV 的 F 基因
保守区域设计了 4 条引物，通过优化反应条件，建立了检测 GPMV 的逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP），并进行了特异性试验、
敏感性试验及临床样本检测。结果显示，建立的 RT-LAMP 方法对 GPMV 阳性样品扩增产物的电泳呈特征性梯状条带，而鸭瘟病
毒（DPV）、鹅细小病毒（GPV）、番鸭细小病毒（MDPV）、鸭肝炎病毒（DHV）、鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）、鸭源
沙门氏菌（Salmonella anatamu）、鸡马立克病毒（MDV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的扩增产物电泳后均无扩增条带。建立
的 RT-LAMP 方法对 GPMV 的最低检出量为 9.5 fg 的 cDNA 模板，敏感性比常规 RT-PCR 方法高 1 000 倍。表明建立的 RT-LAMP 方
法特异性强、敏感性高。对 6 份临床样本的检出率为 100%（6/6），与常规 RT-PCR 的符合率为 100%。
关键词 ： 鹅副黏病毒 逆转录环介导等温扩增技术 检测
Establishmen and Application of a Loop-mediated Isothermal
Amplification Method for Rapid Detection of Gallinacean
Paramyxovirus
Xian Simei1，2 Wei Hongcai1 Yin Qiangjun1 Kong Weixiang1 Su Gang1
（1College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang 550025 ；2Institute of Animal Disease，Guizhou University，Guiyang 550025）
Abstract:  According to the conservative sequence of goose paramyxovirus virus gallinacean paramyxovirus, GPMV（AY325797）in
GenBank, design 4 primers of the F gene of conservative region for GPMV, the specificity test, sensitivity test and the detection of clinical
samples were experimented too. The results showed that using the RT-LAMP, the amplified products of positive samples for GPMV in
electrophoresis presented characteristic ladder, which were not found in DPV、GPV、MDPV、DHV、Riemerella anatipestifer、Salmonella
anatamu、MDV and IBV. The minimum detectable amount of cDNA template of GPMV were 9.5 fg by using this RT-LAMP method, and the
sensitivity was 1 000 times higher than conventional RT-PCR method. The detection rate of six clinical samples was 100% which fully comply
with the results by using conventional RT-PCR. The magnesium ions has been added into the reaction system and centrifugation after the end of
the reaction, a white precipitate can determine whether the reactionoccurred, its simple and intuitive.
Key words:  Gallinacean paramyxovirus RT- LAMP Detection
病雏鹅最小为 3 日龄，最大为 300 多日龄。鹅群的
发病率为 40%-100%，平均为 60%，死亡率为 30%-
100%，平均为 40% 左右。但 2 周龄以内的雏鹅群发
病率和死亡率均可达 100%［3］。王永坤等［4］对鹅源
APMV-1 进行分子生物学分析后，认为其在分类上
2012年第11期 151鲜思美等 ：鹅副黏病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用
属于副黏病毒科，副黏病毒亚科，腮腺炎病毒属，
为 F 基因Ⅶ型。APMV-1 含有单股负链基因组 RNA，
编码 6 种结构蛋白（即 HN 和 F 2 种囊膜糖蛋白，M、
NP、P 和 L 4 种结构蛋白），2 种非结构蛋白（36 kD
和 33 kD 蛋白）。在鹅源 APMV-1 的诊断上，除常规
的生物学特性试验外，单克隆抗体技术和分子生物
学技术也应用于该病的诊断［5-9］。环介导等温扩增
技术（loop-mediated isothermal ampli-fication，LAMP）
自开发以来已被广泛应用于细菌或病毒的定性、定
量检测、临床疾病的诊断等相关领域［10］。到目前为
止，采用 RT-LAMP 技术检测鹅副黏病毒尚未见报道。
本研究通过建立检测鹅副黏病毒的 RT-LAMP 方法，
旨在为鹅副黏病毒病的临床诊断与 GPMV 的快速检
测提供一种新的技术手段。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒及病料 GPMV、鸭瘟病毒（duck plague
virus，DPV）、鹅细小病毒（goose parvovirus，GPV）
贵州 1、2 株，番鸭细小病毒（muscovy duck parvovi-
rus，MDPV）、鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus，DH-
V）、 鸭 源 沙 门 氏 菌（Salmonella anatamu，S.anata-
mu）、鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）、
马立克病毒（marek’s disease virus，MDV）、鸡传染
性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）和
6 份鹅副黏病毒临床病料均由贵州省动物疫病研究
室保存。
1.1.2 主要试剂 dNTP、DNA Marker、RNA iso-rea-
gent kit 试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司 ；
Thermopol Buffer、Bst DNA 聚合酶购自北京纽英伦
（NEB）生物技术有限公司 ；M-MLV 反转录酶（200
U/μL）购自上海丽臣生物科技有限公司 ；Goldview
购自广州达辉生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据 GenBank 中登录的 GP-
MV F 基因序列（AY325797），应用在线 Primer Expl-
orer 3.0 软件设计了 4 条引物，包括两条外引物（GP-
MV-F3 和 GPMV-B3），前内引物（GPMV- FIP）和后
内引物（GPMV-BIP）。
GPMV-F3 ：5-TTCAAAGACTGAAGGCGC-3。
GPMV-B3 ：5-CAAATTCCCCACTGAGCC-3。
GPMV-FIP ：5-GGAGGGTCTGTACATCTACATG
TTGTTTTCGTATATGGCCCTTAAAGGC-3。
GPMV-BIP ：5-TATCGCAAAATTATGGAGAAGC
TGTTTTTTAATGATAAGACATTGCACGAATG-3。
引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。
1.2.2 RNA 提取与反转录 RNA 提取参照 RNA iso-
reagent kit 试 剂 盒 说 明 书 进 行。 反 转 录 体 系（20
μL）：模板（RNA）5 μL，外引物 F3/B3（10 μmol/L）
各 2 μL，dNTP（含 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各 10
mmol/L）2 μL，5×RT buffer 4 μL，Ribonuclease In-
hibitor（50 U/μL）1 μL，M-MLV 反转录酶（200 U/μL）
1 μL，0.1% DEPC 去离子水补足 20 μL。置 50℃水
浴 30 min。
1.2.3 LAMP 反应体系的优化 以反转录的 cDNA
为模板，采用 25 μL 反应体系，分别对内、外引物
浓度、Bst DNA 聚合酶、dNTP、Mg2+、反应温度及
反应时间等进行优化。内、外引物浓度比（FIP&BIP
F3&B3） 分 别 采 用 20 μmol/L 5 μmol/L、40 μmol/L
5 μmol/L、60 μmol/L 5 μmol/L、80 μmol/L 5 μmol/L、
100 μmol/L 5 μmol/L ；Bst DNA 聚合酶（8 U/μL）分
别采用 0.2、0.5、1.0、1.5 和 2.0 μL 递增 ；dNTP（10
mmol/L） 分 别 采 用 0.5、1.0、2.0、3.0 和 4.0 μL 递
增 ；MgCl2（25 mmol/L）以 1.0、2.0、3.0、4.0 和 5.0
μL 递增，通过筛选以确定 LAMP 最佳反应体系。反
应温度分别采用 60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和
65℃依次递增，反应时间分别采用 15、30、60、90
和 120 min 进行优化，以确定 LAMP 最佳反应温度
和时间。
1.2.4 特异性试验 以优化的 LAMP 方法对 GPMV、
DPV、GPV-GZ1、GPV-GZ2、MDPV、DHV、S.anatamu、
RA、MDV、IBV 的 DNA 或 cDNA 进行扩增，测定该
方法的特异性。
1.2.5 敏感性试验 以 GPMV RNA 反转录 cDNA 为
模板，用 TU-1810 测定其纯度和浓度，10 倍递进稀释，
进行 RT-LAMP，测定该方法的敏感性。
1.2.6 RT-LAMP 与 RT-PCR 敏感性的比较 以 GP-
MV 的 cDNA 为模板，2 条外引物（GPMV-F3 和 GP-
MV-B3）建立 RT-PCR 方法。25 μL 反应体系为 ：模
板（cDNA）1 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL，10×
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期152
PCR Buffer 2.5 μL，F3/B3（10 μmol/L）各 1 μL，dNTP
（10 mmol/L）0.5 μL，DNA 聚合酶（8 U/μL）0.5 μL，
去离子水补足 25 μL。PCR 反应程序 ：94℃预变性
180 s；94℃变性 30 s，52℃复性 30 s，72℃延伸 60 s，
30 个循环 ；72℃延伸 10 min。预期扩增片段大小为
205 bp。取 1 μL GPMV 的 cDNA，10 倍梯度稀释，进
行 RT-LAMP 扩增，比较两种核酸扩增方法的敏感性。
1.2.7 临床样本检测 采用 RT-LAMP 和 RT-PCR 方
法分别对 6 份临床病料进行检测，以比较这两种方
法的检出符合率。
1.2.8 RT-LAMP 反应结果的可视化判定 RT-LAMP
反应体系中的 Mg2+ 与 DNA 扩增反应中生成的 P2O7
4-
离子进行反应，生成的 Mg2P2O7 为白色沉淀。RT-
LAMP 反 应 完 成 后， 扩 增 产 物 7 500 r/min 离 心 5
min，将离心管置于光亮处观察有无白色沉淀生成。
2 结果
2.1 LAMP反应体系的优化结果
通过对内、外引物浓度、Bst DNA 聚合酶、dN-
TP、Mg2+ 等进行优化试验，确定最佳内引物与外引
物的浓度比为 20 μmol/L 5 μmol/L（图 1），Bst DNA
聚合酶（8 U/μL）1 μL，dNTP（10 mmol/L）3 μL（图
2），Mg2+ 浓度为 25 mmol/L 4.0 μL（图 3）。确定的最
佳反应体系为 ：FIP&BIP（20 μmol/L）1 μL，F3&B3
（5 μmol/L）1 μL，Bst DNA 聚 合 酶（8 U/μL）1 μL，
dNTP（10 mmol/L）3 μL，MgCl2（25 mmol/L）4 μL，
最后加灭菌去离子水补足 25 μL。
2.2 LAMP反应温度和反应时间的优化结果
通过对 LAMP 反应温度和反应时间进行优化试
验，确定最佳反应温度为 62℃（图 4），最佳反应时
M. DNA 分子质量标准 ；1-6. 60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃
图 4 退火温度的优化
M. DNA 分子质量标准 ；1-5. 内外引物浓度比分别为 20 μmol/L
5 μmol/L，40 μmol/L 5 μmol/L，60 μmol/L 5μmol/L，80 μmol/L
5 μmol/L，100 μmol/L 5 μmol/L
图 1 引物浓度的优化
M. DNA 分子质量标准 ；1-5. Bst DNA 聚合酶（8 U/μL）的加入量分别为
0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 μL；6-9. dNTP（10 mmol/L）的加入量分别为 0.5，
1.0，2.0，3.0，4.0 μL
图 2 Bst DNA 聚合酶及 dNTP 浓度的优化
M. DNA 分子质量标准 ；1-5. MgCl2（25mmol/L）的加入量分别为
1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 μL
图 3 Mg2+ 浓度的优化
2000
bp
1 2 3 4 5 M
1000
750
250
500
100
1 2 3 4 5 M 76 8 9
2000
bp
1000
750
250
500
100
1 2 3 4 5 M
4000
bp
1000
800
200
600
400
1 2 3 4 5 6 M
2000
bp
1000
750
100
500
250
M 1 2 3 4 5
M. DNA 分子质量标准 ；1-5. 分别为 15, 30, 60, 90, 120 min
图 5 反应时间的优化
间为 60 min（图 5）。
2012年第11期 153鲜思美等 ：鹅副黏病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用
2.3 RT-LAMP方法的特异性和敏感性试验
以优化的 RT-LAMP 方法对 GPMV、DPV、GPV-
GZ1、GPV-GZ2、MDPV、DHV、S.anatamu、RA、
MDV、IBV 的 DNA 或 cDNA 进 行 扩 增， 结 果（ 图
6）显示，只有 GPMV 出现了特征性梯状条带，而
其他模板未见扩增条带，表明该方法特异性好。以
GPMV RNA 反转录的 cDNA 为模板，经 TU-1810 测
定 OD260nm/OD280nm 比值为 1.874，纯度符合一般试验
要求。计算样本 cDNA 的含量为 9.5×10-3 μg/μL。建
立 RT-LAMP 方法最低检测到 10-6 稀释模板，即为 9.5
fg cDNA 模板（图 7）。
2000
bp
1000
750
100
500
250
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
图 6 RT-LAMP 方法的特异性试验
M. DNA 分子质量标准 ；1-11. 分别为 GPMV，阴性对照，DPV，GPV-GZ1，
GPV-GZ2，MDPV，DHV，S.anatamu，RA，MDV 和 IBV
M. DNA 分子质量标准 ；1-8. 模板 cDNA 的稀释度分别为 100，
10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7 和 10-8
图 7 RT-LAMP 方法的敏感性试验
M. DNA 分子质量标准 ；1-9. 模板 cDNA 的稀释度分别为 100，10-1，
10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7 和 10-8
图 8 RT-PCR 方法的敏感性试验
2000
bp
1000
750
100
500
250
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
2.4 RT-LAMP与RT-PCR敏感性的比较
采 用 2 条 外 引 物（GPMV-F3 和 GPMV-B3） 建
立的 RT-PCR 方法的敏感性结果（图 8）显示，RT-
PCR 方法能检测到 cDNA 的最低稀释度 10-3，而 RT-
LAMP 方法能检测到 cDNA 的最低稀释度 10-6，表明
RT-LAMP 的敏感性比 RT-PCR 高 1 000 倍。
2.5 RT-LAMP方法对临床样本的检测
应用建立的 RT-LAMP 方法对 6 份临床病料进
行检测，结果（图 9）显示，GPMV 检出率为 100%
（6/6），与 RT-PCR 的检出结果相符，二者的检出符
合率为 100%。
2000
bp
1000
750
100
500
250
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
2000
bp
1000
750
100
500
250
M 1 2 3 4 5 6 7 8
M. DNA 分子质量标准 ；1-6. 疑似样本 ；7. 阴性对照 ；8. 阳性对照
图 9 临床样本的 RT-LAMP 检测
2.6 RT-LAMP反应结果的可视化判定
LAMP 反 应 完 成 后， 产 物 7 500 r/min 离 心 5
min，然后将离心管置于光亮处观察有无白色沉淀生
成，结果如图 10 所示。
ⲭ㢢⊹⏰
1 2
1. 阴性对照 ；2. 阳性对照
图 10 RT-LAMP 反应结果的可视化鉴定
从图 10 中可以看出，1 号管为阴性组，未见到
沉淀；2 号管为阳性组，肉眼可看到明显的白色沉淀。
因而可以直接观察反应是否发生。
3 讨论
鹅副黏病毒病是由禽副黏病毒 I 型病毒引起鹅
的烈性传染病，是现代集约化养鹅业的主要疫病。
虽然目前有检测 GPMV 的多种方法报道，如酶联
免疫吸附试验（ELISA）、RT-PCR 和实时荧光定量
PCR（RTFQ-PCR）等，但这些方法在成本、灵敏度、
操作的方便性上有缺陷，在一定程度上限制它们在
生产中的实际应用。环介导等温核酸扩增（LAMP）
技术作为一种新的核酸扩增技术，已在病原检测中
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期154
可视化 RT-LAMP 方法，适合用于临床鹅副黏病毒病
的诊断和 GPMV 的快速检测。
参 考 文 献
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白血病病毒 . 畜牧兽医学报 , 2011, 42（1）: 150-156.　
（责任编辑 马鑫）
受到青睐和应用。建立 LAMP 方法的关键是引物设
计。LAMP 技术主要是利用 Bst DNA 聚合酶在等温条
件下（60-65℃）使内引物反复与目标序列进行配对、
延伸 - 置换、再配对、再延伸 - 置换的过程。因此，
对引物，特别是内引物的长度、内引物之间的距离、
G+C 含 量、Tm 值 等 都 有 严 格 的 要 求
［11］。 本 试 验
根据 GPMV 保守序列结构蛋白 F 基因，采用在线
Primer Explorer 3.0 软件设计了 4 条引物，所设计的
引物能特异识别目标序列的 6 个区域，特异性扩增
GPMV 的靶基因，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产
物为大小不同的梯状条带，表明该方法的特异性强。
应用于鹅副黏病毒病诊断的分子生物学技术有
RT-PCR 和 RTFQ-PCR 等。RT-PCR 技 术 能 快 速 准
确地对鹅源 APMV-1 进行全方位诊断，并且可以直
接对感染组织和含毒尿囊液进行检测，能在数小时
内鉴定出病毒并作出毒力测定。本试验建立的 RT-
LAMP 方法敏感性比传统 RT-PCR 高 1 000 倍，两种
方法对临床样本检测的符合率为 100%。RTFQ-PCR
技术与传统检测技术相比具有更明显的优势，但不
能监测扩增产物的大小。各实验室所用的生成标准
曲线的样品各不相同，致使试验结果缺乏可比性。
技术设备要求较高，荧光探针价格昂贵［12］。LAMP
方法不需要 DNA 的变性，核酸扩增在等温的条件下
进行，因此在试验中仅仅需要一个水浴锅或加热装
置即可，不需要昂贵的 PCR 仪。扩增 RNA 只要在
DNA 基因扩增试剂的基础上加上逆转录酶，就能够
完全实现一步扩增［13］。
LAMP 技术的研究主要集中在产物检测的方便
性和反应速度上，以便更好地应用于基层临床诊
断。LAMP 扩增之后，可以直接在产物中加入 SYBR
Green I 染色，肉眼判定结果［14］。也可通过扩增副
产物焦磷酸镁沉淀变化直接观察反应结果。本试验
在反应结束后，直接瞬时离心，LAMP 的副产物焦
磷酸镁悬浊液形成白色沉淀，阳性反应管白色沉淀
集于管底，阴性反应管无此现象，由此可见 LAMP
反应结果易于判定，适合于基层检测。
4 结论
建立了在恒温（62℃）条件下，60 min 内可对
鹅副黏病毒核酸进行高效扩增并可肉眼判定结果的