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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
革兰氏阴性细菌的细胞壁有两层膜——外膜和
内膜，外膜上有许多的外膜蛋白，其中包括外膜 A
蛋白、孔蛋白和脂蛋白等［1］。外膜蛋白处于最外层
外膜上，它参与了多项生理功能，包括具有让外界
物质进入的通道功能、帮助细菌摄取铁离子、参与
革兰氏阴性细菌感染的粘附和炎症、激发宿主产生
免疫保护性等生理功能，对于细菌适应外界环境和
形成致病能力至关重要［2］。
NmpC 蛋白质是一种外膜孔蛋白，组成磷脂双
收稿日期 ：2013-01-26
基金项目 ：福建省自然科学基金项目（2010J05088），漳州市自然科学基金项目（zz2012J05）
作者简介 ：张丹凤，女，副教授，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：zh_danfeng@163.com
大肠杆菌 nmpC 基因的快速敲除
张丹凤1 陈国平2 华秀庭1 陈阳1
（1. 漳州师范学院生物科学与技术系，漳州 363000 ；2. 漳州市农业局种植业管理站，漳州 363000）
摘 要 : 旨在利用 Red 重组系统和 Xer 重组系统获得大肠杆菌 NmpC 外膜蛋白基因删除菌株。采用 PCR 扩增 nmpC 基因片段，
构建 pMD-nmpC 载体，EcoR I 酶切并经 Pfu 补平酶切缺口后与 difGm 片段连接，得到重组质粒 T-nmpC∷difGm，PCR 扩增获得突变
盒 nmpC：：difGm，电转化突变盒片段入大肠杆菌细胞，PCR 扩增验证是否获得没有抗性标记的 ΔnmpC 基因删除菌株。结果显示，
成功构建了重组质粒 T-nmpC∷difGm，在 Red 重组酶和 Xer 重组酶的介导下，进行同源重组和抗生素标记去除，并经 PCR 验证得
到 ΔnmpC 基因删除菌株。首次成功获得大肠杆菌 ΔnmpC 无抗生素标记基因删除菌株，该基因删除菌株可为深入研究 NmpC 的功
能提供研究基础。
关键词 : Red 重组系统 Xer 重组系统 大肠杆菌 NmpC
Rapid Deletion of nmpC Gene in Escherichia coli Chromosome
Zhang Danfeng1 Chen Guoping2 Hua Xiuting1 Chen Yang1
（1. Department of Biological Sciences and Biotechnology，Zhangzhou Normal University，Zhangzhou 363000 ；2. Planting Management
Station，Zhangzhou Agriculture Bureau，Zhangzhou 363000）
Abstract: It was to obtain the nmpC deleted strain of E. coli by using both Red and Xer recombination system. The sequence of nmpC
from E. coli K-12 BW25113 was first amplified by PCR then inserted into pMD-18 vector to obtain pMD-nmpC. This vector was then digested by
EcoR I and Pfu DNA polymerase was used to create blunt ends after digestion, following ligation with difGm fragment to form T-nmpC∷difGm
recombinant. nmpC∷difGm was then amplified by PCR and transformed into E. coli by electroporation, following PCR analysis to confirm the
designate ΔnmpC strain of E. coli without antibiotic resistance gene was obtained. Results showed the recombinant vector T-nmpC∷difGm was
successfully constructed using a process mediated by Red and Xer recombination system. nmpC gene was deleted by homologous recombination
and selectable marker was removed from experiment strain, which was confirmed by PCR. The ΔnmpC strain of E. coli without antibiotic
resistance gene was obtained for the first time. This strain would be a promising tool for further investigating the function of NmpC outer
membrane protein.
Key words: Red recombination system Xer recombination system E. coli NmpC
分子层中的微孔通道，可选择性地促进亲水分子通
过革兰氏阴性细菌的外膜［3］。大肠杆菌 K-12 △ ompF
和 △ ompC 突 变 株 中 NmpC 的 表 达 量 增 加［4］；进
一步研究表明，大肠杆菌中 NmpC 蛋白质可以取
代 OmpF 或者 OmpC 的功能，NmpC 的表达会降低
OmpF 和 OmpC 孔蛋白的表达量［5］。同时大肠杆菌
NmpC 和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）
中 NmpC 类似蛋白 OmpD 与 OmpN 蛋白功能极其相
似［6］。NmpC 还是一种新发现的与大肠杆菌耐药、
2013年第5期 161张丹凤等 ：大肠杆菌 nmpC 基因的快速敲除
耐热相关的外膜蛋白质［7，8］。除此之外，NmpC 蛋
白的表达受到 TolC 蛋白表达和 nmpC 启动子 DNA 成
环的调控［9，10］。从蛋白质水平可以更充分地研究蛋
白质的功能，但是目前还未见从基因删除的角度来
进一步探讨 NmpC 蛋白质的功能。因此，基于 Red
重组系统和 Xer 重组系统构建了无标记的 ΔnmpC
基因删除菌株，旨在为深入探讨 NmpC 的功能及其
分子机制奠定良好的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 大肠杆菌 K-12 BW25113 为本实
室保存菌种 ；质粒 pKD46（温度敏感型，含有阿拉
伯糖启动子调控的 gam、bet 和 exo 基因，Ampr）和
pSK-difGm（含有两边带有 dif 位点［11］的庆大霉素
抗性基因、Ampr 和 Gmr）均购于江苏锐阳生物科技
有限公司。质粒 pMD18-T simple vector 购于 TaKaRa
宝生物（大连）公司。
1.1.2 试剂和引物 Taq 和 Pfu DNA 聚合酶、连接
酶 solution I、EcoR I 和 Hind III 限制性内切酶、质
粒提取、纯化试剂盒和胶回收试剂盒为均为 TaKaRa
宝生物（大连）公司产品。抗生素庆大霉素和氨苄
青霉素购于上海生工生物工程股份有限公司。大肠
杆菌基因删除试剂盒购于江苏锐阳生物科技有限
公司。本研究所用引物序列如表 1 所示。
回收。
1.2.2 nmpC 基因删除用线性化 DNA 片段的制备
将 胶 回 收 的 nmpC 片 段， 通 过 连 接 酶 solution I 与
pMD18-T simple vector 进 行 连 接， 转 化 大 肠 杆 菌
DH5α，提取质粒，经 Hind III 单酶切验证，获得重
组质粒 pMD-nmpC。该重组质粒用 EcoR I 酶切，切
除 nmpC 片段中 150 bp 片段，经电泳胶回收目的片
段 pMD-nmpC1。进一步通过 Pfu DNA 聚合酶补平
pMD-nmpC1 酶切切口，乙醇沉淀回收目的片段。补
平后的目的片段用碱性磷酸酶 CIAP 进行去磷酸化
得到 pMD-nmpC2，防止平末端发生自身连接。Sma
I 酶切 pSK-difGm，获得 difGm 片段。difGm 片段与
pMD-nmpC2 连接，构建重组质粒 T-nmpC∷difGm。
经 Hind III 单酶切验证，获得含有突变盒的重组质
粒 T-nmpC∷difGm。
1.2.3 突变盒片段的 PCR 扩增 将含有突变盒片段
的重组质粒 T-nmpC∷difGm 用 Hind III 酶切线性化，
电泳回收线性的重组质粒片段，去除环形质粒。以
该片段为模板，利用引物 nmpC1 和 nmpC2 PCR 扩
增获得突变盒 nmpC∷difGm，胶回收 PCR 产物获得
高浓度突变盒片段。
1.2.4 电转化突变盒片段入大肠杆菌细胞 通过
CaCl2 转化法将 pKD46 转化大肠杆菌 K-12 BW25113。
将含有 pKD46 的大肠杆菌 K-12 BW25113 接种于 LB
平板，30℃培养 24 h。挑取单菌落接种于 50 mL LB
液体培养基，30℃条件下 200 r/min 过夜培养。取
0.5 mL 培养液接种于 50 mL 含有氨苄青霉素（100
μg/mL）和 2 mmol/L L-阿拉伯糖的新鲜 LB 液体培养
基，30℃、200 r/min 培养至 A600 值约为 0.7。将培
养液迅速置于冰上冷却 20 min，4℃、4 000 r/min 离
心 10 min 收集菌体。倾倒培养基，并轻柔地将菌体
重新悬浮于 20 mL 预冷的 10%（V/V）甘油溶液中，
离心收集菌体，并将菌体重悬于 20 mL 预冷的 10%
（V/V）甘油溶液中，并重复该步骤 2 次，将上清液
倾倒，并将菌体用残留的约 100 μL 10%（V/V）甘
油溶液重悬。轻柔地将 50 μL 菌体溶液与 35 μL 纯
化后的突变盒 PCR 产物混合，置于 0.1 cm 预冷的电
转杯中，电转仪 1.8 kV 进行电击，电击时间为 4-5
ms。迅速加入 1 mL 含有 1 mmol/L L-阿拉伯糖的 LB
液体培养基，将菌液在 37℃培养 1 h 后，涂布于含
表 1 PCR 扩增所用引物
引物名称 序列（5-3） 酶切位点
nmpC1 CCCAAGCTTCACCTTCCTTAGTGA Hind III
nmpC2 AATGGCGATGTCTGCTCAGG
nmpC3 CTGCTGTAGCTGCATCAGTACTAA
Gm1 GGTGCGCATAATGTATATTATGTTAAAT
1.2 方法
1.2.1 PCR 扩 增 nmpC 片 段 提 取 大 肠 杆 菌 K-12
BW25113 基 因 组， 利 用 引 物 nmpC1 和 nmpC2 进
行 PCR 扩 增，PCR 体 系 为 ：基 因 组 DNA 2 μL、
2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 2 μL、25
mmol/L nmpC1和nmpC2各 0.3 μL、Taq DNA 聚合酶 0.4
μL、10× 缓冲液 5 μL 和 ddH2O 36 μL ；扩增程序为 ：
95℃ 5 min ；94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 75 s，共
30 个循环 ；72℃ 10 min。取 PCR 产物进行电泳和胶
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期162
有庆大霉素（30 g/mL）的 LB 固体培养基上筛选重
组菌株。
1.2.5 阳性转化子的验证 挑取庆大霉素抗性筛选
获得的转化子，利用引物 Gm1 和 nmpC3 进行菌落
PCR 验证大肠杆菌 K-12 BW25113 和重组菌株，获
得阳性转化子。
1.2.6 Xer 重组酶系介导的庆大霉素抗性基因的去
除 将阳性转化子接种于 LB 液体培养基，37℃培养
12 h，然后转接于新鲜 LB 液体培养基继续培养 12 h。
稀释培养液至适当浓度，涂布 LB 平板，37℃培养。
挑取单菌落同时点种于含庆大霉素的固体 LB 平板
和不含庆大霉素的普通固体 LB 平板，挑选庆大霉
素抗性丢失的转化子（在 dif 位点进行了 Xer 重组的
细胞失去了庆大霉素抗性），并用 nmpC1 和 nmpC2
引物进行进一步的菌落 PCR 扩增验证，最终获得没
有抗生素标记的基因删除菌株。
2 结果
2.1 试验方案设计
经 Vector NTI 软件分析 nmpC 基因内部有 2 个
EcoR I 位点，2 个位点中间有 150 bp 的碱基序列，
通过酶切去除这 150 bp 碱基，并经 Pfu 补平后与
经 Sma I 酶切获得的 difGm 片段进行连接。在 2 个
EcoR I 位点外围各扩增 500 bp 碱基作为同源臂用于
整合，在 Red 重组酶的作用下进行双交换，将目的
基因替换，进一步在自身 Xer 重组酶的介导下，进
行 2 个 dif 位点的重组将抗生素标记基因去除。
2.2 重组质粒pMD-nmpC的构建
利 用 引 物 nmpC1 和 nmpC2 对 nmpC 进 行 PCR
扩增，获得与预期 1 016 bp 的片段大小相当的目
的 片 段， 结 果 如 图 1-A 所 示。 将 该 目 的 片 段 与
pMD18-T simple vector 进行连接，获得 pMD-nmpC 重
组质粒，重组质粒图谱如图 2-A 所示。提取 pMD-
nmpC 重组质粒，经 Hind III 酶切，图 1-B 第 2 泳道
显示酶切片段大小约为 3 703 bp，成功获得了含有
nmpC 基因片段的重组质粒。
2.3 重组质粒T-nmpC∷difGm的构建
大 量 提 取 pMD-nmpC， 利 用 EcoR I 酶 切 去
除 nmpC 基 因 中 150 bp 的 片 段， 得 到 约 3.6 kb 的
pMD18-nmpC1 片段（图 1-B 第 3 泳道）。Sma I 酶切
pSK-difGm，获得 difGm 片段，difGm 片段与去磷酸
化的、补平酶切切口的 pMD18-nmpC2 连接，获得重
组质粒 T-nmpC∷difGm，其物理图谱如图 2-C 所示。
用 Hind III 对 T-nmpC∷difGm 进行单酶切，如图 3-A
所示获得大小为 4 585 bp 的目的条带，与预期大小
一致。
2.4 nmpC∷difGm的PCR 扩增
用 Hind III 对 T-nmpC∷difGm 重组质粒进行酶
切，进行胶回收，获得线性化的 T-nmpC∷difGm。
以此目的片段为模板，通过引物 nmpC1 和 nmpC2
进行 PCR 扩增获得突变盒 nmpC∷difGm，获得大
小约 1 900 bp 的目的条带，与预计的片段大小相当
（图 3-B）。
2.5 ΔnmpC基因删除菌株的鉴定
胶回收突变盒 nmpC∷difGm，获得高浓度的纯
化的突变盒，将其电转化入大肠杆菌 K-12 BW25113
细胞中。庆大霉素抗性筛选获得的转化子，通过引
物 Gm1 和 nmpC3 经菌落 PCR 验证确认，获得片段
大小约 1.2 kb 的目的片段（图 4 第 1 泳道）。依次传
代去除庆大霉素抗性和 pKD46，获得不具有庆大霉
素抗性的目标菌株。经菌落 PCR 验证（引物 nmpC1
和 nmpC2）只获得大小约 850 bp 的片段（图 4 第 5
泳道）。结果显示，成功获得了 ΔnmpC 基因突变无
标记菌株。
3 讨论
基因删除技术是一种从分子水平上定向改变生
物活体遗传信息的试验手段，对于研究基因和蛋白
功能等生命科学的重大问题十分重要。基于 λ 噬菌
5000
1500
1000
4749
bp
M 1 M 2
A B
3
bp
2838
750
M ：DNA Marker ；1 ：nmpC PCR 扩 增 产 物 ；2 ：pMD-nmpC 经 Hind III
酶切产物 ；3 ：pMD-nmpC 经 EcoR I 酶切产物
图 1 nmpC 基因 PCR 扩增片段（A）及 pMD-nmpC
重组质粒（B）
2013年第5期 163张丹凤等 ：大肠杆菌 nmpC 基因的快速敲除
体 Red 重组酶作用的同源重组技术逐渐成为基因工
程研究的热点之一，BaBa 等［12］利用这种方法，已
经对大肠杆菌 K-12 中 3 985 个目的基因进行删除，
并由此建立起新的大肠杆菌基因库（http ：//ecoli.
aist-nara.ac.jp/）。但是该方法在去除抗生素标志时，
需要进行带有相应重组酶基因的外源质粒的转化，
使试验周期延长。Bloor 等［11］采用 Red 重组系统 -Xer
重组系统，实现靶基因重组后抗生素标记高效删
除，方法简便。目前该技术已经在多种微生物细胞
成功获得无抗生素标记的基因删除菌株，包括大肠
杆菌、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）、分枝杆菌
（Mycobacteria） 和 枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus subtilis）
Sca I 3197
Amp R
pMD18-nmpC(part)
3 703 bp
Hind III 430
nmpC part
EcoR I 1079
Cla I 1143
EcoR I 1235
A
Sca I 3041
Amp R
Hind III 430
nmpC1
pMD18-nmpC fragment
3 547 bp
EcoR I 1079
nmpC2
B
Sca I 4079
Amp R
pMD18-nmpC-difGm
4 585 bp
nmpC1
Cla I 1095
Cla I 1248
EcoR V 1264
difGm
EcoR I 2117
nmpC2
C
Hind III 430
图 2 重组质粒物理图谱
4797
bp
M 1
2838 2140
bp
M 2
1700
A B
M ：DNA Marker ；1 ：T-nmpC∷difGm 经 Hind III 酶切产物 ；
2 ：nmpC∷difGm PCR 产物
图 3 T-nmpC∷difGm 酶切（A）及 nmpC∷difGm
PCR 扩增（B）产物
11501
1 2 3 4 5M
bp
1159
805
M ：DNA Marker ；1-4 ：E.coli K-12 BW25113（ΔnmpC∷difGm） PCR
扩增产物 ；5 ：ΔnmpC PCR 扩增产物
图 4 nmpC 基因删除转化子 PCR 鉴定电泳图谱
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期164
等［13，14］。本研究运用该技术利用大肠杆菌细胞中自
身 Red 重组系统 -Xer 重组系统，通过 PCR 验证获
得无抗生素标记的基因删除菌株 ΔnmpC。NmpC 的
表达量与 OmpF 和 OmpC 的表达呈负相关［4，5］，期
望利用该基因删除菌株来深入探讨 NmpC 的缺失表
达对 OmpF 和 OmpC 表达的影响，甚至与调控 OmpF
和 OmpC 表达的 EnvZ/OmpR 双调节系统之间的关
系。NmpC 是新发现的与大肠杆菌适应逆境的外膜
蛋白［7， 8］，通过 ΔnmpC 可以进一步验证它在大肠
杆菌耐受不利环境过程中的作用，及与其它相关功
能蛋白间错综复杂的网络关系，均将促进 NmpC 外
膜蛋白功能的阐明。
4 结论
首次成功地在大肠杆菌 Red 重组系统和 Xer 重
组系统的介导下，获得大肠杆菌 ΔnmpC 无抗生素
标记基因删除菌株，该基因删除菌株将有利于进一
步探讨 NmpC 在大肠杆菌不同生理过程的作用及其
它功能。
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（责任编辑 马鑫）