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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):115-123
收稿日期 ：2014-12-25
基金项目 ：国家海洋公益性行业科研专项（201205028），广东省海洋经济创新发展区域示范专项（GD2012-A01-007，GD2012-A02-003），
广东省教育厅创新计划专项（2012KJCX0063），广西科技厅科技计划（桂科攻 1222013-2）
作者简介 ：韩洪波，男，硕士研究生，研究方向 ：鱼类种子工程与增养殖 ；E-mail ：476450062@qq.com
通讯作者 ：陈刚，男，教授，研究方向 ：鱼类种子工程与增养殖 ；E-mail ：cheng@gdou.edu.cn
卵形鲳鲹耐低温候选基因△6FAD 全长 cDNA 序列的
克隆与表达分析
韩洪波1  王忠良1，2，3  陈刚1，2，3  汤保贵1，2，3  张健东1  黄建盛1   
周晖1  施纲1  潘传豪1
（1. 广东海洋大学水产学院，湛江 524088 ；2. 广东省普通高校 南海水产经济动物增养殖重点实验室，湛江 524088 ；3. 广东省水产经济动
物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088）
摘 要 ： 采用 cDNA 末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）技术克隆了卵形鲳鲹△ 6 脂肪酸去饱和酶
（△ 6FAD）的 cDNA 全长序列，并对其基因和蛋白序列结构特征进行了生物信息学分析，同时采用实时荧光定量 PCR（Real-time
PCR）技术分析了该基因在不同温度条件下的表达差异及低温下的时序表达模式。结果显示，卵形鲳鲹△ 6FAD 基因 cDNA 序列全
长 1 908 bp，其中开放阅读框为 1 329 bp，3 非编码区 431 bp，5 非编码区 135 bp，共编码 442 个氨基酸 ；其编码蛋白属于疏水性
蛋白，无信号肽特征，含有大量蛋白质二级结构和该家族典型的组氨酸富集区及细胞色素 b5 结构域。系统进化分析表明，卵形鲳
鲹△ 6FAD 基因与尖吻鲈、军曹鱼的△ 6FAD 基因在进化关系上最为接近，其次是大菱鲆、蓝鳍金枪鱼和点带石斑鱼，但与斑马鱼、
小鼠和人△ 6FAD 基因进化关系较远。实时荧光定量 PCR 结果表明，该基因的表达与环境温度和胁迫时间存在明显相关性，其表
达水平在降温过程中随温度降低而先缓慢下降后又迅速升高，在不同的低温环境下表现出不同的时序表达模式 ：13℃时，随时间
延长该基因的表达量呈现先降低后又升高至原来水平的变化趋势，16℃和 19℃时则表现出一种随时间延长逐渐降低的反馈式调节
方式。
关键词 ： 卵形鲳鲹；△ 6 脂肪酸去饱和酶 ；cDNA 克隆 ；低温胁迫
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.017
Cloning and Expression Analysis of Full-length cDNA Sequence of a
Low Temperature Resistant Candidate Gene △6FAD in
Trachinotus ovatus
Han Hongbo1 Wang Zhongliang1，2，3 Chen Gang1，2，3 Tang Baogui1，2，3 Zhang Jiandong1 Huang Jiansheng1
Zhou Hui1 Shi Gang1 Pan Chuanhao1
（1. Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088 ：2. Key laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquatic
Economic Animals，Regular Higher Education Institute of Guangdong Province，Zhanjiang 524088 ；3. Guangdong Provincial Key Laboratory
of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088）
Abstract: The full-length cDNA of delta 6 fatty acid desaturase（△6FAD）in Trachinotus ovatus was cloned by RACE（Rapid
Amplification of cDNA Ends）, and the sequence structure of the gene and protein was determined through bioinformatics analysis. RT-PCR
（Real-time PCR）was employed to analyze its expression differences in tissues under different temperatures and the expression patterns in low
temperature. Ultimately, the results indicate that full length of cDNA sequence of △6FAD in T. ovatus is 1 908 bp, of which has 3 non-coding
region 431 bp, 5 non-coding region 135 bp, and open reading frame 1 329 bp that encodes 442 amino acids. The protein is hydrophobic without
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7116
卵 形 鲳鲹（Trachinotus ovatus） 隶 属 于鲹科
（Carsngidae）鲳鲹属（Trachinotus），为暖水性鱼类。
近年来，随着人工育苗的成功和养殖技术日趋成熟，
卵形鲳鲹的人工养殖在华南沿海地区迅速展开，成
为海水鱼类养殖的主要品种之一。卵形鲳鲹属于温
水型鱼类，低温环境将对卵形鲳鲹的养殖生产产生
极大的影响，限制着卵形鲳鲹养殖业的发展。目前
有关低温应激对卵形鲳鲹血清生化、免疫指标、激
素的影响已开展研究［1］，但关于卵形鲳鲹耐低温候
选基因的筛选及全长克隆和低温胁迫对其表达量的
影响尚未见报道。
鱼类的耐低温性状是一种重要的经济性状，也
是一种数量性状，受微效多基因控制［2］。研究表明，
鱼类在遭遇冷胁迫时为了保持生理稳态不被破坏，
通过提高细胞膜上不饱和脂肪酸的比例来增加细胞
膜的流动性，维持细胞在低温下的生理活性［3］。低
温环境下磷脂中不饱和脂肪酸（特别是 DHA）的积
累是膜流动性对于温度适应的一种表现［4］，控制脂
肪酸去饱和反应，提高不饱和脂肪酸含量可以改善
鱼类的抗寒性［5］。因此，细胞膜脂肪酸的脱饱和是
鱼类在低温胁迫下的重要适应机制［6］。鱼类△ 6 脂
肪酸去饱和酶（△6FAD）是参与鱼类多不饱和脂肪
酸（PUFA）生物合成的关键酶，大量研究证明，营
养因素和环境因素会影响鱼类 PUFA 生物合成关键
酶基因的表达水平，进而影响鱼类高度不饱和脂肪
酸的合成［7］。多不饱和脂肪酸，尤其是二十二碳六
烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）作为鱼类的
必须营养素在维持生命体的正常机能，促进生长、
发育、繁殖和提高成活率等方面发挥着不可替代的
生理作用。有关脂肪酸去饱和酶基因家族与植物抗
冷性状的研究目前已有大量的研究，如白云豆［8］及
油菜［9］的 SAD（硬脂酰 -ACP 去饱和酶）和橄榄［10］、
马齿苋［11］的 FAD（脂肪酸去饱和酶）在转录水平
均受低温调节，但与水生生物抗寒性的研究还较少。
本研究克隆卵形鲳鲹△6FAD cDNA 的序列全
长，并对该基因进行生物信息学分析，同时研究低
温胁迫下卵形鲳鲹肝脏组织中该基因的表达模式，
旨在为探究卵形鲳鲹多不饱和脂肪酸的合成机制及
与温度调节的关系提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 实验用鱼来自广东海洋大学东海
岛海洋生物研究基地。鱼体健康，活力良好的卵形
鲳鲹（约 30 g）共 195 尾，分为 5 个实验组和 1 个
对照组，每组 3 个平行，在温控循环水族箱中暂养
一周后用于实验。
1.1.2 主要仪器和试剂 Trizol 购自北京全式金生
物 有 限 公 司。M-MLV Reverse Transcriptase、Oligo
（dT）18、dNTP、Ribonuclease Inhibitor、DNA Marker、
pMD18-T Vector 均 购 自 TaKaRa 公 司。UNlQ-10 柱
式 Trizol 总 RNA 抽提试剂盒、UNIQ-10 柱式微量琼
脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒购自上海生工生物有限
公司 ；3-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase
和 5-Full RACE Kit with TAP 试剂盒均购自 TaKaRa
公 司 ；F-416XL DyNAmo ColorFlash SYBR 和 AB-
1182 ABgene Strips of 8 Tub 购 自 美 国 Thermo Fisher
Scientific 公司，PCR 仪为 Bio-Rad 公司和 TaKaRa 公
司。荧光定量 PCR 仪为美国 ABI 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 低温处理 实验期间每天投喂商品饲料两次，
实验开始后采用 3℃/d 的降温方式对实验组从常温
signal peptide, and containing abundant protein secondary structure, typical histidine cluster motifs in this family, and cytochrome b5 domain.
Phylogenetic results from the BLAST protein database reveal that the deduced amino acid sequence of △6FAD of T. ovatus is highly homologous
with Lates calcarifer and Rachycentron canadum ：lowly homologous with Scophthalmus maximu, Thunnusthynnus and Epinephelus coioides ：
but little homologous with Danio rerio, Mus musculus and Homo sapiens. RT-PCR results manifest that gene expression of △6FAD is significantly
correlated with temperature and stress time in environment, the expression level of the gene at first slowly decreases, then rapidly rises as
temperature lowering in the experiment of temperature gradient. However, there is different expression pattern in different low-temperature
environment ：for example, at 13℃ the gene expression of △6FAD increases to its original level after first decreasing with time ：and while at
16℃ and 19℃ it is gradually decreasing with time, i.e., feedback adjustment way.
Key words: Trachinotus ovatus ；delta 6 fatty acid desaturase ；cDNA cloning ；low temperature stress
2015,31(7) 117韩洪波等 ：卵形鲳鲹耐低温候选基因△6FAD 全长 cDNA 序列的克隆与表达分析
28℃开始进行降温处理直至分别降到预先设定的实
验温度 25℃、22℃、19℃、16℃和 13℃，对照组则
保持 28℃的恒温。实验组卵形鲳鲹在各实验温度下
分别喂养 0、12、24、36、48、60、72 和 84 h 后随
机采样，取肝脏组织储存于液氮中用于后续实验。
1.2.2 卵形鲳鲹△ 6 脂肪酸去饱和酶 cDNA 全长序
列的克隆
1.2.2.1 总 RNA 的提取 取于 -80℃保存的卵形鲳
鲹肝脏组织 50-100 mg，按照上海生工的 UNlQ-10
柱式 Trizol 总 RNA 抽提试剂盒中推荐的方法提取、
纯化总 RNA，提取的总 RNA 样品经过微量核酸定
量仪测定其 OD260/OD280 值。
1.2.2.2 中间片段的获取 按 TaKaRa 公司 M-MLV
Reverse Transcriptase 说 明 书 步 骤 将 上 述 提 取 的 总
RNA 进行 RT 反应，随后应用基于其他物种△ 6 脂
肪酸去饱和酶基因序列设计的特异性引物 PCR 扩增
卵形鲳鲹△ 6FAD 的中间片段。PCR 扩增条件为 ：
94℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，
72 ℃延伸 45 s，32 个循环。最后得到大小为 300
bp 左右的 PCR 产物，产物经切胶回收纯化后克隆
到 pMD18-T Vector 上，并转化到感受态细胞 E.coli
DH5α 中，经菌落 PCR 鉴定，挑选阳性克隆后送上
海生工测序。
1.2.2.3 卵形鲳鲹△ 6FAD 的 3 和 5RACE 根据同
源克隆获得的△ 6FAD 大小为 303 bp 的中间片段，
设计用于 3 和 5 序列全长扩增的特异性引物（表
1）。按照 TaKaRa 公司的 3-Full RACE Core Set with
PrimeScriptTM RTase 试剂盒要求，分别进行 3RACE
和 5RACE 扩增。3RACE 首轮和次轮 PCR 反应条
件分别为 ：94℃预变性 3 min ；94℃变性 30 s，55℃
退火 30 s，72℃延伸 1 min 55 s，共 25 个循环 ；94℃
预变性 3 min，94℃变性 30 s，55℃退火 30s，72℃
延伸 1 min 55 s，共 30 个循环。5RACE 第一轮和第
二轮 PCR 退火温度分别为 ：55.8℃和 57.8℃，PCR
程序同上。随后，纯化 RACE-PCR 产物并进行克隆
和测序。
1.2.2.4 卵形鲳鲹△ 6FAD 生物信息的预测 采用
ORF Finder（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.
html）和 protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）
确定开放阅读框（ORF）并预测由该阅读框编码蛋
白的分子量计算值（Mw）和理论等电点（pI）；通
过 在 线 分 SignalP 4.1 Server（http ：//www.cbs.dtu.dk/
services/SignalP）预测信号肽序列 ；以 TMHMM 在线
服 务 器（http ：//cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0） 预
测该编码蛋白中存在的跨膜结构域 ；应用在线预测
软件 SOPMA（https ：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_
automat.pl?page=npsa_sopma.html） 和 PredictProtein
（http ：//www.predictprotein.org/）预测蛋白二级结构。
应 用 Prosite（http ：//prosite.expasy.org/） 和 NCBI 的
CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.
cgi）工具预测蛋白质结构域、家族和功能位点 ；氨
基酸序列同源性分析和系统进化树的构建分别采用
Vector NTI 11 和 MEGA6 软件。
1.2.3 实时荧光定量 PCR 分析 将低温胁迫处理下
采集的肝脏组织进行 RNA 的提取，并通过琼脂糖
凝胶电泳和微量核算定量仪检测其总 RNA 的完整
性、OD 值和浓度。在检测卵形鲳鲹△ 6FAD 在两种
低温胁迫处理下的表达水平前，先将提取的所有样
品总 RNA 进行反转录成 cDNA，再按照 Thermo 公
司的 F-416XL DyNAmo ColorFlash SYBR 试剂盒使用
说明，采用 SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法进行实时定量
PCR 扩增反应。在荧光定量 PCR 仪上设置好孔的位
置且各样品均设置 3 个复孔。反应条件为 ：94℃预
变性 5 min ；94℃变性 20 s，57.5℃退火 30 s，72℃
延伸 30 s，进行 40 个循环 ；最后 72℃延伸 30 s。设
置好 PCR 过程中检测的临界点，每个循环退火末期
检测荧光信号。最后在反应条件中加入分析模式为：
70-95℃升温，其中每次升温 0.5℃，反应时间为 10
s 的熔解曲线分析，以卵形鲳鲹 β-actin 为内参，对
得到的各样品 Ct 值进行均一化处理，应用 2-ΔΔCT 法
确定不同处理方式下肝脏组织中△ 6FAD 的相对表
达量，实验数据采用 SPSS19.0 进行单因素显著性分
析和 Duncan 多重性比较。
2 结果
2.1 总RNA的提取
提取的总 RNA 样品经过微量核酸定量仪，测定
其 OD260/OD280 值均在 1.8-2.0 之间，说明提取的总
RNA 较为单一。1% 琼脂糖凝胶电泳显示清晰的 28S
和 18S rRNA 条带（图 1），说明提取的总 RNA 样品
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7118
完整性良好，可以用于下一步实验。
2.2 卵形鲳鲹△6FAD基因克隆及序列同源性分析
经 DNAman 工 具 拼 接 后 获 得 全 长 为 1 908 bp
的卵形鲳鲹△ 6 脂肪酸去饱和酶基因的全长 cDNA
序 列（GenBank 登 录 号 ：KP295471）， 开 放 阅 读
框 1 329 bp，编码 442 个氨基酸残基（图 2）。利用
Vector NTI 11 软件将得到的卵形鲳鲹△ 6FAD 基因
所编码的氨基酸序列与 GenBank 上公布的其他物种
的△ 6FAD 的氨基酸序列进行同源性比对，结果（表
2）显示，该基因编码的氨基酸序列与其他鱼类的
△ 6 脂肪酸去饱和酶氨基酸序列具有很高的相似度，
与 尖 吻 鲈（Lates calcarifer）、 军 曹 鱼（Rachycentron
canadum）、 大 菱 鲆（Scophthalmus maximus）、 点
带 石 斑 鱼（Epinephelus coioides）、 金 头 鲷（Sparus
aurata）和鳜鱼（Siniperca chuatsi）的同源性分别高
达 87%、88%、83%、84%、83% 和 83%， 但 与 斑
马鱼（Danio rerio）、小鼠（Mus musculus）和人（Homo
sapiens）等哺乳动物同源性较低，分别为 67%、63%
和 63%。
2.3 卵形鲳鲹△6FAD氨基酸序列的理化性质
Protparam 预测该编码氨基酸理论分子质量约为
52 kD，理论等电点 8.88，其中 Leu 最多，有 47 个，
表 1 △ 6 脂肪酸去饱和酶 cDNA 克隆及 qPCR 所需引物
名称 引物序列（5-3）
FAD(S) CAGCATCACGCTAAACCCAA
FAD(A) TGAGCCAAACAGGCCATACA
FAD(3ou) CAGCATCACGCTAAACCCAACG
FAD(3in) ATGCCCTACCATCACCAACACCAG
FAD(5ou) AAACCAGATCCACCCAGTCG
FAD(5in) AAACTGGAAGGAGAAGCGGTGG
FAD(Sy) GCCTTTGTTCTTCTGCCTCC
FAD(Ay) AAGCGTCAGTATCCAGTTAGTTCC
β-actin(S) GTCATGTGGATCAGCAAGCAGGA
β-actin(A) CGCCCGAGTGTGTATGAGAAATG
2000
bp
M
1000
750
500
250
100
28S
18S
5S
图 1 肝脏组织中提取的总 RNA
1
1
76
26
151
51
226
76
301
101
376
126
451
151
526
176
601
201
676
226
751
251
826
276
901
301
976
326
1051
351
1126
376
1201
401
1276
426
阴影部分为该推测氨基酸序列预测的跨膜螺旋区 ；阴影加红色字体为 3 个组氨酸的富集区域
图 2 卵形鲳鲹△ 6FAD 基因 cDNA 开放阅读框及推测编码的氨基酸序列
2015,31(7) 119韩洪波等 ：卵形鲳鲹耐低温候选基因△6FAD 全长 cDNA 序列的克隆与表达分析
占总氨基酸数的 10.6%，其次分别是 His 和 Phe，分
别为 32 个和 29 个，占总氨基酸数的 7.2% 和 6.6%，
最少的为 Cys，只有 6 个，占总氨基酸的 1.4%。蛋
白质序列中不存在 Pyl 和 Sec，含正电荷残基数 42 个，
负电荷残基数 36 个，不稳定指数为 40.05，被分类
为不稳定蛋白。该蛋白的理论疏水值和总平均亲水
性分别为 87.81 和 -0.167，属于一种疏水性蛋白，脂
肪族氨基酸指数也因序列中含有较多的 Leu 而高达
87.81。
2.4 卵形鲳鲹△6FAD氨基酸序列信号肽和亚细胞
定位
SignalP 预 测 中 未 检 测 到 该 蛋 白 中 存 在 信 号
肽，故该蛋白应不属于分泌蛋白（图 3）。 PSORT II
Prediction 对△6FAD 的亚细胞定位结果中显示，卵
形鲳鲹△6FAD 定位于细胞质中的可能性最高，为
39.1%，其次分别为内质网 34.8%、线粒体 13%，细
胞外、分泌囊泡和高尔基体中可能性最低，均为
4.3%。
2.5 卵形鲳鲹△6FAD氨基酸二级结构和跨膜结构
域、功能域的预测
PredictProtein 和 SPOMA 对卵形鲳鲹△6FAD 氨
基酸二级结构的预测中呈现出相似的结果，都显示
表 2 卵形鲳鲹和其他各物种的△ 6FAD 氨基酸序列同源性比对分析 /%
物种 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 87 88 83 67 79 77 81 83 84 84 83 83 63 63
2 91 84 70 81 77 83 85 86 86 86 86 65 65
3 86 71 81 78 84 88 87 88 87 86 66 65
4 68 78 73 80 83 84 83 84 82 63 63
5 72 65 71 69 68 68 69 69 65 63
6 74 80 79 80 80 80 81 65 66
7 76 77 77 76 76 78 63 61
8 84 85 86 86 85 67 66
9 88 88 87 86 66 65
10 90 90 88 66 66
11 93 90 65 65
12 89 66 65
13 64 64
14 88
15
注：1：卵形鲳鲹（T.ovatus）；2：尖吻鲈（L.calcarifer）；3：军曹鱼（R.canadum）；4：大菱鲆（S.maximus）；5：斑马鱼（D.rerio）；6：黄斑篮子鱼（S.canaliculatus）；
7 ：尼罗罗非鱼（O.nioticus）；8 ：金钱鱼（S.argus）；9 ：蓝鳍金枪鱼（T.thynnus）；10 ：点带石斑鱼（E.coioides）；11 ：海鲈（D.labrax）；12 ：金头鲷（S.aurata）；
13 ：鳜鱼（S.chuatsi）；14 ：小鼠（M.musculus）；15 ：人（H.sapiens）
1.0
C-scoreS-scoreY-score
0.8
0.6
0.4Sc
or
e
0.2
0.0
0 10 20 30
Position
40 50 60 70
图 3 △ 6FAD 蛋白的信号肽预测分析
螺旋结构（helix）和无规则卷曲结构（Beta turn）为
该蛋白质二级结构中的主要构成部分，分散存在于
整个蛋白质结构中。其中在 SPOMA 的预测结果中显
示 α 螺旋（Alpha helix）和无规则卷曲（random coil）
分别有 170 处和 145 处，占总二级结构的 38.46% 和
32.81% ；其次，链延伸结构（Extended strand）有 90
处，占 20.36%，而 β 转角（Beta turn）在整个蛋白
的二级结构中含量最少，只有 37 处，占 8.37%（图
4）。在 PredictProtein 的结果中还显示该蛋白可能
存在 3 个跨膜区螺旋，4 个跨膜区，共形成 4 个跨
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7120
膜区拓扑结构。在 TMHMM 在线服务器反馈的结果
中也明显看到在氨基酸序列的 143-165、264-286、
301-323 这 3 个区域存在 3 个跨膜螺旋区，这一结
果与 PredictProtein 中预测的跨膜螺旋区数目一致。
在 Prosite 和 NCBI 的 CDD 的预测结果中均显示该编
码蛋白在位置为 16-93 上含有一个属于细胞色素 b5
家族的血红素结合结构域（heme-binding domain）；
此外，NCBI 的 CDD 分析显示，该蛋白具有膜结合
脂肪酸去饱和酶超家族的保守脂肪酸去饱和酶结构
和一个类△ 6 脂肪酸去饱和酶结构（图 5）。
50 100 150 200 250 300 350
50 100 150 200 250 300 350
蓝线表示 α-螺旋（Alpha helix）；红线表示延伸链（Extended strand）；绿线表示 β-转角（Beta turn）；
黄线表示无规则卷曲（random coil）
图 4 △6FAD 蛋白的二级结构预测图
Query seq.
Specific hits
Non-specific
hits
Superfamilies
Multi-donains
Cyt-b5 superfamily
PLN03199
DesA
Cyt-b5
75 150 225 300 375 4421
pwtative di-iron ligands
Deltq6-FADS-like
FA_desatwrase
Membrane-FADS-like superfamily
图 5 CDD 预测的△6FAD 蛋白的结构域分析图
2.6 卵形鲳鲹△6FAD蛋白的系统进化分析
应 用 MEGA6 软 件 将 推 测 的 卵 形 鲳鲹△6FAD
氨基酸序列及从 GenBank 下载的其他物种的同种
基因推测的氨基酸序列进行比对分析并按 NJ 法构
建该基因在这些物种中的进化树。结果（图 6）表
明，卵形鲳鲹与尖吻鲈（Lates calcarifer）、军曹鱼
（Rachycentron canadum） 在 进 化 关 系 上 最 为 接 近，
其次是大菱鲆（Scophthalmus maximus）、蓝鳍金枪
鱼（Thunnus thynnus） 和 点 带 石 斑 鱼（Epinephelus
coioides），但却与斑马鱼（Danio rerio）、小鼠（Mus
musculus） 和 人（Homo sapiens） 表 现 出 较 远 的 进
化关系，这一结果与氨基酸序列相似性比对结果
一致。
2.7 低温胁迫下诱导的卵形鲳鲹△6FAD基因的表
达分析
在卵形鲳鲹△6FAD 基因随温度变化的相对表达
分析中，各实验组降到目标温度 12 h 后卵形鲳鲹肝
脏中△6FAD 基因的表达量被测定。结果（图 7）显
示，该基因的表达量在 28℃到 13℃范围内随温度
的降低先缓慢降低后又迅速升高，13℃时达到峰
值，并与其他各温度下的表达量存在显著性差异
（P<0.05），而对照组中则基本保持平衡，各组间表
达量差异不显著（P>0.05）。而不同低温下随时间变
化的相对表达分析中，该基因的时序表达模式在不
同低温下不同，其中 13℃时表现出的时序表达模式
与 16℃和 19℃出现明显差异。13℃下，△6FAD 的
2015,31(7) 121韩洪波等 ：卵形鲳鲹耐低温候选基因△6FAD 全长 cDNA 序列的克隆与表达分析
表达量随时间的增加先降低后升高，最终恢复至原
来水平，与 0 h 时差异不显著（P>0.05），而 16℃和
19℃下，该基因的表达量则表现出一种反馈式的调
节方式且逐渐随时间降低（图 8）。
变化极为敏感，温度胁迫下发生的生物膜膜脂结构
重组及成分变化等温度补偿机制普遍存在于鱼体中。
当水温急剧下降时，鱼类肝、肾、心脏等组织的细
胞膜膜脂流动性和弹性减弱，膜脂的不对称性使膜
体紧缩不均匀而造成破损渗漏或通透性增加，胞内
溶质外流入血，引起鱼的血清生化指标的变化［13］；
Lyons 等［14］的“膜脂相变”学说指出低温下首先伤
害的是细胞膜膜相，膜脂从液晶相变为了凝胶相，
因此影响了膜的流动性。低温下生物膜能否保持适
当的流动性与生物耐寒性之间有一定的相关性，而
生物膜的流动性主要取决于膜脂的脂肪酸组成［15］。
膜脂中的不饱和脂肪酸成分在增加膜脂流动性和黏
滞性方面起着重要作用，因此，膜脂中的不饱和脂
肪酸可能成为物种抗寒能力的一个关键机制。
3.2 卵形鲳鲹△6FAD基因全长cDNA的克隆及生
物信息学分析
本 实 验 中 获 得 的 卵 形 鲳鲹△6FAD 基 因 全 长
1 908 bp，编码 442 个氨基酸。序列结构分析显示，
卵形鲳鲹△6FAD 基因具有典型的脂肪酸去饱和酶
家族的结构特性，即 1 个细胞色素 b5 区、3 个组氨
酸 富 集 区（HDFGH、HFQHH 和 QIEHH） 和 3 个
跨膜结构域。序列同源性比对分析发现，该酶基因
的 N 端和 C 端缺乏明显的同源性，仅中间序列相对
保守，由 8 个保守的组氨酸残基构成了 3 个保守的
组氨酸富集区。研究认为 3 个保守的组氨酸富集区
是维持酶活性所必需的，且其中 HisI 和 HisII 区与
酶 - 底物结合位点的形成有关，而 3 个保守的组氨
酸富集区和 1 个 Fe2+ 结合形成催化活性中心［16］；由
Dicentrarchus labrax
Sparus aurata
Siniperca chuatsi
Epinephelus coioides
Thunnus thynnus
Scophthalmus maximus
Trachinotus ovatus
Lates calcarifer
Rachycentron canadum
Scatophagus argus
Oreochromis niloticus
Siganus canaliculatus
Danio rerio
Homo sapiens
Mus musculus100
95
100
82 59
69
7966
49
45
41
59
图 6 △6 FAD 蛋白同源序列的分子进化树
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5⴨ሩ㺘䗮䟿 ᇎ傼㓴bc b
cd
d
cd
a
A
A
A
A
A A
28 25 ⑙ᓖć22 19 16 13ሩ➗㓴(28ć)
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
0 12 24 36 48 60 72 84
⴨ሩ㺘䗮䟿 13ć 16ć 19ća aabbc
bc
c c
c
A
AB
BCD
BC
D
CD
CD
D
1
12
34
12
45
23
45
5ᰦ䰤h
不同大小写字母表示各组内差异显著（P<0.05）
图 7 △6 FAD 基因随温度变化的相对表达分析
3 讨论
3.1 卵形鲳鲹△6FAD基因的低温补偿机制
△6FAD 是一种膜结合脂肪酸去饱和酶，属于
脂肪酸去饱和酶家族中的一员，是生物体内参与多
不饱和脂肪酸合成的关键酶。在 n-3 或 n-6 途径合成
多不饱和脂肪酸的过程中，△ 6FAD 主要以 NADH、
细胞色素 b5 氧化还原酶作为电子供体，催化甘油酯
中的脂肪酸脱氢［12］。鱼类脂肪酸代谢对环境温度的
不同大小写字母及数字表示各组内差异显著（P<0.05）
图 8 △6 FAD 基因在不同低温下随时间的相对表达分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7122
3 个组氨酸富集区与细胞色素 b5 区域相结合共同在
脂肪酸的去饱和电子传递链中完成电子传递的作用。
△6FAD 基因编码的氨基酸序列同源性比对分析发
现，该氨基酸序列片段与其他鱼类的△6FAD 基因所
编码的氨基酸序列具有较高的相似度，存在较近的
亲缘关系，但与斑马鱼、小鼠和人等哺乳动物在进
化关系上却表现出较远的亲缘关系，这与已有的报
道结果一致。
3.3 卵形鲳鲹肝脏中△6FAD基因在不同处理下的
差异表达
已有研究报道低温能增加硬骨鱼中△6FAD 基
因的表达量与酶活性［17-19］，但目前有关脂肪酸去
饱和酶家族和鱼类抗寒性的研究还较少。Ren 等［20］
研究表明低温能促进鲤（Common carp）△6FAD-a
基因表达量明显的增加 ；遮目鱼（Chanos chanos）
△9FAD 的 mRNA 表达量在低温胁迫下呈先稳定增
加后明显下降的趋势，而草鱼（Grass carp）在胁迫
21 d 后才明显检测到△9FAD mRNA 的表达［21］；鲤
鱼（Common carp）低温（6℃）应激下，△9FAD 基
因的表达水平是常温条件下（23℃）的 13.9 倍，表
明了△9FAD 基因的表达与低温刺激密切相关［22］。
此外，也有研究表明在微生物和高等植物中△9FAD
是导致细胞膜膜脂冷适应的主要蛋白，与其冷适应
性有关［23］。本研究中该基因在降温过程表达量的变
化和不同低温下的时序表达模式表明该基因的表达
与环境温度和胁迫时间存在一定相关性。鱼类是变
温动物，不同的环境温度可能造成鱼体不同的新陈
代谢方式，并出现不同的生理回应。根据本研究中
卵形鲳鲹△6FAD 基因在不同温度下的相对表达分析
结果推测，鱼体的新陈代谢水平随着水温的下降而
下降，但随着温度的继续下降，鱼体开始出现冷应
激反应，激发体内一切抗寒机制以应对外界的低温
刺激，最终使得该基因的表达量在整个降温过程中
出现先下降后上升的趋势 ；而不同低温下的时序表
达模式则可能是低温刺激和鱼体对环境的自然适应
共同作用的结果。
硬骨鱼类通过增加不饱和脂肪酸在细胞膜膜脂
中的比例来维持低温下的正常生理活性［24，25］。有研
究表明，低温能增加去饱和酶 mRNA 的合成与稳定
性，进而增加胞内酶的数量，加强膜脂的去饱和作
用［26］。因此，在多不饱和脂肪酸合成过程中的脂肪
酸去饱和酶基因家族对增加膜脂中的不饱和脂肪酸
成分、提高细胞膜在低温下的流动性都有着重要的
作用，其也可能是卵形鲳鲹在抗寒过程中的关键基
因成员，而有关脂肪酸去饱和酶基因家族和物种耐
寒性状之间的联系还有待进一步的研究。
4 结论
本研究克隆了卵形鲳鲹△ 6 脂肪酸去饱和酶
（△6FAD）基因，全长共 1 908 bp，并提交至 NCBI
基因库（GenBank 登录号 KP295471），低温胁迫表
达实验表明，该基因在 28℃到 13℃范围内表达量随
温度降低先缓慢降低后又迅速升高，并于 13℃时达
到峰值 ；在不同低温下该基因表达量呈现出不同的
时序表达模式，13℃时随时间增加先降低后升高，
最终恢复至原来水平，而 16℃和 19℃时则表现出一
种随时间逐渐降低的反馈式调节方式。
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（责任编辑 马鑫）