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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
收稿日期 : 2011-11-04
作者简介 : 邓思 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 微生物和分子生物 ; E-mail: dengsiyu120@163.com
通讯作者 : 罗立新 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 微生物制药和生物化工 ; E-mail: btlxluo@scut.edu.cn
分选酶 A（SrtA）的 GST融合表达、纯化及活性测定
邓思 罗立新
（华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006）
摘 要： 构建 GST/金黄色葡萄球菌分选酶 A（SrtA）的原核表达载体，在大肠杆菌中表达、纯化分选酶，并利用展示在
酵母表面的底物检测分选酶的活性。以 pMD20-SrtA为模板，PCR扩增得到 SrtA△N59基因，经 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切，连接到
原核表达载体 pGEX-4T-1中，构建重组表达载体 pGEX-SrtA△N59，转化大肠杆菌 BL21（DE3），IPTG诱导表达，GST亲和层析分
离纯化得到 SrtA△N59，与展示在酵母表面的底物序列 QALPETGEE-linker-EGFP作用，产生游离的 EGFP，通过酶标仪检测 EGFP
荧光强度确定分选酶的活性。结果显示，重组表达载体 pGEX-SrtA△N59经 IPTG诱导，表达出相对分子质量约为 42 kD的融合蛋
白，SDS-PAGE分析，该融合蛋白是以可溶形式表达。分离纯化得到的分选酶与底物作用，其荧光强度由 568.66±12.14增加至
921.43±13.02。以上结果表明，成功构建了重组表达载体 pGEX-SrtA△N59，并在大肠杆菌中获得了可溶表达的有活性的分选酶。
关键词： 分选酶 A GST融合表达 纯化 底物 活性测定
GST Fusion Expression，Purification and Activity
Assay of SortaseA
Deng Si Luo Lixin
（School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006）
Abstract: It was to clone and express the Staphylococcus aureus sortaseA（SrtA）gene in prokaryotic expression system and to
purify the GST fused protein. Then the activity of SrtA was detected by the substrate displayed on yeast cell surface. The truncated SrtA gene,
SrtA△N59, was amplified by PCR using pMD20-SrtA as the template. The SrtA△N59 gene was digested with BamH Ⅰ and XhoⅠ , and inserted
into vector pGEX-4T-1. Then, the recombinant expression vector pGEX-SrtA△N59 was transformed into Escherichia coli BL21（DE3）and
induced with IPTG. The protein SrtA△N59 was purified by GST affinity chromatography. The activity of SrtA△N59 was detected by the fluorescence
intensity of free EGFP generated from the interaction of sortase with its substrate displayed on yeast surface. The SDS-PAGE result showed
that approximately 42 kD protein was expressed by pGEX-SrtA△N59. The fluorescence intensity of free EGFP increased from 568.66±12.14 to
921.43±13.02 after interaction of sortase with its substrate. These results suggested that the recombinant expression vector pGEX-SrtA△N59 was
successfully constructed and the active SrtA was soluble when expressed in Escherichia coli.
Key words: SrtA GST fusion expression Purification Substrate Activity assay
抗生素在被广泛使用过程中，存在较强的选择
性压力，易导致耐药菌的产生［1］。目前，耐药性病
原菌持续增长且出现了多重耐药菌［2］，严重危害人
类健康，寻求安全有效的抗菌靶物，解决细菌耐药
性问题已成为国内外的研究热点。
革兰氏阳性菌的致病性与众多表面蛋白致病因
子如能够识别黏附基质的细胞表面组分（microbial
surface components recognizing adhesive matrix molec-
ules，MSCRAMMs）密切相关。这些表面蛋白有助
于细菌在宿主内皮组织的吸附及逃避宿主免疫系统
的攻击。在革兰氏阳性菌中，表面蛋白通过分选酶
（sortase）共价锚定到菌体细胞壁肽聚糖上，表面蛋
白 C-末端含有细胞壁分选信号 CWS（cell wall sorting
signal），该信号肽由保守氨基酸基序、一个疏水区
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期122
域和尾部带电荷的氨基酸残基 3 部分构成，分选酶
能够识别其保守氨基酸序列，但不同的分选酶识别
的基序以及功能方面均存在差异。Clancy 等［3］将分
选酶分为 3 类亚型 ：分选酶 A，作为持家分选酶，
识别 LPXTG 基序，广泛存在于所有革兰氏阳性菌中；
分选酶 B，识别 NPQTN 基序，与铁元素的摄取有关，
存在于杆菌、李斯特菌和金黄色葡萄球菌中 ；分选
酶 C，识别 QVPTG 基序，具有菌毛蛋白聚合酶功能，
存在于链球菌、白喉棒杆菌、粪肠球菌和蜡样芽孢
杆菌中。目前国外研究主要集中在金黄色葡萄球菌
分选酶 A（SrtA），而国内相关研究报道较少。金黄
色葡萄球菌分选酶 A 的催化机制为分选酶 A 识别表
面蛋白 C-末端 LPXTG 基序，其活性中心 Cys184 亲
和攻击 Thr-Gly 之间的肽键，产生一个 Thr 的羧基末
端，之后与肽聚糖的肽桥（甘氨酸五肽）的氨基形
成酰胺键，最终将表面蛋白锚定到菌体细胞壁上［4, 5］。
抑制分选酶的催化作用，可阻断表面蛋白的锚定过
程，破坏致病菌的感染机制，因此分选酶有望成为
新的抗菌靶酶［6］。
金黄色葡萄球菌的分选酶 A 由 206 个氨基酸组
成，其 N-末端为疏水性较强的膜锚定序列［7］，去
除 N 端膜锚定序列的分选酶 A 能够在 E. coli中以可
溶形式大量表达。Ilangovan 等［8］研究结果也表明，
分选酶 A 的 60-206 位氨基酸残基为催化活性区域。
pGEX-4T-1 载体含有谷胱甘肽硫转移酶（GST）标签，
该标签蛋白的分子量为 26 kD，它在大肠杆菌中的表
达产物具有完全的酶活。此外，pGEX 载体带有 tac
启动子，能实现化学诱导的高效表达。本研究拟利
用 pGEX-4T-1 载体对去除 N 端 59 个氨基酸残基的
分选酶 A 基因进行高效原核表达，并利用谷胱甘肽
琼脂糖亲和层析柱进行一步纯化，以得到分选酶 A
蛋白，并与本实验室罗立新等［1］构建的表面展示有
分选酶底物序列 QALPETGEE 的毕赤酵母相互作用
以检测分选酶活性，期望得到大量有活性的分选酶，
为后续分选酶抑制剂的筛选或将分选酶用于蛋白质
工程介导连接奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌（Escherichia coli）
GT116 和 BL21（DE3）和质粒 pGEX-4T-1 均为本实
验保存 ；重组质粒 pMD20-SrtA、毕赤酵母（Pichia
pastoris）GS115/pKFS-QALPETGEE-linker-EGFP 均为
本实验室构建并保存。
1.1.2 主要试剂和仪器 Taq DNA 聚合酶、T4 DNA
连接酶、各种限制性内切酶（BamH Ⅰ、XhoⅠ）、
蛋白质低分子量标准、DNA 分子量标准，购自
TaKaRa 公司 ；质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂
盒购自 Omega 公司 ；SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒购
自广州美津生物技术有限公司 ；Bradford 法蛋白定
量试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司 ；IPTG、
氨苄青霉素、还原型谷胱甘肽、考马斯亮蓝 G250
购自北京普博欣生物科技有限公司 ；GSTrap FF 1 mL
亲和层析柱购自 GE Healthcare 公司。
PCR 仪（Eppendorf 公司，Mastertycler 型），凝胶
成像分析系统（Bio-Rad 公司，Universal Hood Ⅱ型），
台式高速冷冻离心机（Eppendorf 公司，Centerifuge
5804R 型），蛋白质亲和层析仪（美国 Bio-Rad 公司），
超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限
公司，Scientz-IID 型），SpectraMax M5 酶标仪（美
国 Molecular Devices 公司），真空冷冻干燥机（德国
CHRIST ALPHA1-4）。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒 pMD20-SrtA 的提取 将含重组质粒
pMD20-SrtA 的大肠杆菌 GT116 单菌落接种于 3 mL
含氨苄青霉素（Amp）100 μg/mL 的 LB 培养基中，于
37℃、200 r/min 过夜培养。取 2 mL 菌液用质粒小量
提取试剂盒进行质粒提取，进行 1% 琼脂糖凝胶电
泳分析。
1.2.2 重组表达载体 pGEX-SrtA△N59 的构建 根
据 GenBank 中 分 选 酶 A 基 因（AF162687）， 利 用
Primer5.0 软件，设计引物 primer1：5-TTGGATCCAT-
GCAAGCTAAACCTCAAATT-3，下划线为 BamH Ⅰ位
点 ；primer2 ：5-GCCCTCGAGTTATTTGACTTCTGTA-
GCTACAA-3，下划线为 XhoⅠ位点。以重组质粒
pMD20-SrtA 为模板，50 μL 体系扩增 SrtA△N59 基因，
扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃
30 s，30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。将 PCR 产
物切胶回收，用 BamH Ⅰ和 XhoⅠ同时酶切 PCR 纯
2012年第5期 123邓思等 ：分选酶 A（SrtA）的 GST 融合表达、纯化及活性测定
化产物和 pGEX-4T-1，酶切后切胶回收，以 T4 连接
酶 16℃连接过夜，构建表达载体 pGEX-SrtA△N59，转
化 GT116，提取质粒，双酶切鉴定及测序。
1.2.3 分选酶的诱导表达及纯化 重组表达载体
pGEX-SrtA△N59 转化到感受态大肠杆菌 BL21（DE3）
中。将阳性菌落过夜培养物按 1% 比例接种到含氨
苄青霉素（Amp）100 μg/mL 的 LB 液体培养基中，
37℃、200 r/min 培养至 OD600 约 0.6，取 2 mL 菌液
做未诱导对照，剩余菌液添加 IPTG 至终浓度为 1
mmol/L，25℃继续培养 6 h，离心收集菌体。用裂解
液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5）
重悬菌体沉淀，超声波破碎菌体，破碎后于 14 000
r/min、4℃离心 20 min，分别收集裂解上清和沉淀，
进行 SDS-PAGE 分析，以确定目的蛋白以可溶形式
存在于裂解上清中。裂解上清使用 GSTrap FF 柱进
行亲和层析纯化，其中 Binding buffer 为 PBS（140
mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8
mmol/L KH2PO4，pH7.3），Elution buffer（50 mmol/L
Tris-HCl，10 mmol/L reduced glutathione，pH8.0），纯
化后分别收集蛋白流出液和蛋白洗脱液，SDS-PAGE
分析检测蛋白纯化。用 Bradford 法测定纯化后的分
选酶蛋白浓度。
1.2.4 分选酶的活性测定
1.2.4.1 酵母表面展示底物的制备 将保存的毕赤
酵母GS115/pKFS-QALPETGEE-linker-EGFP在MD平
板上划线。挑单菌落接种于 50 mL BMGY 培养基中，
30℃、200 r/min 振荡培养 16-20 h 至 OD600 为 2-6，
于 8 000 r/min、4℃离心 10 min 收集菌体，再用
BMMY 培养基进行重悬，稀释至 OD600 为 1，继续振
荡培养。每隔 24 h 向 BMMY 培养基中补加甲醇至终
浓度为 0.5% 进行诱导表达，且用荧光显微镜观察其
表达量［1］。甲醇诱导 168 h 后，于 8 000 r/min、4℃
离心 10 min 收集酵母菌体，用无菌水重悬菌体，利
用真空冷冻干燥机将其制成冻干的酵母菌粉。
1.2.4.2 分选酶与底物的相互作用 分选酶与表面
展示有底物序列 QALPETGEE-linker-EGFP 的酵母相
互作用，分选酶能够在 T 和 G 之间断裂，使锚定在
酵母细胞表面的 EGFP 脱落，变成游离的 EGFP 蛋
白溶于反应上清，通过测量 EGFP 的荧光强度来测
定分选酶的活性。称取 0.02 g 冻干的酵母菌粉，加
入 10 mL 分选酶反应缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，
150 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2，pH7.5）溶解，即
分选酶底物浓度为 0.002 g/mL。取 900 μL 底物与
100 μL 纯化后的分选酶溶液，37℃反应 1 h。同时设
同样的反应体系但不加分选酶作为阴性对照，即用
分选酶反应缓冲液取代分选酶。反应后于4 000 r/min
离心 10 min 除去酵母菌体，取上清液用 SpectraMax
M5 酶标仪测其荧光强度。激发波长为 488 nm，发
射波长为 513 nm。每次测量重复 4 次。
2 结果
2.1 分选酶基因SrtA△N59的扩增和重组表达载体pGEX-SrtA△N59的构建
以重组质粒 pMD20-SrtA 为模板扩增出的 PCR
产物约为 460 bp，与预期的 SrtA△N59 基因大小相符。
重组载体 pGEX-SrtA△N59 经 BamH Ⅰ和 XhoⅠ双酶
切鉴定，分别在 4 900 bp 和 460 bp 附近出现两条明
显的带，如图 1 所示。重组载体 pGEX-SrtA△N59的测
序结果经 NCBI Blast 分析，与 GenBank 中 S. aureus
832524 的 SrtA（AF162687）序列同源性达 100%，
表明已成功构建了重组表达载体 pGEX-SrtA△N59。
M1. 1 kb DNA Ladder Marker ；1. 重组载体 pGEX-SrtA△N59 ；2. pGEX-
SrtA△N59 经 BamH Ⅰ和 XhoⅠ双酶切 ；M2. DL2000 DNA Marker
图 1 重组载体 pGEX-SrtA△N59的 BamH I和Xho I双酶切鉴定图
2.2 分选酶基因SrtA△N59的诱导表达及纯化
在重组表达载体 pGEX-SrtA△N59 中 SrtA△N59 基
因与 GST 标签融合表达，GST 标签蛋白分子量为 26
kD，目的蛋白 SrtA△N59 约为 16 kD，则融合表达蛋
白分子量约为 42 kD。由图 2 可以看出，含 pGEX-
SrtA△N59 的大肠杆菌 BL21（DE3）经 IPTG 诱导及纯
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期124
化后，在约 44 kD 处出现明显的条带，与预期蛋白
大小存在一定差异，但这与董亚青［9］的研究相类似，
且目的蛋白是存在于裂解上清中，说明目的蛋白是
可溶性表达。
大量研究，也筛选得到一些对分选酶有较强抑制效
果的抑制剂，而国内关于分选酶的研究较少。我国
具有丰富的中草药资源，如果能从中筛选得到有效
的分选酶抑制剂，将具有重要的意义。此外，近些
年，国外除了关于分选酶抑制剂筛选方面的研究，
还出现了一个新的研究方向，即将分选酶的介导连
接 SML（sortase-mediated ligation）功能应用于蛋白
质工程［10］。分选酶 A 作为转肽酶，能特异性识别
LPXTG序列，在T和G之间断裂，形成酰基酶中间体，
当存在氨基亲核体时，则可通过转肽反应形成酰胺
键。因此，可将分选酶的这种连接功能应用于蛋白
质工程，如将蛋白共价锚定到固相介质表面，利用
分选酶连接蛋白与蛋白、蛋白与肽类、肽类与肽类等，
还可利用分选酶对蛋白进行位点特异性修饰。
GST 融合表达系统是大肠杆菌表达系统中较为
常用的一种。GST 融合表达系统具有以下优势［11］：
（1）带有 tac 启动子，tac 启动子是较强的原核启动
子，通过 IPTG 诱导可实现高效表达。（2）插入的外
源基因位于 26 kD 的 GST 下游，避免了外源基因对
启动子的影响。（3）融合表达的蛋白含有 GST，可
通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶进行亲和层析纯化，纯化
中使用的都是温和、非变性的缓冲液，有利于分离
活性蛋白。（4）融合蛋白更接近于天然蛋白，有利
于后续有关结构的研究。为了实现分选酶 A 的可溶
性表达，本研究选用 GST 融合标签进行融合表达。
本研究成功地实现了分选酶基因 SrtA△N59 在大
肠杆菌中的可溶性表达，为下一步进行分选酶抑制
M. 低分子量蛋白标准 ；1. pGEX-SrtA△N59/BL21（DE3）IPTG 诱导前的表达
产物 ；2. pGEX-SrtA△N59/BL21（DE3）IPTG 诱导后的表达产物 ；3. pGEX-
SrtA△N59 诱导后的破碎上清 ；4. pGEX-SrtA△N59 诱导后的破碎沉淀 ；5. 纯化
后的 GST- SrtA△N59 融合蛋白
图 2 重组载体 pGEX-SrtA△N59诱导表达产物的SDS-PAGE分析
2.3 分选酶的活性测定
纯化后的分选酶与展示在酵母表面的底物于
37℃反应 1 h 后，用 SpectraMax M5 酶标仪测 EGFP
的荧光强度以确定分选酶的活性，结果（图 3）显
示，重复测量 4 次，得到阴性对照的荧光强度分别
为 568.89、581.35、552.26 和 572.15，标准方差为
12.14 ；而试验组荧光强度分别为 906.18、937.73、
923.14 和 918.68，标准方差为 13.02，其荧光强度增
加了 352.77，表明纯化后的分选酶具有很高的活性。
其阴性对照组的荧光强度比较高，是因为酵母经过
168 h 的培养后，表面锚定了大量的 EGFP 蛋白，在
离心过程中，受到离心力的作用，会出现自动脱落
的现象。
3 讨论
革兰氏阳性菌的表面蛋白对细菌的致病性具有
重要作用，而表面蛋白是通过分选酶而锚定到细胞
壁上，因此分选酶作为抗菌靶酶成为研究热点，寻
找分选酶抑制剂，有望筛选得到新的抗菌药物。目前，
国外已在分选酶的酶学性质及抑制剂筛选方面做了
1. 阴性对照，即利用分选酶反应缓冲液代替分选酶与底物作用 ；
2. 分选酶与底物作用
图 3 分选酶的活性测定
2012年第5期 125邓思等 ：分选酶 A（SrtA）的 GST 融合表达、纯化及活性测定
剂的筛选或将分选酶用于蛋白质工程提供了可能。
4 结论
本研究将去掉 N-末端 59 个氨基酸残基的 Srt-
A△N59 基因克隆到 pGEX-4T-1 中，成功构建了重组
表达载体 pGEX-SrtA△N59，并转化大肠杆菌 BL21
（DE3），经 IPTG 诱导后进行 SDS-PAGE 检测分析，
结果显示 pGEX-SrtA△N59 成功在大肠杆菌中表达出相
对分子质量约为 42 kD 的融合蛋白，且以可溶形式
存在，避免了包涵体变复性难的问题。对诱导后的
破碎上清进行谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析，获得
了纯度较高的 GST-SrtA△N59 融合蛋白，将分离纯化
得到的重组分选酶与展示在酵母表面的底物序列作
用，使其荧光强度增加了 352.77，表明分离纯化得
到的分选酶具有较高的活性。
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（责任编辑 马鑫）