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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(11):251-256
诱导胚胎干细胞体外分化为生殖细胞对于临床
医学实践和人类生殖细胞发育机理的理论研究两方
面都具有重要意义。近年来，有多篇研究报道诱道
小鼠或人的胚胎干细胞分化可以观察到类原始生殖
细胞、类精子和类卵细胞的结构形成。早在 2006 年，
Nayernia 等［1］就将小鼠胚胎干细胞诱导形成完全成
熟并具有生理功能的精子，可使小鼠卵细胞受精，
此受精卵植入小鼠卵巢可产下后代。但迄今仍未能
从人类胚胎干细胞诱导出完全成熟并具有一定生理
功能的卵细胞。要想获得这样的卵细胞，目前还有
很多问题尚未解决，其中之一就是如何能有效检测
胚胎干细胞分化的阶段。解决这一问题的有效手段
之一是建立人胚胎干细胞向卵细胞分化的报告系统，
将在卵细胞中特异表达基因的启动子与荧光蛋白相
连接，通过荧光蛋白的表达来指示胚胎干细胞体外
分化的卵细胞阶段。2009 年，Kee 等［2］在诱导人胚
胎细胞分化的过程中就使用了 VASA-eGFP 检测系
统，将 VASA 基因启动子与 eGFP 蛋白的序列相连接，
慢病毒感染人的胚胎干细胞，成功检测并分离出分
化的人胚胎干细胞中的原始生殖细胞群体。
ZP2（Zona pellucida 2）是组成卵细胞透明带的
重要蛋白之一。透明带由哺乳动物分泌的糖蛋白组
收稿日期 ：2015-03-25
作者简介 ：罗梦圆，女，硕士研究生，研究方向 ：干细胞与生殖发育 ；E-mail ：lqqsqslkmzcz@mail.bnu.edu.cn
通讯作者 ：纪家葵，男，教授，研究方向 ：干细胞和生殖发育 ；E-mail ：kkee@tsinghua.edu.cn
人类卵母细胞报告系统的构建
罗梦圆  纪家葵
（清华大学医学院干细胞与再生医学中心，北京 100084）
摘 要 ： 体外分化培养干细胞得到成熟生殖细胞具有重要的科学价值和临床意义，构建出人类胚胎干细胞体外分化为卵细
胞的报告系统，旨在能为这一研究提供有效的工具。ZP2 是组成哺乳动物卵细胞周围透明带的重要蛋白之一，其蛋白只能在卵细
胞中表达，具有很高的组织特异性。将人 ZP2 基因 300 bp 和 2 500 bp 启动子片段分别与 eGFP 荧光蛋白基因连接，利用 Gateway
系统构建出重组质粒 ZP2-300-eGFP 和 ZP2-2500-eGFP，在 WI38、未分化的人胚胎干细胞 H9 和小鼠卵母细胞中验证其荧光蛋白表
达组织特异性。结果表明，ZP2-2 500-eGFP 报告系统可以特异启动荧光报告基因在小鼠的卵母细胞中的表达。
关键词 ： 报告系统 ；ZP2 ；卵母细胞
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.033
Constructing a Human Oocyte Reporter System
Luo Mengyuan Kee Kehkooi
（Center for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine，School of Medicine，Tsinghua University，Beijing 100084）
Abstract: In vitro differentiation of stem cells into mature germ cells has important significance both in scientific research and in clinical
treatment. An oocyte reporter system will become a useful tool for this goal. ZP2 is a component of the zona pellucida in mammalian oocytes and
its expression is known to be restricted in oocyte. In this experiment we cloned 300 bp and 2 500 bp fragment of human ZP2 promoter and fused
them to eGFP aiming to build an oocyte reporter sysem. We tested the specificity of the reporter in WI38, undifferentiated human embryonic stem
cell（hESC）line H9 and mouse oocyte. Results show that ZP2-2500-eGFP can specifically drive eGFP expression in mouse oocyte but no eGFP
was detected in WI38 and undifferentiated hESCs.
Key words: reporter system ；ZP2 ；oocyte
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11252
成，包围在卵母细胞周围，对于哺乳动物受精过程
中的精卵识别、精卵结合以及避免多次受精现象有
非常重要的作用［3］。ZP2 和另一种组成透明带的重
要蛋白 ZP3 是已知的为数不多的仅在卵细胞中表达
的蛋白，表达具有很高的组织特异性［4］。ZP2 蛋白
在表达后受到多种糖基化修饰［5］，与 ZP3 蛋白形成
异源二聚体结构［6］，最终形成透明带。在功能上，
ZP2 与已发生顶体反应的精子直接结合，是结合精
子的第二受体［7］。Zp2 敲除的小鼠卵母细胞透明带
变薄，无法正常排卵，即便取出这样的小鼠的卵细
胞在体外培养成熟并受精，得到的胚胎也无法正常
发育［8］。人和小鼠的 ZP2 基因非常保守，在它们的
5 末端有一段 575 bp 的片段，其中有超过 70% 的碱
基是一致的［9］。重组表达人 ZP2 蛋白的 Zp2 敲除小
鼠，其透明带的缺陷能得到部分修复［10］。ZP2 的转
录始于原始卵泡期之后，受到原始卵泡阶段重要的
转录因子 Figlα 的调控［11］。此后，随着卵泡发育迅
速上升，在卵细胞发育到半径为 50-60 μm 时达到最
高值，在卵子成熟及排卵开始时迅速降至最高值的
5% 以下［12］。ZP2 的表达特异性使得其很适合作为
指示卵母细胞发育阶段的标志基因。
本研究利用不同长度的 ZP2 启动子片段与荧光
蛋白 eGFP 相连接构建出荧光报告质粒。由于人类
胚胎干细胞有不易被转染的特点，因此报告系统采
用慢病毒感染的方式植入 ZP2 报告系统［13］。同时用
人成纤维细胞 WI38 进一步检验该报告系统的组织
特异性。由于人卵母细胞样本珍贵、不易取得，本
实验暂采用小鼠卵母细胞，通过体外培养和荧光观
察筛选出能特异指示卵母细胞的报告系统，旨为人
类胚胎干细胞分化、卵母细胞的鉴定及卵母细胞的
分离提供良好的工具和手段。
1 材料与方法
1.1 材料
293FT 细胞培养液成分 ：DMEM（Dulbecco’s
modified eagle medium）， 胎 牛 血 清（Fetal bovine
serum，FBS），Glutamax，非必需氨基酸（Non-essential
amino acid，NEAA），Pen/strip，Sodium Pyruvate，
G418（Geneticin，遗传霉素）。H9 细胞培养液成分 ：
Knockout DMEM（Knockout dulbecco’s modified eagle
medium）， 血 清 替 代 物（Knockout Serum Replacer，
KSR），Glutamax，NEAA，Pen/Strep， 人 基 础 成 纤
维 细 胞 生 长 因 子（Human Basic Fibroblast Growth
Factor，hbFGF）。WI38 细胞培养液成分 ：最低基础
培 养 液（Minimum essential medium，MEM），FBS，
NEAA，Pen/Strep。以上试剂均购自 Gibco 公司。小
鼠卵母细胞培养和显微操作用试剂 ：M2 培养液（迈
晨 ），M16 培 养 液（ 迈 晨 ）， 矿 物 油（Sigma）。 构
建重组质粒所用试剂盒 pENTR 5-TOPO TA cloning
Kit（Invitrogen），pENTR Directional TOPO cloning
Kit（Invitrogen），Gateway LR Clonase Ⅱ Plus Enzyme
Mix Kit（Invitrogen）。质粒转染所用试剂 ：opti-MEM
（Gibco），Lipofectamin 2000（Invitrogen）。
1.2 方法
1.2.1 人 ZP2 启动子 300 bp 和 2 500 bp 片段的克隆
人 ZP2 启动子片段根据已知序列（Enrez Gene ID ：
7783）进行引物设计（表 1），模板为人 WI38 细胞
的基因组 DNA（基因组的提取按照 DNeasy Blood &
Tissue Kit（QIAGEN）使用说明进行）。利用 Taq 聚
合 酶（Invitrogen） 进 行 PCR 反 应， 反 应 总 体 积 为
50 μL，其中 5 μL 10×buffer-MgCl2，1 μL 10 mmol/L
dNTP，1 μL10 μmol/L hZP2-300-F primer/ hZP2-2 500-F
primer，1 μL 10 μmol/L hZP2-R primer，4 μL 57 ng/mL
WI38 genome，0.2 μL Taq Polymerase，38.3 μL ddH2O。
反应程序 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，60℃/65℃ 30 s，
72℃ 30 s（300 bp 片段）/2 min 30 s（2 500 bp 片段），
共 35 个 循 环 ；72℃ 10 min。PCR 产 物 经 Invitrogen
公司测序确认。
1.2.2 慢 病 毒 包 装 所 有 病 毒 包 装 用 质 粒 使 用
QIAGEN Plasmid Maxi Kit（QIAGEN）进行去内毒素
质粒大提。病毒包装用 293FT 细胞铺在 175 cm2 培
养瓶中，待细胞密度约 90% 时可用于病毒包装。病
毒包装液 A ：120 μL Lipofectamine + 5 mL Opti-MEM，
包 装 液 B ：10 μg 病 毒 包 装 质 粒 Vsvg+ 15 μg 病 毒
包装质粒 ∆8.9 + 10 μg ZP2 报告载体 + 10 mL Opti-
MEM. 室温静置混合液 A 和 B 5 min，将 A 和 B 振
荡混合，室温静置 20 min。之后移除 293FT 细胞中
原有培养液，将 AB 混合溶液均匀铺在细胞表面，
37℃恒温箱中培养 6 h 后弃掉培养瓶中的 AB 混合
2015,31(11) 253罗梦圆等 ：人类卵母细胞报告系统的构建
液，加入 18 mL 293FT 细胞培养液（不含 G418 和
PEN/STRIP）。将培养瓶转入慢病毒培养室中 37℃恒
温培养 72 h。之后收集培养瓶中的悬浮液入 50 mL
离 心 管 中，2 000 r/min 离 心 5 min， 上 清 用 Millex-
HV 0.45 μm 的滤器过滤。产物在 -80℃条件下保存。
1.2.3 未分化 H9 细胞的病毒感染 用于感染的 H9
细胞铺在经 matrigel（BD）预处理的 6 孔板中至密
度 50% 时用于病毒感染。移除细胞中原有的培养液，
每孔加入 1 mL 病毒原液。37℃恒温培养 6 h 后每孔
补充 2 mL 完全培养液，37℃恒温培养过夜。24 h 后
弃去细胞中病毒溶液，每个孔加入 2 mL 完全培养液，
37℃培养过夜后弃去培养液，用含 blasticidin 的培养
液筛选出已被成功感染的细胞，连续筛选 3-5 d，每
天更换一次培养液。
1.2.4 细胞 DAPI 染色和荧光显微观察 细胞弃去原
有培养液，磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，
PBS）清洗两次后，加入适量 4% 多聚甲醛（完全覆
盖细胞表面即可），室温固定 15 min。去除多聚甲醛，
PBS 清洗后，加入含 1 μg/mL DAPI 染料的 PBS，避
光染色 20 min。弃去染液，PBS 清洗后在荧光显微
镜下观察。
1.2.5 小鼠卵母细胞的显微注射和体外培养 小鼠
卵母细胞从 12 周龄 B6D2F1 小鼠卵巢中获得，置于
在 M2 培养液中。利用 Eppendof NK2 显微操作仪，
将吸卵针连接到控制器上，调整到合适位置。向注
射针中加入待注射质粒，质粒需用去内毒素质粒大
提方法提取，并溶解在分子生物学级 H2O 中，再将
注射针连接控制器。向培养皿盖上滴加一滴 M2 培
养液（5-10 μL），并用矿物油封住液滴后，将之移
至载物台上。调整两操作臂，使两针均浸入 M2 液
滴中，使之接近培养皿底部，但不能触底。将准备
好的卵母细胞移入该液滴，吸卵针保持卵母细胞位
置，注射针将一定量报告质粒注射入卵母细胞细胞
核中。注射完毕的小鼠卵母细胞转移至 M16 培养液
中，37℃ CO2 培养箱内培养过夜，再荧光观察。
2 结果
2.1 人ZP2启动子300 bp和2 500 bp片段报告载体
的构建
根据人 ZP2 基因启动子序列设计相应上下游引
物（表 1），以 WI38 细胞系基因组为模板，PCR 反
应后将产物通过 DNA 电泳检测，在预期片段大小
位置有特异条带（图 1）。回收该条带并通过酶切连
接到 pENTR-5-TOPO 载体，产物经测序确定序列和
插入方向无误。将带有 ZP2 基因启动子的重组质粒
pENTR-5-ZP2 promoter 与带有报告基因 eGPF 的质
粒 pENTR-D-eGFP 和 2k7bsd 质粒混合，其上带有的
同源重组的位点发生重组得到 ZP2-300-eGFP 和 ZP2-
2500-eGFP 重组质粒，经测序检验插入位点和序列
无误。
表 1 PCR 反应所用引物序列
引物名称 序列（5-3） 用途
hZP2-2 500-F CGCTCTGGAGAAAGACACCATCTCGA 人 ZP2 启动子 300 bp 片段 PCR 反应
hZP2-300-F CCATGATTCTCTTTGGCTCTACATTGC 人 ZP2 启动子 2 500 bp 片段 PCR 反应
hZP2-R AGCAGAAGACACTACCAGATCAACCAG 人 ZP2 启动子 300 bp、2 500 bp 片段 PCR 反应
5000
bp
M 1 M 12
3000
2000
1500
1000
500
400
300
5000
bp
3000
2000
1500
1000
500
A B
M ：DNA Marker ；1 ：退火温度为 60℃时的 PCR 产物条带 ；
2 ：退火温度为 65℃时的 PCR 产物条带
图 1 人 ZP2 启动子 300 bp（A）和 2 500 bp（B）片段
PCR 结果
2.2 带有人ZP2启动子报告载体的慢病毒包装和
滴度测定
重组质粒经过去内毒素质粒大提后用于病毒的
包装，用于包装病毒的 293FT 细胞在转染带有人
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ZP2 启动子报告载体的重组质粒和包装病毒的辅助
质粒 72 h 后可以观察到预期的细胞凋亡现象，此时
收集到的细胞上清液中含有大量带人 ZP2 报告载体
的慢病毒（图 2）。
病毒滴度用单位体积的病毒悬液所能感染的细
胞数目表示。将获取的病毒悬液稀释到不同浓度后
感染 WI38 细胞，用含 2 μg/mL blasticidin 的细胞培
养液筛选 4 d，计算筛选后的剩余细胞数，计算得出
病毒滴度（表 2）。滴度在 104 及以上的病毒可用于
后续实验。
A B
A ：正常生长的 293FT 细胞 ； B ：转染病毒包装质粒 72 h 后的 293FT 细胞
图 2 带有人 ZP2 启动子报告载体的慢病毒包装结果
表 2 慢病毒滴度测定结果
病毒名称
稀释倍数
10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 滴度
ZP2-300 bp-eGFP 12030 870 ND ND ND 1.04×106
ZP2-2500 bp-eGFP —— 6690 630 ND ND 6.5×106
注 ：ND ：细胞数目过少，忽略不计 ；—— ：细胞数目过多，无法计数
2.3 带有人ZP2启动子300 bp和2 500 bp片段报告
载体在非卵细胞中无报告荧光表达
将带有人 ZP2 启动子 300 bp 和 2 500 bp 片段
报告载体的慢病毒感染 WI38（人成纤维细胞）和
未分化 H9（人胚胎干细胞系）细胞，阳性对照使
用 EF1α-eGFP 病 毒 感 染 293FT 细 胞， 一 定 浓 度 的
blasticidin 筛选 4 d 后进行荧光显微观察，结果（图
3）显示两种报告载体慢病毒在感染 WI38 和未经分
化的 H9 细胞后都无绿色荧光蛋白表达，而阳性对
照细胞中可以观察到明显的绿色荧光。
2.4 带有人ZP2启动子2 500 bp片段的报告载体在
小鼠卵细胞中检测到报告荧光
从 12 周大小的 B2D6F1 雌性小鼠的卵巢中取得
A
B
C
D
E
DAPI FITC
DAPI FITC
DAPI FITC
A ：ZP2-300 bp-eGFP 病毒感染后的 WI38 细胞 ；B ：ZP2-2500 bp-eGFP 病毒
感染后的 WI38 细胞 ；C ：ZP2-300 bp-eGFP 病毒感染后的未分化 H9 细胞 ；
D ：ZP2-2500 bp-eGFP 病毒感染后的未分化 H9 细胞 ；E ：EF1α-eGFP 病毒感
染后的 293FT 细胞
图 3 ZP2-300-eGFP 和 ZP2-2500-eGFP 病毒分别感染
WI38 细胞和未分化的 H9 细胞后荧光观察结果
小鼠 GV（Germinal vesicle）期卵母细胞，放入 M2
培养液培养，将带有人 ZP2 启动子片段的报告载体
显微注射入 GV 期卵母细胞的细胞核中，注射后卵
母细胞转入 M16 培养液，37℃恒温培养，24 h 后观
察细胞荧光。对照组细胞从小鼠卵巢中取出后未进
行注射处理即放入培养箱中培养。培养 24 h 后，注
射 ZP2-2500-eGFP 质粒的小鼠卵母细胞可观察到绿
2015,31(11) 255罗梦圆等 ：人类卵母细胞报告系统的构建
色荧光，而注射 ZP2-300-eGFP 质粒和对照组细胞无
绿色荧光。将有绿色荧光的卵母细胞继续培养 48 h
后再次进行观察，仍能观察到微弱绿色荧光。
的难点之一。2003 年，Hubner 等［14］首次由小鼠胚
胎干细胞自发分化得到卵细胞。此后 Gejisen 等［15］
将小鼠胚胎干细胞分化为胚体，利用 SSEA1 作为
筛选标记富集其中的原始生殖细胞，视黄酸体外诱
导分化出类似精子的细胞，将其显微注射入小鼠卵
细胞后能发育到囊胚时期。2006 年，Nayernia 等［1］
利用 Stra8 和 Prm1 报告系统，将小鼠胚胎干细胞体
外分化类似精子的细胞，用其受精后的卵细胞再植
入小鼠体内并成功获得了后代，但这些后代在体型
大小上与正常小鼠不同，且都在未成年之前死亡。
2011 年，Hayashi 等［16］用 SSEA1 和 Integrinβ3 作为
筛选标记，从诱导分化的小鼠胚胎干细胞筛选出原
始生殖细胞，移植回小鼠睾丸后发育为成熟精子，
用这种方法获得的精子能使小鼠卵细胞受精并发育
为成熟后代。2012 年，该作者又用类似的方法获得
了小鼠的成熟卵细胞，这种卵细胞能被正常小鼠精
子受精并发育为成熟后代［17］。另一方面，在人类胚
胎干细胞的研究中，早期多采用简单流式分选或标
记蛋白流式分选的方式来分离分化得到的原始生殖
细胞，但一直未能获得单倍体［18，19］。2009 年，Kee 等［2］
采用 VASA-eGFP 报告系统，从 BMPs 诱导分化的人
类胚胎干细胞中富集原生殖细胞，并通过高表达内
源因子 DAZL\BOULE\DAZ 的方式最终获得单倍体精
细胞。但至今尚未有成功将人胚胎干细胞体外分化
有功能的成熟卵细胞的研究报道。
使用体外分化方式获得人类成熟卵细胞面临众
多问题，如早期分化过程中生殖细胞命运的确定，
减数分裂的起始和完成，卵泡结构的成熟等。卵细
胞发育过程中，初级卵泡阶段会发生卵细胞第一次
减数分裂停滞的恢复，此时卵细胞与颗粒细胞之间
的相互作用较之前会显著增强，这些变化对于卵细
胞后期的发育成熟极为重要［20］。因此，建立报告系
统，有效地指示出分化到初级卵泡及其之后时期的
细胞对于最终获得成熟卵细胞的研究很有意义。
本研究采用不同片段长度的人 ZP2 启动子与绿
色 荧 光 蛋 白 eGFP 构 建 ZP2-300-eGFP 和 ZP2-2500-
eGFP 两个报告系统，一般认为基因的启动子越长越
利于保持其表达的时空特异性，片段过短会丢失某
些关键调控元件，但较长的片段整合入基因组的效
率较低，同样对报告系统的指示作用造成影响。从
A B
C D
E F
G H
A，B ：注射 ZP2-2500-eGFP 质粒的小鼠卵母细胞体外培养 24 h 后的观察结
果 ；C，D ：注射 ZP2-2500-eGFP 质粒的小鼠卵母细胞体外培养 72 h 后的观
察结果 ；E，F ：对照组小鼠卵母细胞体外培养 24 h 后的观察结果 ；G，H ：
注射 ZP2-300-eGFP 质粒的小鼠卵母细胞体外培养 24 h 后的观察结果；A，C，
E，G ：明场观察 ；B，D，F，H ：绿色荧光观察
图 4 经显微注射人 ZP2 报告载体的小鼠卵母细胞体外培
养和荧光观察结果
3 讨论
体外分化培养干细胞得到成熟生殖细胞具有重
要的科学价值和临床意义，但成熟生殖细胞的形成
需要进行减数分裂，其外观和功能都发生了重大变
化。因此，此类研究多年来一直是干细胞研究领域
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WI38 细胞核未分化的胚胎干细胞 H9 的实验看，这
两种不同长度的启动子都不会启动荧光报告基因在
这些细胞中的表达。而显微注射和荧光观察的结果
表明，ZP2-2500-eGFP 报告系统可特异启动荧光报
告基因在小鼠卵母细胞中的表达，可作为一种有效
的工具应用于胚胎干细胞向卵母细胞分化的研究中。
4 结论
成功构建 ZP2-300-eGFP 和 ZP2-2500-eGFP 两个
报告系统，通过在 WI38 细胞、未分化的 H9 细胞核
小鼠卵母细胞中的验证，发现 ZP2-2500-eGFP 报告
系统可以特异启动荧光报告基因在卵母细胞中的表
达，而在其他细胞系中无报告荧光表达。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）