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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):125-131
武夷菌素（Wuyiencin）是不吸水式链霉菌武夷
变种（Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis）产生
的农用抗生素，主要用于防治作物真菌病害［1］，如
黄瓜白粉病，番茄叶霉、灰霉病等，具有广谱、高
效、低毒的特点，在现代化生态农业和绿色食品生
产中具有广阔的应用前景。目前，菌株效价较低已
经成为限制武夷菌素产业化发展的障碍之一，因此，
选育高产菌株、降低生产成本是武夷菌素研究的核
收稿日期 ：2014-11-17
基金项目 ：公益性行业（农业）科研专项（201103002，201303025），国家自然科学基金项目（31371985, 31401796）
作者简介 ：王家旺，男，硕士研究生，研究方向 ：农用抗生素 ；E-mail ：wjiawang1014@163.com
通讯作者 ：张克诚，男，博士，研究员，研究方向 ：农用抗生素 ；E-mail ：zhangkecheng@sina.com
高产武夷菌素 wysR 基因过表达菌株的筛选及菌株生物
特性研究
王家旺  葛蓓孛  刘艳  刘彦彦  张克诚
（中国农业科学院植物保护研究所 农业部作物有害生物综合治理重点实验室，北京 100193）
摘 要： 以武夷菌素生物合成正调控基因 wysR 过表达菌株为初选材料，通过琼脂块法对 2 060 个过表达菌株单菌落进行初筛，
得到 35 个优选菌株，再采用摇瓶发酵复筛的方法筛选出 9 个高产菌株，并通过菌株遗传稳定性分析，最终确定 W-273 菌株为最优
菌株。研究武夷菌素 wysR 基因过表达菌株 W-273 的生理生化特征，发现与原始菌株 CK-15 相比，W-273 菌株生长迅速，产孢量
增加且产孢时间提前，W-273 菌株生长 3-4 d 即可完成产孢，较菌株 CK-15 产孢时间提前了 3-4 d ；电子显微镜观察 W-273 菌株和
CK-15 菌株孢子形态不同，W-273 菌株孢子呈椭圆形或杆状，CK-15 菌株孢子呈圆形 ；通过摇瓶发酵表明 W-273 菌株较 CK-15 菌
株代谢旺盛，抗生素产量提高 79%-289%，且最佳发酵时间缩短 4-8 h。
关键词 ： 武夷菌素 ；过表达菌株 ；wysR 基因 ；筛选
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.019
Screening of High-yield Strain of Wuyiencin Gene wysR Over-
expression and Its Biological Characteristics
Wang Jiawang Ge Beibei Liu Yan Liu Yanyan Zhang Kecheng
（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，
Beijing 100193）
Abstract ： In this research the over-expression strains with positive-regulating gene wysR synthesized from Wuyiencin were utilized as
primary materials, 35 relatively optimal strains were selected from 2060 individual colonies of over-expression strains by agar blocks, then 9
high-yield strains were screened out adopting the method of shake flask fermentation. Ultimately, the strain W-273 was determined as the optimal
strain by genetic stability analysis. Comparing the physiological and morphological characteristics between the strain of W-273 and original
CK-15, W-273 strain grew faster, the production of spore was higher, and the time of spore production was in advance. The time to complete
spore production for W-273 strain was 3-4 d, and this was in advance for 3-4 d than the original strain CK-15. Through electron microscope
observation, the spores of W-273 were oval or rod, and the CK-15 strains were circular. Shake flask fermentation showed that strain W-273 had a
higher metabolism compared to strain CK-15, antibiotic production increased 79%-289%, and the best fermentation time shortened 4-8 h.
Key words ： Wuyiencin ；over-expression strain ；wysR gene ；screen
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8126
心内容。
在武夷菌素育种方面，曾采用了原生质体融合［2］
以及诱变育种的方法包括 NTG、紫外诱变、低能碳
离子注入和亚硝基胍诱变［3］及 60Coγ-射线诱变［4］。
虽然采用传统的育种方法已经使原始菌株效价提高
了近 1 倍多，但由于传统的育种工作量大，具有不
定向性，且菌株经过多次传代培养后易发生回复突
变。因此，采用基因工程手段进行育种，克服传统
育种的随机性和盲目性，因其具有目标明确、效率高、
菌株稳定等优点，成为近年来研究的热点。
实验室前期从原始菌株 CK-15 中得到一个武夷
菌素生物合成正调控基因 wysR，将该基因克隆至具
有强启动子 psf 的载体 PSF14 上，接合转移至原始
菌株 CK-15 中，构建了过表达菌株 ooR［5］。通过比
较发现，该菌株较原始菌株的效价有显著提升。构
建过表达菌株使用的质粒是一种整合型穿梭质粒载
体，其转入链霉菌之后与基因组整合的位点是随机
的，得到的转化子并不全都使抑菌活性得到大幅提
高。因此，要想获得高效、优良的菌株必须有一个
进一步的筛选过程。通过平皿琼脂块法初筛，摇瓶
发酵复筛的方法从菌株单菌落中筛选高产菌株的方
法简单可行且比较直观，廖晓珣等［6］从井冈霉素的
吸水链霉菌井岗变种 J1 单菌落中经过平皿初筛、摇
瓶复筛获得菌株 J1-U-D，效价达 25 874×10-6g/mL，
比出发菌株提高 29%。
本研究以武夷菌素 wysR 过表达菌株 ooR 为基础，
通过琼脂块法初筛、摇瓶发酵复筛，以期得到高产、
稳定的武夷菌素 wysR 基因过表达菌株 ；同时观察高
产菌株在 MS 培养基平板不同时间菌丝孢子生长情
况，检测菌株发酵过程中不同发酵时间菌丝体干重、
发酵液糖含量和发酵液效价的变化情况，旨为改进
武夷菌素发酵工艺和基因工程育种提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供 试 菌 株 武 夷 菌 素 原 始 菌 株 CK-15
（Streptomyces anhygroscopicus var. wuyiensis CK-15）；
武 夷 菌 素 wysR 基 因 过 表 达 菌 株 ooR（St. wuyiensis
ooR），该菌株是将原始菌株 CK-15 中得到的武夷菌
素生物合成正调控基因 wysR 克隆至具有强启动子
psf 的载体 PSF14 上，重新接合转移至菌株 CK-15 中，
构建的过表达菌株 ooR，前期研究表明菌株 ooR 在
MS 培养基上长势良好［7］；生物测定指示菌用红酵
母（Rhodoiorula rubra），以上菌株均由中国农业科
学院植物保护研究所农用抗生素组提供。
1.1.2 供试培养基 菌种培养采用 MS 培养基 ：20 g
黄豆饼粉放入蒸馏水中煮 30 min，用 4 层纱布过滤
定容至 1 000 mL，每 100 mL 分装入盛有 2 g 甘露醇
和 1.7 g 琼脂粉的 250 mL 三角瓶中，121℃高温湿热
灭菌 30 min ；生物测定用 PDA 培养基 ：配置见参考
文献［8］；56# 发酵培养基（g/L）：玉米粉 30、黄
豆饼粉 20、葡萄糖 20、硫酸铵 4、碳酸钙 3 ；可溶
性发酵培养基（g/L）：葡萄糖 20、酵母粉 20、氯化
铵 4、硫酸镁 0.4 。
1.2 方法
1.2.1 发酵液制备及生物活性测定
1.2.1.1 发酵液制备 采用 MS 培养基 28℃恒温培
养武夷菌素产生菌，培养 5-7 d 后用灭菌牙签将
培养基划成 1 cm2 菌块至装有 50 mL 发酵培养基的
250 mL 三角瓶中，28℃、220 r/min 摇床震荡培养，
滤纸过滤即得发酵液。
1.2.1.2 生物活性测定 采用 PDA 培养基以红酵母
为指示菌，管碟法［9］测定武夷菌素效价，武夷菌素
效价标准曲线方程为：y=7.6932x-106.33，R2=0.977（x
代表抑菌圈直径，y 代表标准液浓度）。
1.2.2 武夷菌素高产菌株筛选
1.2.2.1 单孢子悬浮液的制备 在武夷菌素 wysR 基
因过表达菌株的 MS 培养基表面加入 10 mL 无菌水，
用灭菌牙签刮取培养基表面孢子，灭菌纱布过滤，
将菌丝体和单个孢子分开，过滤液即为单孢子悬
浮液。
1.2.2.2 琼脂块法初筛 单孢子悬浮液稀释后均匀
涂布于 MS 培养基平板上，28℃恒温培养箱倒置培
养 3 d。用灭菌打孔器打出直径为 5 mm 的单菌落琼
脂块，接种针挑取单菌落琼脂块置于含 3% 红酵母
菌的 PDA 培养基表面，间隔一定距离摆放，带菌面
朝上，28℃培养 24 h，挑选抑菌圈直径较大的菌株
转接到 MS 培养基，28℃恒温培养 7 d。
1.2.2.3 摇瓶发酵复筛 待初筛获得的菌株在 MS
2015,31(8) 127王家旺等：高产武夷菌素 wysR基因过表达菌株的筛选及菌株生物特性研究
表面产生大量孢子，接种到发酵培养基，摇瓶发酵
60 h，管碟法测效价。每个菌株重复 3 瓶，取平均值，
以原始菌株为对照，筛选出几株较优菌株。
1.2.2.4 遗传稳定性实验 将经复筛选出的菌株，
接种于 MS 平板培养基上进行传代培养 5 代，观察
各代菌株生长状况，并对各代菌株进行摇瓶发酵实
验，管碟法测效价，分析比较传代前后菌株产素能
力的变化。
1.2.3 高产菌株生物特性研究
1.2.3.1 高产菌株形态特征和培养特征的观察 在
MS 培 养 基 上 培 养 过 表 达 菌 株 W-273 和 原 始 菌 株
CK-15，每天观察记录菌株在 MS 培养基平板上的生
长情况。并采用插片培养法［10］分别在光学显微镜
和电子显微镜下观察菌丝和孢子生长情况及形态特
征，光学显微镜镜检时用镊子小心拔出盖玻片，有
菌的一面朝下放在载玻片上直接观察即可 ；电子显
微镜镜检时先将盖玻片放入 2%-4% 戊二醛固定液
中 固 定 1-2 d，0.1 mol/L pH7.2 PBS 缓 冲 液 洗， 用
1% OsO4 后固定 1-2 h 用重蒸水冲洗 30 min，随后用
30%、50%、70%、80%、90%、95% 和 100% 乙 醇
梯度脱水，每级 15-20 min，样品脱水后用醋酸异戊
酯处理，CO2 临界点干燥，干燥好的样品粘贴在样
品台上，用离子溅射仪表面喷金，喷金后样品在扫
描电镜下扫描，拍照并记录。每天取盖玻片在光学
显微镜下观察菌丝和孢子生长情况，待产生大量孢
子后在电子显微镜下观察孢子形态。
1.2.3.2 菌丝体干重测量 将过表达菌株 W-273 和
原始菌株 CK-15 接种到纯液体发酵培养基，发酵培
养 8、16、24、32、40、48、56、64、72 和 80 h 后，
发酵液用事先称好重量的滤纸过滤，过滤完在 80℃
烘箱烘 4 h 后称重，称重重量减去滤纸重量即为菌
丝体干重。
1.2.3.3 发 酵 液 总 糖 含 量 在 56# 发 酵 培 养 基 中
接种过表达菌株 W-273 和原始菌株 CK-15，发酵
培 养 8、16、24、32、40、48、56、64、72 和 80
h 后 采 用 DNS 法［11］ 测 定 发 酵 液 中 总 糖 含 量， 以
葡萄糖为标准品制定的标准曲线方程为 y=0.642x+
0.0406，R2=0.9966（x 代 表 520 nm 吸 光 值，y 代 表
葡萄糖含量）。
1.2.3.4 武夷菌素效价 在 56# 发酵培养基中接种
过表达菌株 W-273 和原始菌株 CK-15，发酵培养
24、32、40、48、56、64、72 和 80 h 后管碟法检测
武夷菌素效价。
2 结果
2.1 武夷菌素高产菌株筛选
2.1.1 高产菌株筛选 将单孢子悬浮液涂布于 MS
培养基 28℃培养 3 d 后，产生的单菌落经琼脂块法
初筛，从 2 060 株菌株中选育出 35 株抑菌圈直径相
对较大菌株，摇瓶发酵复筛后管碟法测效价，结果
见 表 1， 其 中 菌 株 W-20、W-141、W-273、W-306、
W-381、W-443、W-602、W-802、W-995 的效价最高，
较菌株 CK-15 效价提高 195%-258%，选定这 9 株菌
株作为第一代菌株进行遗传稳定性测定。
2.1.2 高产菌株的遗传稳定性 将筛选到的高产菌
株再传代 4 次，共 5 代菌株，观察各代菌株生长状
况，菌株 W-381 和 W-1001 分别传至第 4 代和第 5
代时菌株生长减慢、产孢时间推迟、产孢量减少，
需培养 7-8 d 完成整个生长过程，其他菌株生长稳定。
并分别对各代菌株进行摇瓶发酵，测定效价，结果
见表 2。筛选到的菌株第一代效价均值可达到 8 309
μg/mL，从第一代传到第二代后菌株效价下降明显，
再传代后除菌株 W-273 和 W-443 外其他菌株效价均
有不同程度的下降，菌株 W-273 和 W-443 传代稳定
性较好，且 W-273 菌株效价较 W-443 菌株高，最终
确定 W-273 菌株为筛选到的最优菌株，已将该菌株
保存至中国普通微生物菌种保藏管理中心（保藏号
为 9604）。
2.2 高产菌株W-273生物特性
2.2.1 菌株生理形态特征 将高产菌株 W-273 和原
始菌株 CK-15 接种到 MS 培养基平板，观察生长状
况及用插片法观察菌丝及孢子生长状况，由图 1 可
知，高产菌株 W-273 较原始菌株 CK-15 菌丝生长
较快产孢量增加且产孢时间提前，高产菌株 W-273
生长 3-4 d 即可完成产孢，较原始菌株 CK-15 提前
3-4 d。菌株 W-273 孢子比菌株 CK-15 孢子稍大，且
W-273 菌株孢子呈椭圆形或杆状，CK-15 菌株孢子
呈圆形（图 2）。
2.2.2 菌株的生理生化特征 将高产菌株 W-273 和
原始菌株 CK-15 接种到可溶性发酵培养基 56# 发酵
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8128
培养基发酵不同时间后，分别测量菌丝体干重、发
酵液总糖含量以及武夷菌素效价。图 3 显示，菌
株 W-273 在 8-24 h 时菌丝体生长量最多，而菌株
CK-15 在 16-24 h 时菌丝体生长量最多，菌株 W-273
较 CK-15 菌丝大量生长时间提前约 4-8 h。对应不同
发酵时间发酵液总糖含量，发酵过程中菌株 W-273
消耗糖含量最多的两个时间段为发酵前期的 8-16 h
和 24-32 h，菌株 CK-15 要推迟到 16-24 h 和 32-40
h，这两个时间段可能分别为菌丝体生长最迅速的时
段以及菌株开始产生抗生素的时段，两个时段 W-273
菌株较 CK-15 菌株约提前 8 h。
如图 4 所示，W-273 发酵 24 h 后发酵液已经有
较低的抑菌活性，对应的 CK-15 菌株发酵液要推迟
至 32 h，并且 W-273 菌株发酵最优时间为 56 h，较
CK-15 菌株的 64 h 提前约 8 h。过表达菌株 W-273
效价稳定在 5 000-7 000 μg/mL，较野生菌株 CK-15
效价 1 800-2 800 μg/mL 提高 79%-289%，W-273 菌
株发酵液抑菌活性明显增强（图 5）。
3 讨论
近年来，基因工程技术在抗生素的改造及菌种
选育工作中的应用越来越多［12］，其中常用的方法包
括改造代谢途径、改造抗生素生物合成基因簇、改
造核糖体和原生质体融化技术。
生物合成基因簇携带编码调控因子的调控基
因，调控因子是一类在转录水平调节基因表达的蛋
白质，它们能特异性地结合到该基因簇中的核酸调
控元件，激活或阻碍抗生素结构基因转录成 mRNA。
过量表达编码激动子基因和失活编码阻遏子的基因，
表 1 武夷菌素产生菌摇瓶复筛结果
菌株编号 效价 /（μg·mL-1） 菌株编号 效价 /（μg·mL-1） 菌株编号 效价 /（μg·mL-1）
W-20 8142±109 W-443 8603±261 W-949 6449±522
W-92 7003±87 W-602 8603±435 W-995 7003±435
W-133 7588±22 W-609 7157±22 W-1001 7342±239
W-141 8788±218 W-628 7557±87 W-1062 7280±22
W-180 7988±44 W-632 7403±65 W-1075 5802±283
W-183 8049±261 W-641 6911±370 W-1171 5711±174
W-273 8911±44 W-687 7311±44 W-1176 6326±235
W-306 8234±131 W-741 7772±109 W-1188 6203±102
W-366 7619±218 W-802 7865±218 W-1194 6665±102
W-381 8849±261 W-821 6911±22 W-1258 6172±227
W-420 8049±174 W-842 7742±479 W-1326 5464±176
W-435 7896±457 W-898 6541±457 CK-15 2488±73
注 ：表中数据为 x-±s，下同
表 2 武夷菌素高产菌株的遗传稳定性
菌株编号
效价 /（μg·mL-1）
第 1 代 第 2 代 第 3 代 第 4 代 第 5 代
W-20 8142±109a 6215±346b 5738±127b 6138±418b 5394±437b
W-141 8788±218a 6061±236b 6011±209b 5676±480b 5471±404b
W-273 8911±44a 6753±297b 6318±531b 6522±548b 6343±419b
W-306 8234±131a 5984±186b 5673±226b 6369±463b 5522±346b
W-381 8849±261a 5907±241b 5702±372b 5984±534b 4958±420b
W-443 8603±261a 6138±147b 5908±523b 6215±558b 6086±598b
W-602 8603±435a 5753±200b 5324±236b 4984±491b 5343±490b
W-802 7865±218a 6753±117b 5642±325bc 4522±548c 5291±527bc
W-1001 7342±239a 6445±346ab 5348±277bc 4753±284c 5214±418bc
CK-15 2488±73bc 2424±77c 2637±52abc 2742±59ab 2778±59a
注 ：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）
2015,31(8) 129王家旺等：高产武夷菌素 wysR基因过表达菌株的筛选及菌株生物特性研究
是增加抗生素的最为快速有效的方法［13］。Anton
等［14］通过增加纳他链霉菌中编码 PAS/LuxR 激动
子 pimM 基因的拷贝数使匹马霉素产量提高了 2.4
倍。Martinz-Costa 等［15］通过将变铅青链霉菌内编码
LysR-type 转录调节子的基因 actVB-orf10 失活，使放
线菌紫素产量提高 3.5-5 倍。
武夷菌素生物合成基因簇中的 wysR 基因包含
功能保守的 PAS-LuxR 结构域，研究表明 PAS-LuxR
调控子在不同的多烯类链霉菌中有着相同的调控方
式，这些基因负责聚酮化合物链的构建，糖基的脱
水与链接，ABC 转运蛋白以及作为调控的靶基因［16］。
Anton 等［14］研究中报道了含有 PAS-LuxR 结构域的
调控因子 PimM 是匹马霉素生物合成途径中的正调
MSษޫส
100×
1 k×
W-273ษޫ4 d CK-15ษޫ4 d W-273ษޫ7 d CK-15ษޫ7 d
图 1 高产菌株 W-273 菌丝孢子观察结果
a A
b B
a ：W-273（4.0 k×）；A ：W-273（15.0 k×）；b ：CK-15（4.0 k×）；
B ：CK-15（15.0 k×）
图 2 高产菌株 W-273 孢子电镜扫描图
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0
0.1
0.2
A
B
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
8 16 24 32 40 48 56 64 72 80
ਁ䞥⏢ѝᙫ㌆ਜ਼䟿mg·mL-1 㧼эփᒢ䟽g·100 mL-1  ਁ䞥ᰦ䰤h
W-273 CK-15
W-273 CK-15
A 和 B 分别代表菌丝体干重曲线和发酵液总糖含量曲线
图 3 不同发酵时间菌株 W-273 菌丝体生长情况及发酵液
总糖含量变化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8130
控因子。魏杰等［17］将纳他霉素生物合成基因簇中
的基因 PimM 置于强启动子 PermE 之下进行整合性
表达，构建过表达载体 PBJPM，并接合转移至金褐
链霉菌 SYAU0709 中，通过摇瓶发酵和 HPLC 检测
分析发现，有些转化子的金褐霉素产量比野生型菌
株提高 3-4 倍，说明 PimM 基因在金褐链霉菌中有
促进金褐霉素合成的作用，并且遗传性能稳定。
前期刘彦彦等［5］ 将 wysR 基因克隆至具有强
启动子 psf 的载体 PSF14 上，并接合转移至原始菌
株 CK-15 中，构建了过表达菌株 ooR，效价稳定在
3 000-4 000 μg/mL。传统的诱变方法具有盲目性和
随机性，突变率仅有 1/103-1/106，并且突变株中多
数为负向变异，正突变率低［18］，导致育种工作量大，
随机性强，效率低下。本实验通过琼脂块法及摇瓶
发酵的方法筛选高产过表达菌株，最终从 2 060 株
过表达菌株中筛选得到高产菌株 W-273，较出发菌
株 ooR 效价提高 1 倍。基因工程育种目标明确，正
突变率显著提高，此次筛选的 2 060 株过表达菌株
的抑菌效果较原始菌株均有显著的提高，工作量减
小，育种效率显著提高。
通过 MS 培养基平板和插片法显微镜观察 wysR
基因过表达菌株 W-273 菌丝孢子生长情况，结合发
酵过程中的生理生化指标包括菌丝体干重、发酵液
糖含量和发酵液抑菌活性，比较其生物学特性。结
果 表 明 与 原 始 菌 株 CK-15 相 比，W-273 菌 株 生 长
迅速，产孢量增加且产孢时间提前 ；W-273 菌株较
CK-15 菌株代谢旺盛，发酵前期菌丝体增长快，糖
消耗量大，产素时间提前 4-8 h，并且抗生素产量提
高 79%-289%，说明 wysR 基因可以正调控菌株的生
长速率、产孢量及武夷菌素的生物合成，这一结论
与刘彦彦［5］的结论是一致的。观察菌株孢子形态，
W-273 菌株孢子呈椭圆形或杆状，CK-15 菌株孢子
呈圆形 ；W-273 菌株菌体形态的变化说明 wysR 不仅
与武夷菌素的生物合成有关，而且可以影响菌体形
态分化，这与天蓝色链霉菌的情况相类似，天蓝色
链霉菌中 bld、afs、abs 等基因不仅可以调控抗生素
的生物合成，而且可以影响菌体的生长［19］，而基因
影响菌体形态变化的分子机制有待进一步的研究。
4 结论
通过琼脂块法初筛以及摇瓶发酵复筛的方法从
武夷菌素 wysR 基因过表达菌株单菌落中筛选出高产
武夷菌素 wysR 基因过表达菌株 W-273。研究 W-273
菌株的生物学特征，发现 W-273 菌株生长迅速，产
孢量增加且产孢时间提前，W-273 菌株产孢时间较
菌株 CK-15 提前了 3-4 d ；电子显微镜观察 W-273
孢子呈椭圆形或杆状，CK-15 菌株孢子呈圆形 ；通
过摇瓶发酵表明 W-273 菌株较 CK-15 菌株代谢旺盛，
抗生素产量提高 79%-289%，且最佳发酵时间缩短
4-8 h，W-273 菌株可以满足工业生产需要。
参 考 文 献
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W-273
CK-15
图 4 发酵过程中菌株 W-273 发酵不同时间效价变化
W-273 CK-15
图 5 培养 3 d 后 W-273 菌株发酵液对红酵母的抑菌效果
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（责任编辑 李楠）