全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
收稿日期 ：2012-07-06
基金项目 ： 国家重点基础研究发展计划（973 计划）资助项目（2010CB534912） ，教育部博士点基金资助项目（200806570003） ，贵州省国
际科技合作计划项目［黔科合外 G 字（2011）7008 号］ ，贵州省优秀人才省长资金资助项目（200822）
作者简介 ：张金彪，男，硕士研究生，研究方向 ：分子细胞生物学 ；E-mail ：550183934@qq.com.cn
通讯作者 ：许厚强，男，博士，教授，博士生导师，研究方向 ：细胞分子生物学 ；E-mail ：houqiang0524@yahoo.com
DNA 解旋酶是解开 DNA 双螺旋结构的酶，在
DNA 的复制、修复、重组、转录、维持染色体稳定
性等细胞代谢过程中都具有非常重要的作用［1-3］。
RecQ 解旋酶家族是 DNA 解旋酶中的一个重要家
族，人类 RecQ 解旋酶缺陷会引起遗传不稳定，导
致相关疾病如癌症［4，5］的发生。在人体中已经发现
RecQ1、BLM、WRN、RecQ4 和 RecQ5 五种 RecQ 解
旋酶，其中 BLM、WRN、RecQ4 缺陷会相应的引起
Bloom 综合症（BS）、Werner（WS）和 Rothmund-Tho-
Bloom 解旋酶突变体的克隆与表达
张金彪1，2，3  许厚强2，3  骆衡2，3  许庆贺1，2，3  陈祥2，3  李坤1，2，3
（1. 贵州大学生命科学学院，贵阳 550025 ；2. 贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室 动物科学学院，
贵阳 550025 ；3. 贵州大学贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室 动物科学学院，贵阳 550025）
摘 要 ： blm 基因的突变可导致 Bloom 综合症（BS），Bloom 综合症是一种罕见隐性常染色体遗传疾病，患者遗传不稳定并
易患多种类型癌症。临床发现 BS 患者细胞中的 BLM 的 RecQ-Ct 区域的 1 036 位半胱氨酸残基发生突变。运用生物信息学及分子生
物学技术，通过两轮重组 PCR，构建 985 位和 1 036 位氨基酸突变的 BLM 解旋酶多点突变基因，克隆到载体 pET-28a 中，并转化
至大肠杆菌 BL21（DE3）中进行表达。分离纯化获得了高纯度（>95%）的双突变型 BLM 解旋酶，并对其进行了 Western blotting
鉴定。这些结果可为进一步研究 BS 的致病机制奠定基础。
关键词 ： BLM 解旋酶 重组 PCR 多位点突变 基因克隆表达
Cloning and Expression of Bloom Helicase Mutant
Zhang Jinbiao1，2，3 Xu Houqiang2，3 Luo Heng2，3 Xu Qinghe1，2，3 Chen Xiang2，3 Li Kun1，2，3
（1. College of Life Science，Guizhou University，Guiyang 550025 ； 2. Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction in the
Plateau Mountainous Region，Ministry of Education，College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang 550025 ； 3. Guizhou Key
Laboratory of Animal Genetics，Breeding Reproduction，College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang 550025）
Abstract:  Bloom syndrome（BS）which is caused by mutation of BLM is an autosomal recessive disorder characterized by genomic
instability and the high rate of many types of cancer. Disease-causing missense mutations have been identified at 1 036 cysteines localized in the
RecQ-Ct domain. In this work, with bioinformatics and molecular biology technology, blm gene which 985 and 1 036 amino acids were mutated
was obtained by two cycles of recombinant PCR, and cloned into expression vector pET-28a, and transformed into the strain E. coli BL21（DE3）.
It was purified that double mutation BLM helicase is the high purity（>95%）, and identified by Western blotting. They could be pivotal for
understanding the pathogenic mechanisms of BS.
Key words:  BLM helicase Recombinant PCR Multisite mutation Gene cloning and expressing
mson 综合症（RTS）［6，7］。
BS 是一种常染色体隐性遗传疾病，其临床特征
表现为身躯矮小，出生前或出生后引起的生长阻滞，
面部有对光敏感的红斑，女性的生育能力较低，男
性不育，免疫缺陷及易患多种癌症［8，9］。BLM 解旋
酶由 1 417 个氨基酸组成，BLM 解旋酶在 DNA 解链
过程中表现为 3-5 极性，而且可以解开多种 DNA，
包括 3 端有缺口的双链 DNA、泡状 DNA、带有复
制叉的双链 DNA、G-四链体 DNA、D 型环状 DNA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期124
鼎国生物技术有限公司 ；BL21（DE3+）菌株、Top10
菌株、pMD®19-T Vector、pET-28a 质粒、dNTP、Pfu
高保真酶购自 TaKaRa ；2×Taq PCR Master Mix 购自
天根生化科技（北京）有限公司 ；其他试剂均为国
产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 根据 GenBank 中 blm 基因 cDNA
序列（CCDS10363.1），采用 Primer Premier 5.0 设计
引物 F 和 R，分别作为 BLM642-1290 的上下游引物 ：
F1 和 R1 互补，且都带有一个突变位点 985 位密码子
GAA → GGA ；F2、和 R2 互补，且都带有一个突变
位点 1 036 位密码子 TGC → TTC，引物由上海生工
生物技术有限公司合成，去离子水溶解，-20℃保存。
3 对引物序列如表 1 所示。
及 霍 利 迪 结 构 DNA［10-13］。 先 前 的 研 究 已 经 证 明
BLM 解旋酶的 RecQ 核心区域（642-1 290 氨基酸序
列）具有与全酶的相似活性［14］。
BLM 解旋酶的核心区域主要包括解旋酶结构
域，C-末端保守序列（RecQ-Ct）和解螺旋酶 RNA
酶 D C-末端结构域（HRDC）3 个结构域［15］。解旋
酶结构域主要是由 7 个保守的氨基酸基序（motif）
组成，其功能主要是间接或直接地结合 DNA 并诱导
催化水解而促使解旋酶的易位和解链［16-18］。RecQ-
Ct 结构域有一个平台型结构，其中心是由 4 个半胱
氨酸和一个 Zn2+ 离子组成的 α-螺旋结构，侧翼由螺
旋状的基序组成。RecQ-Ct 结构域的功能是 BLM 解
旋酶与 DNA 的结合位点并介导其与参与 DNA 代谢
的相关作用因子相互作用［17，19，20］。解旋酶结构域
和 RecQ-Ct 结构域结合在一起形成了具有催化作用
的解旋酶核心结构域，其包含有 ATP 酶活性和 DNA
结合活性的必须的基序和结合位点［20］。HRDC 结构
域位于解旋酶的 C-末端，通过辅助结合 DNA 来调
节解链功能，且可促进并稳定 BLM 解旋酶与 DNA
的结合，但不具有催化活性［20］。
BS 患者的 BLM 的 RecQ-Ct 结构域中的 1 036 位
半胱氨酸突变已经有报道，国际上已有研究报道单
个半胱氨酸的突变对 BLM 解旋酶的生物活性的影
响，但是多个位点同时突变的突变体活性研究尚无
报道［15，21］。RecQ-Ct 结构域单点突变的研究表明
了突变对酶活性有影响，但对 ATPase 和解链活性
的影响有区别，其结果显示，RecQ-Ct 结构域对解
旋酶结构域的活性有调节作用，但具体机制还不清
楚［15，20］。本研究通过在 BLM 解旋酶结构域 985 位
和 RecQ-Ct 结构域 1 036 位氨基酸残基位点同时引
入突变，构建双突变的重组大肠杆菌，运用 IPTG 诱
导其表达，在体外分离纯化双突变型 BLM 解旋酶，
并对其进行 Western blotting 鉴定，旨在为进一步研
究 BS 的致病机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
BLM642-1290 重组大肠杆菌 BL21 菌株由法国巴黎
第十一大学居里研究所的奚绪光主任研究员馈赠 ；
质粒回收试剂盒、DNA 快速胶回收试剂盒购自北京
表 1 重组 PCR 引物序列
名称 PCR 引物序列（5-3）
F GGAATTCATATGGAGCGTTTCCAAAGTCTTAGTTTTCCT
R CCGCTCGAGTTACGATGTCCATTCAGAGTATTTCTGTAA
F1 GCTGGAAGAGATGGGGGAATATCTCACTGCCTG
R1 CAGGCAGTGAGATATTCCCCCATCTCTTCCAGC
F2 GAAAATATAACGGAATTCAGGAGAATACAGCTT
R2 AAGCTGTATTCTCCTGAATTCCGTTATATTTTC
1.2.2 PCR 重组构建突变基因
1.2.2.1 985 位突变基因的构建 提取 BLM642-1290 重
组大肠杆菌 BL21 菌株质粒，以提取的质粒为模板，
以 F、R1 为引物 Pfu 高保真酶扩增上游片段 P1，反
应条件为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 40 s，56℃
退火 30 s，72℃延伸 60 s，30 个循环 ；72℃延伸 7
min。以 F1、R 为引物 Pfu 高保真酶扩增下游片段
P2，反应条件为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 40 s，
56℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，30 个循环 ；72℃延
伸 7 min。
胶回收上下游片段 P1 、P2，P1 、P2 以 1 1 比
例混合 Pfu 高保真酶扩增重组基因，反应条件为 ：
94℃预变性 5 min ；94℃变性 40 s，59℃退火 30 s，
72℃延伸 40 s，10 个循环；72℃延伸 7 min。反应完毕，
加入引物 F、R，94℃预变性 5 min ；94℃变性 40 s，
56℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，30 个循环 ；72℃延
伸 7 min，扩增产物命名为 T1，胶回收 T1。
2013年第1期 125张金彪等 ：Bloom 解旋酶突变体的克隆与表达
1.2.2.2 双突变基因的构建 以 T1 为模板，以 F、
R2 为引物 Pfu 高保真酶扩增上游片段 P3，反应条件
为：94℃预变性 5 min；94℃变性 40 s，56℃退火 30 s，
72℃延伸 60 s，30 个循环 ；72℃延伸 7 min。以 F2、
R 为引物 Pfu 高保真酶扩增下游片段 P4，反应条件
为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 40 s，56℃退火 30
s，72℃延伸 60 s，30 个循环 ；72℃延伸 7 min。
胶回收上下游片段 P3、P4 和 P3、P4 以 1∶1 比
例混合 Taq 酶扩增重组基因，反应条件为 ：94℃预
变性 5 min ；94℃变性 40 s，60℃退火 30 s，72℃延
伸 40 s，10 个循环 ；72℃延伸 7 min。反应完毕，加
入引物 F、R，94℃预变性 5 min ；94℃变性 40 s，
56℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，30 个循环 ；72℃延
伸 7 min，扩增产物命名为 T2，胶回收 T2。
1.2.3 突变基因的克隆 将回收的 T2 与 pMD
®19-T
Vector 按试剂盒说明书反应，构建重组质粒。构建
好的重组质粒转化感受态 Top10 菌株，筛选阳性克
隆。挑取阳性克隆菌落扩培提取质粒测序。
1.2.4 突变表达载体 pET-28a-BLM642-1290 的构建及
菌株的保存 测序鉴定正确的突变体 T 克隆菌株接
入液体培养基中培养，12 h 后提取质粒，Xho Ⅰ、
EcoR Ⅰ限制性内切酶双酶切，凝胶电泳，回收 2000
bp DNA 产物 ；双酶切 pET-28a 空载体，胶回收酶
切产物。按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明切胶回收
目的片段，将回收的 pET-28a 与突变 BLM642-1290 突
变基因进行定向连接，连接产物重组表达质粒 pET-
28a-BLM642-1290 转化感受态细胞 E. coli BL21（DE3+）。
扩培菌体提取质粒，采用限制性内切酶 Xho I、EcoR
I 对提取的重组质粒进行酶切鉴定，酶切体系同
pET-28a 质粒的酶切体系，酶切产物用 1% 琼脂糖凝
胶电泳鉴定，同时以提取质粒为模板，F、R 为引物
进行 PCR 鉴定。
1.2.5 重组蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴
定 将重组大肠杆菌按 1 1 000 接种于 2 mL 含氨苄
青霉素（Amp）的 LB 液体培养基，37℃培养过夜，
次日以 1∶100 转接入含 100 μL/mL Amp 的 LB 中，
37℃振摇至 OD600 为 0.6 时，加入异丙基硫代 -β-D-
半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为 1 mmol/L，18℃继
续培养 18 h 后，离心收菌，加入上样缓冲液，沸
水浴 5 min，离心 1 min，上清用于 SDS-PAGE 检测
蛋白表达情况。分离胶浓度为 10%，浓缩胶为 5%，
120 V 电泳约 2 h，考马斯亮蓝染色。Western blotting
检测融合蛋白的免疫原性，以 1 2 000 稀释 His-tag
一抗，1 2 500 稀释的标记辣根过氧化物酶的抗羊血
清为二抗，化学发光试剂盒显色。
2 结果
2.1 PCR重组构建突变基因
运用 PCR 对 blm 基因进行重组构建，理论上第
一轮 PCR 上游片段 P1 为 1 032 bp，下游片段 P2 为
915 bp，重组后 T1 全长 1 947 bp ；第二轮重组 PCR
上游片段 P3 为 1 185 bp，下游片段 P4 为 762 bp，重
组后 T2 全长 1 947 bp。试验其结果见图 1 和图 2，
PCR 产物琼脂糖凝胶检测显示得到的目的条带大小
与理论值一致，由以上结果可知突变型的 blm 基因
构建成功。
2000
bp
1500
1000
750
500
250
M T1 P1 P2
M ：DNA Marker ；T1 ：重组片段 T1 ；P1 ：上游片段 ；P2 ：下游片段
图 1 第一轮 PCR 结果（重组片段 T1）
M ：DNA Marker ；T2 ：重组片段 T2 ；P3 ：上游片段 ；P4 ：下游片段
2000
bp
1500
1000
750
500
250
M T2 P4 P3
图 2 第二轮 PCR 结果（重组片段 T2）
2.2 测序结果在NCBI中的BLAST分析
对构建好的突变基因进行测序，并对序列进行
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期126
在线分析，利用 BLAST-N 程序在 GenBank 数据库中
进行相似性检索。结果（图 3）显示，与正常 BLM
基因序列对比，blm 基因 985 位密码子由 GAA（Glu）
突变为 GGA（Gly），1 036 位密码子 TGC（Cys）突
变为 TTC（Phe）。同时其他片段无随机突变发生，
结果显示突变基因构建成功。
图 3 Blast 在线比对结果
2.3 重组表达质粒酶切鉴定
提取重组大肠杆菌质粒，采用限制性内切酶
Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ对提取的重组质粒进行双酶切鉴定，
同时以提取质粒为模板，F、R 为引物进行 PCR 鉴定。
结果（图 4）显示，2 000 bp 左右均有目的基因片段。
2000
bp
1 M 2
M ：Marker SGM03 ；1 ：双酶切检测产物 ；2 ：PCR 检测产物
图 4 重组质粒鉴定结果
说明突变基因已经成功的连入表达质粒中。
2.4 重组蛋白的表达
融 合 蛋 白 的 大 小 约 72 kD， 纯 化 后 表 达 产 物
经 SDS-PAGE 后 转 移 至 PVDF 膜 上 进 行 Western
blotting，结果（图 5，图 6）显示，表达产物能被
94.0
66.2
45.0
33.0
26.0
21.0
1 2 M
kD
1 ：菌液 ；2 ：上清液 ；M ：蛋白质标准 Marker
图 5 纯化的重组 BLM642-1290 解旋酶的 10% SDS-PAGE 凝胶电泳图
His-tag 抗体识别，在约 72 kD 处显示明显的条带，
证明目的基因在载体中成功表达。
3 讨论
目前我们已经研究了野生型 BLM 解旋酶在体外
表达的生物学性质［22，23］。本研究通过重组 PCR 成
功构建了 BLM642-1290 解旋酶定点突变基因，并将其
克隆至原核表达载体中进行表达，经蛋白印记验证，
得到了目的蛋白。
临床发现，BLM 解旋酶核心区域的 7 个氨基酸
位点突变会引发 BS，5 个位于解旋酶活性中心结构
2013年第1期 127张金彪等 ：Bloom 解旋酶突变体的克隆与表达
1 2
1 ：菌液 ；2 ：上清液
图 6 重组 BLM642-1290 解旋酶 Western blotting 检测
域，两个位于 RecQ-Ct 结构域的半胱氨酸位点［24］。
这为研究 BLM 在 BS 中的作用提供了充分的证据，
但是其在细胞代谢中的具体机制尚不清楚。
通过体外构建定点突变基因，可以迅速获得突
变体研究所需的材料，分析分子机理。传统的体外
定点突变技术多采用寡核苷酸引物介导的突变法，
突变仅仅限于 5 端 ，PCR 技术的发展提供了体外定
点突变的新手段，可在 DNA 片段的任何位置定点突
变［25］。本试验在操作中，减少其他位点随机突变的
可能性，在第二次 PCR 扩增时采用纯化后的上下游
基因片段作为模板，优化复性与延伸温度。通过重
组 PCR 进行基因突变克隆，操作简便，只需进行常
规的 PCR 操作，引物无需磷酸化，成本低效率高，
能 100% 在希望突变的位点引入特定的突变。而且
本试验以第一次回收的 PCR 产物作为模板，在第一
个突变的基础上再次引入第二个突变，简化了试验
操作 ；理论上需要引入几个突变就可以通过几次重
组 PCR 来实现，只需采用常用的试验技术即可达到
试验目的。测序结果表明，在预定位置引入了定点
突变，因此设计是合理的。
4 结论
本试验利用 PCR 技术将 blm 基因第 985 位密码
子和 1 036 位密码子成功进行了定点突变，并得到
了纯度较高的双突变 BLM 解旋酶，为下一步的工作
将研究突变蛋白的生物活性奠定了基础，从而在蛋
白质水平上进一步阐明突变导致 BS 的发病机制以及
探讨 BLM 解旋酶结构和功能之间关系。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）