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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
收稿日期 ：2012-11-20
基金项目 ： 国家自然科学基金资助项目（81160063），广西自然科学基金资助项目（2011GXNSFA018268，KFJJ2010-43），广西教育厅科研
项目（201012MS058），广西中医药管理局项目（GZKZ 10-013）
作者简介 ：徐瑾，女，硕士研究生，研究方向 ：眼镜蛇毒 NGF 与肝纤维化蛋白质组学 ；E-mail ：576776818@qq.com
通讯作者 ：张学荣，男，教授，硕士生导师，研究方向 ：蛇毒药物应用，肝纤维化 ；E-mail ：zxrsv@sina.com
蛇毒神经生长因子干预 HSC-T6 细胞差异蛋白质分析
徐瑾1  张学荣1  胡仁统1  罗小玲2  陈缨1  林兴1   
廖明1  付娆1  付道滢1
（1. 广西医科大学医学科学实验中心，南宁 530021 ；2. 广西医科大学肿瘤医院，南宁 530021）
摘 要 : 旨在建立肝星状细胞（HSC-T6）双向凝胶电泳图谱，初步分析 NGF 对 HSC-T6 细胞蛋白质表达的影响。试验设立
空白对照组和 NGF（4、8 和 16 mg/L）处理组，分别作用于 HSC-T6 细胞，24 h 后提取细胞总蛋白 ；利用 2-DE 分离空白对照组和
NGF 处理组细胞总蛋白质后，经图像分析识别差异表达的蛋白点，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定差异蛋白质 ；生
物信息学对差异蛋白质点进行 GO 分类及信号传导通路分析。结果显示，比较分析空白对照组和 NGF 作用组的 2-DE 图谱，找到
差异蛋白质点 47 个，其中在 NGF 作用组表达上调 22 个，下调 25 个，差异蛋白质点的表达部分随着 NGF 浓度的增加呈递增性，
部分随着 NGF 浓度的增加呈递减性，对其中 18 个表达差异 1.8 倍以上的蛋白质点进行肽质量指纹图分析，鉴定出 13 个与细胞信
号传导、细胞增殖、氧化代谢有关的蛋白质。眼镜蛇毒 NGF 能改变 HSC-T6 细胞信号通路中相关蛋白质的差异表达，为在蛋白质
水平研究 NGF 抗肝纤维化机制提供理论依据。
关键词 : 眼镜蛇毒（NGF） 肝星状细胞（HSC-T6） 蛋白质组学 双向电泳技术 飞行时间串联质谱
Analysis for Differentially Expressed Proteins of HSC-T6 Cell
Affected by Nerve Growth Factor
Xu Jin1 Zhang Xuerong1 Hu Rentong1 Luo Xiaoling2 Chen Ying1 Lin Xing1
Liao Ming1 Fu Rao1 Fu Daoying1
（1. Medical Sciences Experimental Center of Guangxi Medical University，Nanning 530021 ；2. Cancer Hospital of Guangxi Medical
University，Nanning 530021）
Abstract:  It was to develop the 2-DE profiles of proteome from hepatic stellate cell and preliminarily analyze the affect of NGF on the
protein expression of HSC-T6 cell. We established groups of control and NGF （4、8、16 mg/L）, respectively, then acting on the HSC-T6. The
differential expression of proteins were analyzed by imaging analysis and MALDI-TOF-MS after the total protein was extracted from the blank
control group and NGF treated by 2-DE. The differential protein spots were classified with GO and analyzed with Signal transduction pathway.
Results showed that HSC-T6 cell proliferation is inhibited evidently. Forty-seven differentially expressed protein were found in the proteome
profile analysis of these two types of blank control group and NGF treated, among which 22 protein spots were up-regulated and 25 protein spots
were down-regulated in the HSC-T6 treated by NGF, part of the different expression of protein is increasing with increasing of NGF concentration
and part is decreasing with increasing of NGF concentration. Eighteen protein spots with the differential expressions more than 1.8 times were
analyzed by peptide mass fingerprint （PMF） and thirteen differentially expressed proteins were found to be related with cell signal transduction,
cell proliferation and oxidative stress. The cobra venom NGF can change the expression of the different protein expression of HSC-T6 cell in
signaling pathway, providing a theoretical basis for the antifibrotic mechanism of NGF at protein level.
Key words:  NGF HSC-T6 Proteomics 2-DE MALDI-TOF-MS
2013年第5期 131徐瑾等 ：蛇毒神经生长因子干预 HSC-T6 细胞差异蛋白质分析
肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理途径，其
发生发展过程中涉及到多种细胞、细胞因子及其信
号转导通路之间一系列复杂的变化，主要病理改变
是细胞外基质的过度合成与异常沉积。肝星状细
胞（HSC）是参与该过程的最重要细胞，HSC 的活
化、增殖是肝纤维化发生的中心环节，抑制 HSC 增
殖、诱导其凋亡是抗肝纤维化的重要策略［1］。近年
来，神经生长因子（NGF）诱导 HSC 凋亡现象的发
现［2］使其有望从神经系统疾病领域应用到肝纤维化
的治疗中。蛋白质组学（Proteomics）作为后基因时
代研究的一个重要内容，其理论和技术的发展完善
亦为肝纤维化的研究带来了新的思维方式和研究领
域。将这种高通量的研究策略引用到肝纤维化发生
过程中，能够在一个试验系统中同时研究多种蛋白
质的变化，有助于全面阐明肝纤维化发生发展过程
中各种蛋白质的变化情况［3］。本课题组前期研究发
现，NGF 对 HSC-T6 增殖具有抑制作用，并能够促
进其凋亡［4］。在此基础上，本试验运用双向凝胶电
泳（2-DE）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
（MALDI-TOF-MS）等技术对眼镜蛇毒神经生长因子
（NGF）干预大鼠肝星状细胞（HSC-T6）前后蛋白质
表达的差异，并分析部分差异蛋白的类型、功能以
及在信号传导通路的作用，进一步在蛋白水平上揭
示人类肝纤维化发生发展过程及 NGF 抗肝纤维化的
可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
眼镜蛇蛇毒 NGF 由广西医科大学蛇毒研究所
提供 ；大鼠 HSC-T6 购于湖南湘雅医学院 ；DMEM
高糖培养基购自 HYCLONE 公司，胎牛血清购自
GIBCO 公司 ；HSC-T6 细胞用含体积分数为 10% 胎
牛血清 +1% 双抗的 DMED 培养液，置 CO2 培养箱
（37℃、5% CO2）培养。双向电泳和质谱所用试剂
购自 Promega 公司，CHAPS、碘乙酰胺、硫脲、17
cm 固 相 pH 梯 度（IPG） 干 胶 条（pH3-10）、 固 相
pH 梯度胶条缓冲液（IPG buffer pH3-10）、两性电解
质（Pharmalyte，pH3-10）、 硝 酸 银、Nuclease Mix、
IPGphorTM 等电聚焦系统、Ettan DALT Six 垂直电泳
仪、高分辨的图像扫描仪和凝胶斑点采集仪（Picker）
购 于 Bio-Rad 公 司。 点 样 仪（Digester）、MALDI-
TOF-TOF 及图像分析软件 Image Master2-DE Elite 为
Amersham Pharmacia 公司产品。所有试剂用去离子
水配置。
1.2 方法
1.2.1 HSC-T6 细胞总蛋白的提取 取生长良好的
HSC-T6 细胞于 25 mL 培养瓶里进行培养，等到细
胞长满培养瓶的 70% 左右开始药物作用，试验设计
4 个组，空白对照组（只用培养基培养），而处理组
分 3 组，用 NGF 作用，低、中、高浓度分别为 4、8
和 16 mg/L。用 10% 胎牛血清的 DMED 培养基培养，
药物作用 24 h 后分别提取细胞总蛋白，同时每个组
做 3 次平行试验。把提取的细胞总蛋白用 3 kD 超滤
管进行超滤脱盐，然后用考马斯亮蓝法定量蛋白质
浓度，最后把蛋白质等量分装真空冻干机冻干备用。
1.2.2 双向凝胶电泳 使用 17 cm IPG 胶条（非线
性）进行等电聚焦电泳，应用胶内泡胀法进行加样，
蛋白上样量为 500 μg。采用低电压 50 V，12 h 主
动水化。等电聚焦步骤为 ：500 V 1 h、1 000 V 1 h、
10 000 V 5 h，待 17 cm 胶条等电聚焦总电压伏时达
到 60 000 V 时结束聚焦。将胶条取出，在平衡液中
进行平衡 ：第一步使用含有 1% DTT 的平衡液，15
min ；第二步用含 4% 碘乙酰胺的平衡液，15 min。
平衡后将胶条转移到 12% 的 SDS-PAGE 上，用 0.5%
低熔点琼脂糖封胶后进行第二向电泳，电泳条件为
每块胶恒定电流 10 mA，30 min 后将电流加大到 30
mA，待溴酚蓝指示带到达凝胶底部处结束电泳。
1.2.3 银 染 SDS-PAGE 凝 胶 使 用 固 定 液 固 定 30
min 或者过夜，敏化液敏化 30 min，用蒸馏水漂洗 3
次，每次 15 min，然后银染 20 min，倒掉银染液用
蒸馏水漂洗 2 次，每次 1 min，马上加入显色液晃动
直到看到明显的蛋白点，立刻用终止液进行终止反
应，并用蒸馏水保存。最后通过 GS-800 凝胶扫描仪
获得数字化图像，然后用 PD Quest7.3 软件进行分析。
1.2.4 差异蛋白点分析和质谱鉴定 将对照组和试
验组中 1.8 倍差异表达的蛋白质点从凝胶上切下来，
然后进行胶内酶解，酶解过夜进行萃取，并对萃取
液进用 Zip Tip 脱盐柱除盐，把所得多肽与基质 1∶1
混合，吸取 2 μL 混合液点在靶上，让靶点自然干燥
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期132
后装入质谱仪，MALDI-TOF/TOF-MS 检测，鉴定出
差异蛋白。此步骤由广西医科大学医学科学实验中
心蛋白组学协助完成。
1.2.5 生 物 信 息 学 分 析 将 双 向 电 泳 和 MALDI-
TOF/TOF-MS 筛选出来的的差异蛋白质汇总，应用
UNIPROT 数据库网站和 DAVID 数据分析软件，按
照其生物学功能及在机体内参与的生理学反应过程
将所有的差异蛋白进行 GO（Gene Ontology）分类
（http ：//www.geneontology.org/）。对差异蛋白质生物
学过程（Biological Process，BP）、亚细胞定位（Cellular
Component，CC）、 分 子 功 能（Molecular Function，
MF）和信号传导通路（Pathway）等分析。再结合聚
类分析等找到我们所研究生物系统相对对照组在亚
细胞定位、生物通路、分子功能和相互作用网络中
的变化趋势，找到与肝纤维化相关的生物学过程等。
1.2.6 统计学处理 数据统计分析由 STATA 7.0 统
计分析软件（State Corp，College Station，TX，USA）
完成。
2 结果
2.1 细胞总蛋白SDS-PAGE电泳图
空白对照组及 NGF 干预各组在相同条件下作用
24 h 后分别提取组细胞总蛋白，并对细胞蛋白进行
SDS-PAGE 电泳，用扫描仪进行扫描分析，从图 1
中可发现细胞总蛋白的条带清晰，分子量大小不一，
NGF 干预个组与空白对照组并无明显的差异。
立一个参考胶进行自动性的粗略匹配，每一个个体
胶蛋白点与参考胶进行手工匹配和比对。在对照组
细胞蛋白双向电泳图谱上可观察到 668 个蛋白点，
而试验组中的低浓度组可见到 647 个蛋白点、中浓
度 640 个点、高浓度 645 个点。以对照组为标准，3
个试验组图谱分别与对照组的匹配率依次为 96.8%、
95.8% 和 96.5%，其中在低浓度组中箭头标注并有
蛋白质 ID 号的蛋白质点为 NGF 干预之后质谱鉴定
结果差异表达的蛋白质，只有箭头标注的为双向电
泳图谱有差异而在质谱鉴定并没有确定的蛋白质点
（图 2）。
170
kD
M A B C D
130
100
70
55
35
25
10
图 1 细胞蛋白 SDS-PAGE 电泳图
A ：空白对照组 ；B ：NGF 低浓度组 ；C ：NGF 中浓度组 ；D ：NGF 高浓度组
2.2 双向电泳
对 4 组细胞总蛋白进行双向电泳，利用图像分
析软件对蛋白图谱进行分析比较。首先以对照组建
P18418
P13084
P04652
Q9Z0V6
P04797
P17246
P30121
P51589
P31044
Q3T1J1
P07632
P24368
Q05982
IP3
A
IP10 IP3
B
IP10
IP3
C
IP10 IP3
D
IP10
A ：对照组 ；B ：NGF 低浓度组 ；C ：NGF 中浓度组 ；D ：NGF 高浓度组
图 2 双向电泳图
2.3 差异蛋白质点的质谱分析
在 4 组试验中，试验组和对照组细胞中表达量
相差 1.8 倍以上的蛋白点共 16 个，通过胶内原位酶
解进行 PMF 的测定，经一级质谱和二级质谱获得
的 13 张 PMF 图谱，利用 PEPTIDEM 查询软件搜索
MASCOT 数据库得到 13 个蛋白质，在 NGF 作用后
的肝星状细胞中表达上调的蛋白 6 个（表 1），表达
2013年第5期 133徐瑾等 ：蛇毒神经生长因子干预 HSC-T6 细胞差异蛋白质分析
下调的蛋白 7 个（表 2），结合双向电泳图发现部分
蛋质点的差异表达随着 NGF 浓度的增加而呈递增
性，部分随着 NGF 浓度的增加呈递减性，这些差异
蛋白质按其功能可分为细胞信号转导、细胞增殖、
细胞凋亡、氧化应激相关以及功能尚不清楚的蛋
白质。
表 1 NGF 作用肝星状细胞（HSC-T6）后表达上调的蛋白
数据库 ID 号 质谱得分 序列覆盖率（%） 分子量（D） 等电点（pI） 蛋白名称
Q05982 108 46 14799.7 4.97 核苷二磷酸激酶 A
Q3T1J1 58 48 16944.2 5.83 真核生物翻译起始因子
P24368 98 61 22802.4 9.42 肽脯氨酰顺反异构酶 B
P61589 90 52 21782.1 5.83 转化蛋白 RHOA
P04797 74 42 35894.0 8.24 甘油醛 -3-磷酸脱氢酶
P18418 1116 54 47995.5 4.33 钙网蛋白
表 2 NGF 作用肝星状细胞（HSC-T6）后表达下调的蛋白
数据库 ID 号 质谱得分 序列覆盖率（%） 分子量（D） 等电点（pI） 蛋白名称
P07632 84 50 17680.9 5.95 超氧化物歧化酶
P31044 93 53 20801.3 5.47 磷脂结合蛋白 1
P04692 78 47 32855.9 4.77 原肌球蛋白 α-1 链
Q9Z0V6 97 55 28321.4 7.14 过氧化物还原酶
P17246 68 45 44328.9 8.83 转化生长因子 TGF-β
P13084 139 49 32560.0 4.62 核苷酸磷酸酶
P30121 67 45 24356.2 7.46 金属蛋白酶组织抑制物
2.4 双向电泳与质谱鉴定出来的差异蛋白质生物
信息学分类分析
2.4.1 GO 分类 图 7 显示了质谱鉴定出来的蛋白
质 的 各 种 GO 分 类， 包 括 细 胞 功 能 定 位（Cellular
Component，CC）、 分 子 功 能 定 位（Molecular Func-
tion，MF）、生物学过程（Biological Process，BP）和
信号通路（Pathway）。结果发现，这些差异蛋白的
D
Hypertrophic cardiom-
yopathyHCM
TGF-beta signalimg pathway
Diated cardiomyopathy
Pathway
C
developmental process
cellular process
biological regulation
response to stimulus
deatin
cellular component biogenesis
immune system processBiological Process
B
identical protein binding
enzyme binding
endopeptidase inhibitor
activity
integrin binding
protein homodimerzation
activityMolecular Function
A
organelle
extrac ellular region part
macromolecular complex
extrac ellular region
organelle part
Cellular Component
主要定位以细胞器为主（图 3-A），分解代谢和酶类
蛋白相对较多（图 3-B），大部分蛋白参与生物发育、
细胞代谢和生物调节等过程（图 3-C）；在信号通路
上，部分蛋白主要参与肥厚型心肌病（HCM）通路、
TGF-β 信号转导通路和扩张型心肌病通路（图 3-D），
其中 TGF-β 信号转导通路是肝纤维化发生发展过程
中一个重要的信号传导通路。
A ：细胞功能定位分类 ；B ：分子功能定位分类 ；C ：生物学过程分类 ；D ：信号通路分类
图 3 差异蛋白质的 GO 分类和信号传导通路分类
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期134
2.4.2 TGF-β 信号传导通路分析 在所鉴定的差异
蛋白质中一部分是功能已知，有文献报道与肝纤维
化发生发展有明确关系的蛋白质。同时也有许多功
能未知的差异表达蛋白，这部分蛋白质是否与肝纤
维化发展相关是值得探究的问题，同时也是我们关
注的重点和进行后续验证和判断诊断价值的意义所
在。TGF-β 信号传导通路是肝纤维化发生发展研究
最多的一条信号传导通路，通过 TGF-β 信号传导
通路分析发现，转化生长因子 TGF-β（transforming
growth factor）和转化蛋白 RHOA（Transforming protein
RHOA）在整个信号传导通路中具有串联其他蛋白
相互联系的作用，这两个蛋白的表达变化可能参与
DAN BMP
Growth factor
THBS1
LTBP1
TGfβDecorin
TGfβ RI
TGfβ RII
+p
+p
+p
+p
IFNy
TNFα
Chordin Noggin
BMPRI
BMPRII
Smad1/5/8
Smad6/7
Smad1/2
Rbx1
Cul1
Skp1
Smad2/3
Smad2/3
Smad4
Ubiquitin mediated
proteolysis
MAPK signaling
pathway
TAK1, MEKK1
DAXX/JNK
RhoA
PP2A p70S6K
ROCK1
-p
+p
+p
ActivinRI
ActivinRIIActivin
Lefty
FST
Nodal
NodalRI
NodalRII
Smad2/3
Smad2/3 Smad2/3
Smad4
Smad2/3
Smad4 DNA
DNA
Pitx2 Left-right axis determination
Mesoderm and endodem
Gonadal growth,
embryo differentiation,
placenta formation, etc
p300
SP1 DNA
p15
c-Myc
DNA
Apoptosis
Cell Cycle
G1 arrest
p107
Transcription factors,
co-activators,
and co-repressors
Angiogenesis,
extracellular matrix
neogenesis,
immumosuppression,
apoptosis induction
E2F4/5
DP1
O
O
O
O
Smad6/7
SARA
+u +u
Ras/MAPK
Smad1/5/8
Smad4
ERK
DNA DNA
Osteoblast differentiation,
neurogenesis,
ventral mesodenm specification
Id OO
图 4 TGF-β 信号传导通路图
肝纤维化的发生发展过程（图 4）。
3 讨论
神经生长因子（NGF）对神经系统疾病的治疗
作用已被公认，但在肝纤维化领域的研究还知之甚
少。近年来，NGF 诱导 HSC 凋亡为抗肝纤维化药物
的研发提供了一个新的靶点［2］，HSC 是肝纤维化形
成过程中合成细胞外基质的最重要细胞，抑制 HSC
增殖、诱导其凋亡是抗肝纤维化的关键。研究表明，
调节细胞因子活性是可行的和具有特异性的肝纤维
化治疗方法［5］，NGF 作为近年来发现的 HSC 凋亡
诱导剂［6］，已在肝纤维化的研究中引起重视。Trim
等［2］将 100 mg/L NGF 与 HSC 共同培养 24 h 后，发
现 HSC 凋亡数量显著增加，呈剂量依赖关系，指出
NGF 对体外培养活化的 HSC 凋亡有诱导作用，其作
用机制可能包括 NGF 及其低亲和力受体 p75 的作用。
本课题组前期研究将最适浓度的蛇毒神经生长因子
NGF（8 mg/L） 与 HSC-T6 共 同 培 养 24 h， 用 MTT
法检测发现，NGF 抑制 HSC-T6 增殖呈时间依赖性。
并且随着 NGF 浓度的增加呈剂量依赖性，流式细胞
术显示具有诱导其凋亡的作用［4］，这和 Trim 的结论
相符合。
肝纤维化中没有基因的异常，而是某些基因过
度表达或表达不足，对激活并过度表达的胶原基因
进行抑制或封闭，具有广阔的治疗前景［7］。NGF 诱
2013年第5期 135徐瑾等 ：蛇毒神经生长因子干预 HSC-T6 细胞差异蛋白质分析
导 HSC 凋亡现象的发现为抗肝纤维化药物的研发提
供了一个新的靶点。蛋白质组学作为后基因组时代
研究的一个重要内容，蛋白质是细胞、组织乃至生
物体发挥其功能的基本物质，因此，在蛋白组水平
上研究肝纤维化发生发展过程中蛋白质的变化对揭
示肝纤维化的发病机制以及预防和治疗肝纤维化具
有极其重要的现实意义。随着双向电泳和质谱技术
的发展，为在蛋白组学水平上研究蛋白质的表达提
供了科学而实用的工具以及思维方式。
本试验用不同浓度的 NGF 干预 HSC-T6 细胞，
通过双向电泳技术和时间飞行质谱技术发现一些蛋
白质在 NGF 作用 24 h 后表达上有了较明显的变化，
通过生物信息学分析发现这些差异蛋白主要参与细
胞信号传导、细胞增殖、细胞代谢和氧化应激等过
程。其中转化生长因子 TGF-β 和转化蛋白 RHOA 还
参与了 TGF-β 信号传导通路，并且在 TGF-β 信号
传导通路中起着关键性的作用。信号传导是指细胞
因子通过膜上受体引起细胞内的级联反应而发挥细
胞的生理功能的过程，在这个过程中，不同信号传
导通路通过各种串话互相影响、制约，共同调控各
种细胞行为和生理变化过程［8］。肝纤维化发生发展
是一个多细胞，多因素的复杂过程，近年来越来越
多的证据表明，信号传导通路在肝纤维化发展过程
起着极其重要的作用，并且信号转导通常并不是单
独进行的，而是存在于一个极为复杂的信号通路网
络中，彼此之间相互影响、相互调控［9］。而在肝纤
维化过程中 NGF 信号和 TGF-β1 信号越来越受到重
视，NGF 是最早发现的神经营养因子家族成员，它
具有维持交感神经和感觉神经的生存、影响中枢神
经元的生长、促进神经细胞的分化、决定轴突生长
等方面的生物学功能［10，11］。TGF-β1 超家族成员众
多，功能广泛，参与调控各种细胞生长与增殖、分
化与凋亡以及胞外基质重塑与迁移等，其中大部分
作用都是由 SMAD 蛋白介导的经典信号通路参与实
现的［12，13］。研究表明，NGF 信号与 TGF-β 信号之
间具有多种串话机制，例如，在牙髓细胞（dental
pulp cells）中，TGF-β 可以通过 MAPK 信号通路来
上调 NGF 的表达［14］；而 NGF 促进小神经胶质迁移
的过程受到 TGF-β 的调控［15］。肝纤维化的中心环
节是肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）的激
活［16］。活化的 HSC 可分泌基质金属蛋白酶（matrix
metatloproteinase，MMP）和金属蛋白酶组织抑制物
（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP），但是两
者的分泌量失衡，从而造成 I、Ⅲ型胶原为主的
ECM 成分大量合成和降解不足，进而在肝脏中大量
沉积，成为肝纤维化发生、发展的重要环节。转化
生长因子（TGF-β）是重要的促进肝纤维化的细胞
因子，主要通过 SMAD 蛋白信号通路，促进肝星状
细胞增殖和活化，其中 SMAD3 是 TGF-β/SMAD 信号
通路中的关键信号蛋白［17，18］。众多研究表明，阻断
TGF-β1 通路可有力地阻断肝纤维化［19，20］。但由于
TGF-β1 的多功能性，完全阻断则可能造成严重的副
作用［21］，为减小其可能附带的不良反应这一目标，
选择恰当的治疗靶标成了必须解决的问题。
本试验用眼镜蛇毒 NGF 作用 HSC-T6 细胞，发
现 TGF-β1 表达下调，这可能是 NGF 信号传导通路
与 TGF-β1 信号传导通路通过串话机制发挥作用，导
致 TGF-β1 信号传导通路通受到抑制。同时也发现
金属蛋白酶组织抑制物（TIMP-2）也随之表达下调，
TIMP-2 是抑制 ECM 合成的一个重要酶类，其表达
下调导致 ECM 的合成减少而分解加快，从而使肝
纤维化的发展得到缓解甚至逆转。在鉴定出的其他
差异蛋白质中多数为酶类，而酶主要参与细胞的代
谢、氧化分解过程，目前虽然没有太多的研究表明
这些酶直接参与肝纤维化。但是从肝纤维化的发生
发展过程提示我们，这些酶可能影响细胞的正常代
谢，使细胞的生长不能有效的维持从而导致细胞发
生凋亡甚至死亡，这也使得活化的肝纤维化细胞减
少，而减少活化的肝纤维化细胞恰好是逆转肝纤维
化的重要途径，在这些因素的共同作用下达到抗肝
纤维化的目的。
以上试验显示，眼镜蛇毒 NGF 可影响 HSC-T6
细胞蛋白的差异表达，提示 NGF 可能是通过参与
HSC 细胞信号传导通路并改变肝纤维化相关蛋白质
的差异表达来实现抗肝纤维化的目的。由于双向电
泳本身的局限性，使一些等电点和分子量相近的蛋
白不能有效的判定其差异表达，在影响信号传导通
路过程中应该找出更多与信号通路相关的蛋白表达
情况，并进行后续的验证，从而更加深入揭示肝纤
维化发生发展机制及为 NGF 抗肝纤维化预防和治疗
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期136
提供理论依据。
4 结论
眼镜蛇毒 NGF 能改变 HSC-T6 细胞信号通路中
相关蛋白质的差异表达，其作用的机理可能是通过
上调或者下调这些差异蛋白质来实现抑制 HSC-T6
细胞增殖、诱导 HSC-T6 细胞凋亡从而逆转肝纤维
化的发生发展，为在蛋白质水平研究 NGF 抗肝纤维
化机制提供理论依据。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）